周晛 艾靜文 崔鵬 阮巧玲 沈瑤杰 王森 李永軍 張文宏

活動性結(jié)核病一直是臨床診治的難點，臨床表現(xiàn)不典型及肺外結(jié)核感染都增加了診斷難度。由于結(jié)核分枝桿菌的微生物學特點，傳統(tǒng)的病原學檢查敏感度低且周期較長，不能滿足臨床對活動性結(jié)核病快速病原學診斷的迫切需求。二代測序(next-generation sequencing, NGS)技術(shù)作為新興的實驗室檢查手段已被報道用于諸多病原體的診斷，但在活動性結(jié)核病中仍缺乏臨床應用實例，診斷價值尚不明確。本研究為前瞻性隊列研究，以臨床懷疑活動性結(jié)核病患者為研究對象，旨在考察NGS技術(shù)在活動性結(jié)核病中的診斷效能，并研究其相對于傳統(tǒng)診斷手段、Xpert MTB/RIF在活動性結(jié)核病病原學診斷上的效能差異。

材料和方法

一、納入、排除標準及診斷依據(jù)

1. 入組標準：(1)年齡大于18歲；(2)臨床懷疑活動性結(jié)核病患者，包括：肺結(jié)核、結(jié)核性腦膜炎、結(jié)核性胸膜炎、結(jié)核性腹膜炎、骨關(guān)節(jié)結(jié)核、各部位的結(jié)核膿腫等，并具有相應的提示活動性結(jié)核病的臨床癥狀及體征；(3)送檢臨床標本至華山醫(yī)院二代測序平臺，且送檢標本符合NGS檢測要求，具體要求為：血液標本不少于1 ml，腦脊液、胸腔積液、腹腔積液、心包積液、痰標本、支氣管肺泡灌洗液、鼻咽分泌物、膿液不少于0.5 ml；(4)簽署知情同意書。本研究經(jīng)本院倫理委員會批準。

2. 排除標準：(1)標本送檢時患者主要診斷為除結(jié)核分枝桿菌外其他病原體感染或腫瘤、自身免疫性疾病等非感染性疾病；(2)送檢標本量不能滿足NGS檢測要求；(3)拒絕簽署知情同意書者。

3. 診斷依據(jù)：(1)確診活動性結(jié)核感染：上述送檢標本結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)陽性、病理診斷為結(jié)核感染、Xpert MTB/RIF檢測陽性及結(jié)核分枝桿菌核酸檢測陽性等4項中至少1項符合即可確診為活動性結(jié)核??；(2)臨床診斷為活動性結(jié)核?。号R床可疑為活動性結(jié)核病，排除其他病原體感染或腫瘤、自身免疫性疾病等非感染性疾病，且抗結(jié)核藥物治療有效；(3)排除活動性結(jié)核?。河衅渌≡瓕W依據(jù)或符合腫瘤、自身免疫性疾病等非感染性疾病診斷標準。

二、納入研究的對象及標本

選擇2017年3月1日至2017年9月1日期間來華山醫(yī)院就診的34例臨床懷疑為活動性結(jié)核病患者的標本進行NGS檢測。呼吸道標本4例，均為支氣管灌洗液；肺外標本30例，其中腦脊液18例，胸腔積液4例，膿液3例，腹腔積液、肝組織各2例，關(guān)節(jié)積液1例。除肝組織及關(guān)節(jié)積液標本未行Xpert MTB/RIF檢測外，余31例標本均進行了NGS檢測、Xpert MTB/RIF檢測、結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)或病理檢查。

三、設(shè)備與檢測方法

送檢標本均在BGISEQ-100平臺上行NGS，測序所得病原序列和病原數(shù)據(jù)庫進行比對得到最終結(jié)果。以檢測到結(jié)核分枝桿菌復合群唯一匹配序列為陽性，未檢測到唯一匹配序列為陰性。

四、統(tǒng)計學方法

采用Microsoft Office Excel 2016及SPSS 22.0軟件進行分析。計數(shù)資料采用“例數(shù)”和“率”表示，計算NGS在結(jié)核病診斷中的敏感度、特異度。配對樣本與其他診斷手段的比較采用McNemar檢驗，并計算一致度。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

一、隊列標本及診斷結(jié)果

在上述標本中，確診為活動性結(jié)核病患者9例，其中Xpert MTB/RIF 陽性6例，病理診斷4例，培養(yǎng)陽性3例，結(jié)核核酸PCR檢測陽性1例；臨床診斷為活動性結(jié)核病患者10例、非結(jié)核感染患者15例(圖1)。

圖1 34例隊列標本及診斷結(jié)果

二、NGS檢測結(jié)核分枝桿菌的敏感度及特異度

以傳統(tǒng)診斷手段為金標準，即在9例確診的活動性結(jié)核病患者中，NGS敏感度為66.7%(6/9)；以臨床最終診斷為金標準，即在9例確診患者和10例臨床診斷為活動性結(jié)核病患者中，NGS敏感度為57.9%(11/19)。在15例排除活動性結(jié)核感染患者中，NGS均未檢出結(jié)核序列，特異度為100.0%。

表1 以臨床診斷為金標準時，傳統(tǒng)方法、Xpert MTB/RIF與NGS檢測的敏感度及特異度

注敏感度=該方法檢出陽性例數(shù)/臨床診斷為活動性結(jié)核病例數(shù)×100%；特異度=該方法檢出陰性例數(shù)/排除活動性結(jié)核病例數(shù)×100%

三、NGS與傳統(tǒng)結(jié)核病診斷手段的比較(表2)

在34例NGS與傳統(tǒng)結(jié)核病診斷試驗同步進行檢測的標本中，結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)陽性和(或)病理診斷為結(jié)核感染者共有6例。NGS陽性而傳統(tǒng)手段陰性的標本有腦脊液5例，關(guān)節(jié)積液標本1例，肺泡灌洗液1例；傳統(tǒng)手段單陽性的標本為軟組織感染膿液和腦脊液各1例。以臨床診斷為金標準，NGS和傳統(tǒng)檢測手段兩者的敏感度分別為31.6%(6/19)和57.9%(11/19)，特異度均為100.0%(15/15)。兩者差異無統(tǒng)計學意義(McNemar檢驗，P=0.180)，一致度為73.5%。

四、NGS與Xpert MTB/RIF比較(表3)

在平行送檢Xpert MTB/RIF與NGS的31例標本中，Xpert MTB/RIF 陽性6例。Xpert MTB/RIF單陽性3例：腹腔積液、前臂膿液、腦脊液各1例；NGS單陽性5例：腦脊液4例和灌洗液1例。以臨床診斷為金標準，NGS和Xpert MTB/RIF兩者的敏感度分別為50.0%(8/16)與37.5%(6/16)，特異度均為100.0%(15/15)。兩者比較差異無統(tǒng)計學意義(McNemar檢驗，P=0.727)，一致度為74.2%。

表2 34例標本NGS與傳統(tǒng)結(jié)核檢測的結(jié)果比較(例)

表3 31例標本NGS與Xpert MTB/RIF檢測的結(jié)果比較(例)

討 論

NGS是一種高通量測序方法，可以對 DNA 或 RNA 樣本的堿基對進行快速測序。作為新興的分子診斷一員已經(jīng)被報道用于細菌[1-2]、真菌[3]、病毒[4]等多種感染性疾病的診斷，但目前僅為病例報告，缺乏高等級的循證醫(yī)學證據(jù)。本研究旨在通過前瞻性隊列研究的方式，首次評估NGS這一新技術(shù)用于結(jié)核病診斷的價值。

長久以來結(jié)核病的診斷一直依靠傳統(tǒng)的結(jié)核分枝桿菌抗酸染色涂片和培養(yǎng)技術(shù)。雖然培養(yǎng)仍然是結(jié)核病診斷的金標準，但這并不能滿足臨床快速診斷的需要。近年來出現(xiàn)了多種結(jié)核病新的診斷技術(shù)和方法，分子診斷技術(shù)是近幾年的重要突破，其代表即Xpert MTB/RIF檢測試劑盒。WHO強烈推薦Xpert MTB/RIF應用于成人、兒童疑似耐藥結(jié)核病，以及HIV感染與MTB雙重感染患者的初始檢測；并推薦用于疑似肺外結(jié)核患者的肺外標本，如腦脊液、淋巴結(jié)和其他組織等的檢測[5]；并且由于其特異度達到95%以上，可以作為結(jié)核病確診實驗。但是，無論是培養(yǎng)還是Xpert MTB/RIF，其敏感度、尤其是在肺外結(jié)核中仍然很低，所以在結(jié)核診斷試驗的評估中，仍需要以臨床診斷作為參考標準。因此，本研究在評估NGS對于結(jié)核病的診斷價值時，分別以確診患者和臨床診斷患者為標準，以減小偏倚。

本研究中，傳統(tǒng)診斷手段、Xpert MTB/RIF和NGS特異度均為100.0%，敏感度分別為31.6%、37.5%、57.9%。NGS在三者中最高，雖然差異無統(tǒng)計學意義，但考慮可能受樣本量所限。進一步分析發(fā)現(xiàn)，NGS陽性而傳統(tǒng)檢測手段或Xpert MTB/RIF陰性，而臨床診斷為活動性結(jié)核病的標本以腦脊液為主，但是培養(yǎng)和Xpert MTB/RIF檢測在結(jié)核性腦膜炎中的陽性率仍然較低[6]，提示NGS在結(jié)核性腦膜炎的診斷中可能存在優(yōu)勢。就檢測速度而言，Xpert MTB/RIF(為2 h)

在本研究中，檢出結(jié)核分枝桿菌復合群唯一比對序列即作為陽性判斷，但就原始NGS檢測數(shù)據(jù)，往往在檢出MTB的同時，也可以檢測到許多其他病原體的序列[3]。這是NGS相對于Xpert MTB/RIF等僅對MTB的針對性檢測在用于疑難感染檢測上的優(yōu)勢，但也給最終報告的解讀帶來了困難[8]。且MTB感染相對于其他病原體，樣本中的檢出序列數(shù)可能更低[3, 9]。這些問題有待于在更大規(guī)模的研究中得到解決。

根據(jù)本研究數(shù)據(jù)，筆者認為NGS能夠較為快速地檢測多類標本中的結(jié)核分枝桿菌復合群，且其敏感度及特異度與Xpert MTB/RIF相當，可以作為確診試驗用于活動性結(jié)核病的早期輔助診斷。

[1] Long Y, Zhang Y, Gong Y, et al. Diagnosis of Sepsis with Cell-free DNA by Next-Generation Sequencing Technology in ICU Patients. Arch Med Res,2016,47(5):365-371.

[2] Wilson MR, Naccache SN, Samayoa E, et al. Actionable diagnosis of neuroleptospirosis by next-generation sequencing. N Engl J Med,2014,370(25):2408-2417.

[3] Ai JW, Zhang HC, Cui P, et al. Dynamic and direct pathogen loads surveillance to monitor disease progression and therapeutic efficacy in central nervous system infection using a novel semi-quantitive sequencing platform. J Infect,2017, pii: S0163-4453(17)30353-5.

[4] Guan H, Shen A, Lv X, et al. Detection of virus in CSF from the cases with meningoencephalitis by next-generation sequencing. J Neurovirol,2016,22(2):240-245.

[5] World Health Organization. Automated real-time nucleic acid amplification technology for rapid and simultaneous detection of tuberculosis and rifampicin resistance: Xpert MTB/RIF assay for the diagnosis of pulmonary and extrapulmonary TB in adults and children. Policy update. Geneva: World Health Organization,2013.

[6] Wilkinson RJ, Rohlwink U, Misra UK, et al. Tuberculous meningitis. Nat Rev Neurol, 2017, 13(10):581-598.

[7] 王森，張文宏. 結(jié)核病診斷技術(shù)新進展. 微生物與感染,2016,11(3):188-192.

[8] 皮銳，柳清云，高謙. 耐藥結(jié)核分枝桿菌的適應性代價與補償性進化. 微生物與感染,2017,12(6):362-368.

[9] Khezri F, Gibson LE, Tefferi A. Xanthoma disseminatum: effective therapy with 2-chlorodeoxyadenosine in a case series. Arch Dermatol,2011,147(4):459-464.