周晛 艾靜文 崔鵬 阮巧玲 沈瑤杰 王森 李永軍 張文宏
活動性結(jié)核病一直是臨床診治的難點,臨床表現(xiàn)不典型及肺外結(jié)核感染都增加了診斷難度。由于結(jié)核分枝桿菌的微生物學特點,傳統(tǒng)的病原學檢查敏感度低且周期較長,不能滿足臨床對活動性結(jié)核病快速病原學診斷的迫切需求。二代測序(next-generation sequencing, NGS)技術(shù)作為新興的實驗室檢查手段已被報道用于諸多病原體的診斷,但在活動性結(jié)核病中仍缺乏臨床應用實例,診斷價值尚不明確。本研究為前瞻性隊列研究,以臨床懷疑活動性結(jié)核病患者為研究對象,旨在考察NGS技術(shù)在活動性結(jié)核病中的診斷效能,并研究其相對于傳統(tǒng)診斷手段、Xpert MTB/RIF在活動性結(jié)核病病原學診斷上的效能差異。
一、納入、排除標準及診斷依據(jù)
1. 入組標準:(1)年齡大于18歲;(2)臨床懷疑活動性結(jié)核病患者,包括:肺結(jié)核、結(jié)核性腦膜炎、結(jié)核性胸膜炎、結(jié)核性腹膜炎、骨關(guān)節(jié)結(jié)核、各部位的結(jié)核膿腫等,并具有相應的提示活動性結(jié)核病的臨床癥狀及體征;(3)送檢臨床標本至華山醫(yī)院二代測序平臺,且送檢標本符合NGS檢測要求,具體要求為:血液標本不少于1 ml,腦脊液、胸腔積液、腹腔積液、心包積液、痰標本、支氣管肺泡灌洗液、鼻咽分泌物、膿液不少于0.5 ml;(4)簽署知情同意書。本研究經(jīng)本院倫理委員會批準。
2. 排除標準:(1)標本送檢時患者主要診斷為除結(jié)核分枝桿菌外其他病原體感染或腫瘤、自身免疫性疾病等非感染性疾病;(2)送檢標本量不能滿足NGS檢測要求;(3)拒絕簽署知情同意書者。
3. 診斷依據(jù):(1)確診活動性結(jié)核感染:上述送檢標本結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)陽性、病理診斷為結(jié)核感染、Xpert MTB/RIF檢測陽性及結(jié)核分枝桿菌核酸檢測陽性等4項中至少1項符合即可確診為活動性結(jié)核??;(2)臨床診斷為活動性結(jié)核?。号R床可疑為活動性結(jié)核病,排除其他病原體感染或腫瘤、自身免疫性疾病等非感染性疾病,且抗結(jié)核藥物治療有效;(3)排除活動性結(jié)核?。河衅渌≡瓕W依據(jù)或符合腫瘤、自身免疫性疾病等非感染性疾病診斷標準。
二、納入研究的對象及標本
選擇2017年3月1日至2017年9月1日期間來華山醫(yī)院就診的34例臨床懷疑為活動性結(jié)核病患者的標本進行NGS檢測。呼吸道標本4例,均為支氣管灌洗液;肺外標本30例,其中腦脊液18例,胸腔積液4例,膿液3例,腹腔積液、肝組織各2例,關(guān)節(jié)積液1例。除肝組織及關(guān)節(jié)積液標本未行Xpert MTB/RIF檢測外,余31例標本均進行了NGS檢測、Xpert MTB/RIF檢測、結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)或病理檢查。
三、設(shè)備與檢測方法
送檢標本均在BGISEQ-100平臺上行NGS,測序所得病原序列和病原數(shù)據(jù)庫進行比對得到最終結(jié)果。以檢測到結(jié)核分枝桿菌復合群唯一匹配序列為陽性,未檢測到唯一匹配序列為陰性。
四、統(tǒng)計學方法
采用Microsoft Office Excel 2016及SPSS 22.0軟件進行分析。計數(shù)資料采用“例數(shù)”和“率”表示,計算NGS在結(jié)核病診斷中的敏感度、特異度。配對樣本與其他診斷手段的比較采用McNemar檢驗,并計算一致度。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
一、隊列標本及診斷結(jié)果
在上述標本中,確診為活動性結(jié)核病患者9例,其中Xpert MTB/RIF 陽性6例,病理診斷4例,培養(yǎng)陽性3例,結(jié)核核酸PCR檢測陽性1例;臨床診斷為活動性結(jié)核病患者10例、非結(jié)核感染患者15例(圖1)。
圖1 34例隊列標本及診斷結(jié)果
二、NGS檢測結(jié)核分枝桿菌的敏感度及特異度
以傳統(tǒng)診斷手段為金標準,即在9例確診的活動性結(jié)核病患者中,NGS敏感度為66.7%(6/9);以臨床最終診斷為金標準,即在9例確診患者和10例臨床診斷為活動性結(jié)核病患者中,NGS敏感度為57.9%(11/19)。在15例排除活動性結(jié)核感染患者中,NGS均未檢出結(jié)核序列,特異度為100.0%。
表1 以臨床診斷為金標準時,傳統(tǒng)方法、Xpert MTB/RIF與NGS檢測的敏感度及特異度
注敏感度=該方法檢出陽性例數(shù)/臨床診斷為活動性結(jié)核病例數(shù)×100%;特異度=該方法檢出陰性例數(shù)/排除活動性結(jié)核病例數(shù)×100%
三、NGS與傳統(tǒng)結(jié)核病診斷手段的比較(表2)
在34例NGS與傳統(tǒng)結(jié)核病診斷試驗同步進行檢測的標本中,結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)陽性和(或)病理診斷為結(jié)核感染者共有6例。NGS陽性而傳統(tǒng)手段陰性的標本有腦脊液5例,關(guān)節(jié)積液標本1例,肺泡灌洗液1例;傳統(tǒng)手段單陽性的標本為軟組織感染膿液和腦脊液各1例。以臨床診斷為金標準,NGS和傳統(tǒng)檢測手段兩者的敏感度分別為31.6%(6/19)和57.9%(11/19),特異度均為100.0%(15/15)。兩者差異無統(tǒng)計學意義(McNemar檢驗,P=0.180),一致度為73.5%。
四、NGS與Xpert MTB/RIF比較(表3)
在平行送檢Xpert MTB/RIF與NGS的31例標本中,Xpert MTB/RIF 陽性6例。Xpert MTB/RIF單陽性3例:腹腔積液、前臂膿液、腦脊液各1例;NGS單陽性5例:腦脊液4例和灌洗液1例。以臨床診斷為金標準,NGS和Xpert MTB/RIF兩者的敏感度分別為50.0%(8/16)與37.5%(6/16),特異度均為100.0%(15/15)。兩者比較差異無統(tǒng)計學意義(McNemar檢驗,P=0.727),一致度為74.2%。
表2 34例標本NGS與傳統(tǒng)結(jié)核檢測的結(jié)果比較(例)
表3 31例標本NGS與Xpert MTB/RIF檢測的結(jié)果比較(例)
NGS是一種高通量測序方法,可以對 DNA 或 RNA 樣本的堿基對進行快速測序。作為新興的分子診斷一員已經(jīng)被報道用于細菌[1-2]、真菌[3]、病毒[4]等多種感染性疾病的診斷,但目前僅為病例報告,缺乏高等級的循證醫(yī)學證據(jù)。本研究旨在通過前瞻性隊列研究的方式,首次評估NGS這一新技術(shù)用于結(jié)核病診斷的價值。
長久以來結(jié)核病的診斷一直依靠傳統(tǒng)的結(jié)核分枝桿菌抗酸染色涂片和培養(yǎng)技術(shù)。雖然培養(yǎng)仍然是結(jié)核病診斷的金標準,但這并不能滿足臨床快速診斷的需要。近年來出現(xiàn)了多種結(jié)核病新的診斷技術(shù)和方法,分子診斷技術(shù)是近幾年的重要突破,其代表即Xpert MTB/RIF檢測試劑盒。WHO強烈推薦Xpert MTB/RIF應用于成人、兒童疑似耐藥結(jié)核病,以及HIV感染與MTB雙重感染患者的初始檢測;并推薦用于疑似肺外結(jié)核患者的肺外標本,如腦脊液、淋巴結(jié)和其他組織等的檢測[5];并且由于其特異度達到95%以上,可以作為結(jié)核病確診實驗。但是,無論是培養(yǎng)還是Xpert MTB/RIF,其敏感度、尤其是在肺外結(jié)核中仍然很低,所以在結(jié)核診斷試驗的評估中,仍需要以臨床診斷作為參考標準。因此,本研究在評估NGS對于結(jié)核病的診斷價值時,分別以確診患者和臨床診斷患者為標準,以減小偏倚。
本研究中,傳統(tǒng)診斷手段、Xpert MTB/RIF和NGS特異度均為100.0%,敏感度分別為31.6%、37.5%、57.9%。NGS在三者中最高,雖然差異無統(tǒng)計學意義,但考慮可能受樣本量所限。進一步分析發(fā)現(xiàn),NGS陽性而傳統(tǒng)檢測手段或Xpert MTB/RIF陰性,而臨床診斷為活動性結(jié)核病的標本以腦脊液為主,但是培養(yǎng)和Xpert MTB/RIF檢測在結(jié)核性腦膜炎中的陽性率仍然較低[6],提示NGS在結(jié)核性腦膜炎的診斷中可能存在優(yōu)勢。就檢測速度而言,Xpert MTB/RIF(為2 h) 在本研究中,檢出結(jié)核分枝桿菌復合群唯一比對序列即作為陽性判斷,但就原始NGS檢測數(shù)據(jù),往往在檢出MTB的同時,也可以檢測到許多其他病原體的序列[3]。這是NGS相對于Xpert MTB/RIF等僅對MTB的針對性檢測在用于疑難感染檢測上的優(yōu)勢,但也給最終報告的解讀帶來了困難[8]。且MTB感染相對于其他病原體,樣本中的檢出序列數(shù)可能更低[3, 9]。這些問題有待于在更大規(guī)模的研究中得到解決。 根據(jù)本研究數(shù)據(jù),筆者認為NGS能夠較為快速地檢測多類標本中的結(jié)核分枝桿菌復合群,且其敏感度及特異度與Xpert MTB/RIF相當,可以作為確診試驗用于活動性結(jié)核病的早期輔助診斷。 [1] Long Y, Zhang Y, Gong Y, et al. Diagnosis of Sepsis with Cell-free DNA by Next-Generation Sequencing Technology in ICU Patients. Arch Med Res,2016,47(5):365-371. [2] Wilson MR, Naccache SN, Samayoa E, et al. Actionable diagnosis of neuroleptospirosis by next-generation sequencing. N Engl J Med,2014,370(25):2408-2417. [3] Ai JW, Zhang HC, Cui P, et al. Dynamic and direct pathogen loads surveillance to monitor disease progression and therapeutic efficacy in central nervous system infection using a novel semi-quantitive sequencing platform. J Infect,2017, pii: S0163-4453(17)30353-5. [4] Guan H, Shen A, Lv X, et al. Detection of virus in CSF from the cases with meningoencephalitis by next-generation sequencing. J Neurovirol,2016,22(2):240-245. [5] World Health Organization. Automated real-time nucleic acid amplification technology for rapid and simultaneous detection of tuberculosis and rifampicin resistance: Xpert MTB/RIF assay for the diagnosis of pulmonary and extrapulmonary TB in adults and children. Policy update. Geneva: World Health Organization,2013. [6] Wilkinson RJ, Rohlwink U, Misra UK, et al. Tuberculous meningitis. Nat Rev Neurol, 2017, 13(10):581-598. [7] 王森,張文宏. 結(jié)核病診斷技術(shù)新進展. 微生物與感染,2016,11(3):188-192. [8] 皮銳,柳清云,高謙. 耐藥結(jié)核分枝桿菌的適應性代價與補償性進化. 微生物與感染,2017,12(6):362-368. [9] Khezri F, Gibson LE, Tefferi A. Xanthoma disseminatum: effective therapy with 2-chlorodeoxyadenosine in a case series. Arch Dermatol,2011,147(4):459-464.