趙粉琴，袁愛倩，李娜娜，謝知慧，胡雁云，劉 凱甘肅中醫(yī)藥大學，甘肅 蘭州 730000

當歸和黃芪是補血益氣的常用中藥，以黃芪和當歸按照5∶1比例組方而成的當歸補血湯作為經(jīng)典方藥臨床用于補血養(yǎng)血，尤其針對卵巢功能衰退引起的月經(jīng)量過少甚至閉經(jīng)的患者，方中重用黃芪大補元氣，以資氣血生化之源，符合“有形之血生于無形之氣的理論”，又配伍當歸養(yǎng)血和營，使陽生陰長，氣旺血生。顆粒細胞是卵泡的營養(yǎng)細胞，在卵泡發(fā)育期間起重要促進作用。臨床屢用當歸補血湯顯著增加月經(jīng)量，改善卵巢功能，但機制尚不明確。因此，探討Smad4蛋白和細胞周期蛋白cyclin A在顆粒細胞增殖中的表達以及當歸黃芪超濾膜提取物的干預作用，為當歸補血湯的臨床應用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑 按照參考文獻［1］的方法制備當歸黃芪超濾膜提取物：生藥煎煮-粗濾-濃縮-微濾-超濾-濃縮-噴干，每克生藥含超濾膜提取物干燥粉0.141 g(甘肅省膜科學院提供，將當歸黃芪合劑1∶5水提液分離為10萬分子量濾過物)。

1.2 大鼠卵巢顆粒細胞的培養(yǎng)及鑒定 從甘肅中醫(yī)藥實驗動物中心購買3周齡雌性SD大鼠［實驗動物合格證號：SCXK(甘)2011-0012］適應性喂養(yǎng)2天，皮下注射孕馬血清促性腺激素(PMSG)40IU，48小時后頸椎脫臼法處死，取出卵巢在無血清DMEM/F12培養(yǎng)基中用1 mL空針針頭刺破卵泡，收集顆粒細胞，巴氏管輕輕吹打，200目不銹鋼細胞篩過濾。

卵泡雌激素受體(FSHR)表達鑒定細胞：取生長旺盛的第4天的細胞，用0.25%胰蛋白酶-0.02%乙二胺四乙酸(EDTA)消化，1 000 r/min離心8分鐘后棄上清收集細胞，制成2.5×104/mL的細胞懸液，種植于培養(yǎng)板，細胞融合達70%時取出玻片，4%甲醛固定，用磷酸鹽緩沖溶液(PBS)洗滌細胞2次。

細胞免疫組化染色：滴加一抗FSHR兔多克隆抗體(1∶200)40℃過夜，滴加 5 mL Annexin V-FITC標記二抗兔免疫球蛋白G(IgG)及4′，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)工作液，室溫避光孵育60分鐘；PBS清洗5 min×3次，熒光顯微鏡下觀察拍照。

1.3 大鼠卵巢顆粒細胞增殖率的M TS監(jiān)測 取生長旺盛的第4天的細胞，用0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA消化，1 000 r/min離心8分鐘后棄上清收集細胞。顯微鏡下計數(shù)后按2.5×104/mL的細胞懸液，每孔100 μL接種于96孔細胞培養(yǎng)板。DMEM/F12 培養(yǎng)基(含 10%胎牛血清)，37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中預培養(yǎng)24小時后見細胞貼壁，換液繼續(xù)培養(yǎng)。按不同藥物濃度處理細胞，每孔培養(yǎng)總體積100 μL，并設(shè)置相應的空白組。繼續(xù)培養(yǎng)24、48、72小時后，37℃水浴10分鐘，融化CellTiter96AQueous one solution reagent，在96孔板中，每孔加入20 μL CellTiter96AQueous one solution reagent，37℃，5%CO2環(huán)境培養(yǎng) 1～4 小時，490 nm處讀取吸光度數(shù)。以檢測細胞增殖情況。并按下列公式計算細胞增殖促進率：

增殖促進率(%)=(實驗組OD值-空白組OD值)/空白組OD值×100%

空白組加入等容量無血清培養(yǎng)基；實驗組加入不同劑量當歸黃芪超濾膜提取物0.75、0.375、0.1875 g/L，每孔總體積 100 μL，培養(yǎng) 24、48、72小時。每組設(shè)5個重復孔。

1.4 sm ad4和cycl i nA蛋白表達水平的W est ern bl ot檢測 加入各組培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，待各組細胞生長至融合度為90%時取出，細胞刮至瓶底一角，收集至預冷的EP管中，PBS清洗細胞3次，40℃，1 000 r/min離心10分鐘，棄上清，加入蛋白抑制劑的RIPA裂解液200μL，并反復吹打10次左右，冰上靜置30分鐘，再次離心12 000 r/min，40℃，取上清至EP管中(即為所需蛋白提取液)；蛋白變性后每孔上樣品20 μL，電泳，轉(zhuǎn)膜3小時，分別加入Smad4和cyclin A一抗370C水浴孵育1小時后40℃過夜，次日二抗37℃水浴孵育1小時，然后暗室中加入ECL發(fā)光液，X光膠片曝光30分鐘，掃描圖像并且分析結(jié)果，將目的蛋白與內(nèi)參β-actin條帶的光密度值作比較。

1.5 統(tǒng)計學方法 用SPSS 16.0統(tǒng)計學軟件進行分析，計量資料以(±s)表示，采用單因素方差分析，P＜O.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 顆粒細胞形態(tài)學 培養(yǎng)24小時后倒置顯微鏡白光下可見顆粒細胞形態(tài)不規(guī)則，呈多角形或梭形FSHR鑒定結(jié)果：熒光顯微鏡下通過間接免疫熒光標記的卵巢顆粒細胞的FSHR蛋白被染成綠色，見圖1。

圖1 顆粒細胞FSH R鑒定結(jié)果

2.2 當歸黃芪超濾膜提取物對卵巢顆粒細胞增殖的影響(M TS檢測) 當歸黃芪超濾膜提取物可促進顆粒細胞增殖，其增值與時間及藥物濃度相關(guān)，尤其在48小時增值最明顯，72小時后細胞增殖緩慢；尤以0.375 g/L當歸黃芪超濾膜提取物促進細胞增殖最顯著，其增殖率在24、48、72小時，光密度值與空白組同一時間點比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，見表1。

表1 M TS監(jiān)測當歸黃芪超濾膜提取物對卵巢顆粒細胞增殖的影響(±s)

表1 M TS監(jiān)測當歸黃芪超濾膜提取物對卵巢顆粒細胞增殖的影響(±s)

注：＊表示中藥2組與其他組比較，P＜0.05

組別 時間24 h 48 h 72 h空白組 0.191±0.291 0.234±0.241 0.206±0.551中藥1(0.750 g/L)組 0.191±0.129 0.222±0.434 0.214±0.245中藥2(0.375 g/L)組 0.252±0.441* 0.283±0.231* 0.271±0.326*中藥3(0.1875 g/L)組 0.172±0.306 0.219±0.221 0.191±0.443

2.3 sm ad4和cycl i nA蛋白表達水平(W est ern bl ot檢測) 選取最佳作用濃度和時間段，監(jiān)測顆粒細胞Smad4和Cyclin A蛋白表達。當歸黃芪超濾膜提取物各劑量組對大鼠卵巢顆粒細胞的促進作用在給藥48小時時Smad4和Cyclin A蛋白表達最高，中劑量明顯高于高劑量和低劑量，且優(yōu)于空白組，差異有統(tǒng)計學意義(P＜O.05)，見表2、圖 2。

表2 顆粒細胞Sm ad4和Cycl i n A蛋白灰度值表達的比較(±s)

表2 顆粒細胞Sm ad4和Cycl i n A蛋白灰度值表達的比較(±s)

注：＊表示中藥2組與其他組比較，P＜0.05

組別 Sm ad4 Cycl i n A空白組 0.199±0.002 0.234±0.004中藥 1(0.750 g/L)組 0.074±0.004 0.123±0.005中藥 2(0.375 g/L)組 0.238±0.005* 0.293±0.006*中藥 3(0.1875 g/L)組 0.091±0.008 0.219±0.007

圖2 顆粒細胞Sm ad4和Cycl i n A蛋白灰度表達

3 討論

顆粒細胞是用于研究卵巢細胞增殖、分化和細胞間相互作用及信號轉(zhuǎn)導通路分子機制的理想細胞模型。卵泡發(fā)育過程中顆粒細胞的增殖、分化對卵母細胞發(fā)育成熟起重要作用［2］。TGF-β信號通路對卵泡的發(fā)育、顆粒細胞增殖、分化有重要調(diào)控作用，其變化可影響內(nèi)分泌激素的作用，從而影響卵巢功能［3-4］。Smad4是介導TGF-β信號轉(zhuǎn)導的核心信號蛋白。細胞周期蛋白又稱細胞周期素(Cyclins)，是在細胞周期進程中發(fā)揮重要作用的一類特殊蛋白質(zhì)。細胞周期蛋白在調(diào)控細胞周期轉(zhuǎn)換過程中起重要作用［5］，其中細胞周期D1(cyclin D1)和細胞周期A(cyclin A)的首要功能主要是促進細胞增殖［6］。柳朝華等［7］研究顯示Cyclin促進顆粒細胞的增殖，并在不同生長階段卵泡顆粒細胞的周期進行中起正調(diào)節(jié)作用。

黃芪具有抗病毒、抗腫瘤、抗衰老、抗輻射、抗應激及抗氧化等作用［8-9］。關(guān)欣等［10］研究表明當歸黃芪超濾膜提取物對氧化損傷起保護作用的途徑可能與保護細胞線粒體、提高該細胞抗氧化酶活性、減少過氧化產(chǎn)物的產(chǎn)生、防止氧自由基的產(chǎn)生、促進細胞增殖修復有關(guān)。李應東等［11］研究表明當歸黃芪超濾膜提取物(當歸和黃芪熬制后提取物)具有促進心肌細胞增殖的作用。

本研究結(jié)果表明，與空白組同一時間點比較，0.375 g/L濃度的當歸黃芪超濾膜提取物在各時間段對大鼠卵巢顆粒細胞的增殖指數(shù)差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。同時研究結(jié)果表明顆粒細胞Smad4蛋白和Cyclin A蛋白表達明顯，而且顆粒細胞增殖越明顯，兩種蛋白越呈現(xiàn)高表達。

多條信號通路參與顆粒細胞甾體生成的調(diào)控及細胞的一系列生命過程。其中TGF-β1/Smad4信號表達途徑目前研究最多，本研究推測當歸黃芪超濾膜提取物可能通過增加卵泡顆粒細胞Smad4的合成和促進細胞周期蛋白的表達，以促進顆粒細胞增生，從而增加雌激素的合成以及增加卵泡微環(huán)境中促進卵母細胞生長和成熟的細胞因子。而當歸黃芪提取物是否通過黃芪保護細胞線粒體，同時當歸的補血養(yǎng)血作用協(xié)同抑制卵巢顆粒細胞的凋亡，這一作用機制有待于進一步研究證實。

卵巢內(nèi)足量的當歸黃芪能促進顆粒細胞正常增殖通道，即TGF-β1/Smad4/cyclin A通道，增強顆粒細胞中Smad4和cyclinA的表達，促進顆粒細胞增殖和卵泡發(fā)育，是恢復卵巢功能的主要原因之一。

［1］陳舜華.應用超濾膜精制中藥制劑的實驗研究［J］.凈水技術(shù)，2004，23(2):16-17.

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