柯莉娜,鄭 靜,張瑞娟,王 勤,石 艷

(廈門大學生命科學學院,福建廈門361102)

酪氨酸酶(EC 1.14.18.1,tyrosinase)又稱為多酚氧化酶,是一種含銅的金屬酶,廣泛存在于微生物、動植物和人體中[1]．它具有單酚酶活性和二酚酶活性,能將酪氨酸羥化,產(chǎn)生鄰位二羥基苯丙氨酸(L-DOPA),然后再將L-DOPA氧化成多巴醌,進一步生成一系列引起褐化的色素類物質(zhì)[2]．已有研究發(fā)現(xiàn)黑色素的生物合成由3種黑色素細胞特異酶催化:酪氨酸酶蛋白(TYR)、酪氨酸酶家族相關(guān)蛋白(TRP-1和TRP-2)[3-4]．酪氨酸酶的異常表達可直接或間接導致人類疾病,如惡性黑色素瘤、皮膚斑點[5]和白癜風．黑色素對于人體的皮膚保護和內(nèi)環(huán)境平衡是不可或缺的，適當?shù)纳a(chǎn)黑色素對皮膚的健康非常重要[6]．近期的研究表明,白癜風患者的腎上腺皮質(zhì)系統(tǒng)存在缺陷[7],需通過皮下注射來進行臨床治療．目前用于治療白癜風的藥物,絕大部分是從中草藥中提取出有效成分制成的中成藥,例如類黃酮、芹黃素和淫羊藿[8]等,通過化學合成得到的相關(guān)藥物很少．

咖啡酸又稱為3,4-二羥基肉桂酸,是一種天然存在的酚酸,屬于多羥基苯乙烯酸類化合物,廣泛存在于林產(chǎn)植物中,如山楂、沙棘和升麻等．最近,一些研究表明咖啡酸及其衍生物具有多種生物活性,包括抗腫瘤、抗炎、抗氧化[9]等．特別是咖啡酸酯類衍生物,如咖啡酸苯乙酯已經(jīng)引起了相當大的關(guān)注[10]．根據(jù)本課題組之前的研究,咖啡酸對蘑菇酪氨酸酶的單酚酶和二酚酶具有激活作用[11]．本研究合成了2種新型咖啡酸嗎啉胺衍生物咖啡酸-2-氨乙基嗎啉胺(C-1)和咖啡酸-N-氨丙基嗎啉胺(C-2),并通過質(zhì)譜(MS)、核磁共振(NMR)以及紅外光譜(IR)技術(shù)鑒定其結(jié)構(gòu),進而研究了C-1和C-2對蘑菇酪氨酸酶的激活效果和機制以及對黑色素合成代謝途徑的影響,以期為治療酪氨酸酶低表達引起的相關(guān)疾病提供理論依據(jù)．

1 材料與方法

1.1 材 料

蘑菇酪氨酸酶(后簡稱酪氨酸酶)購于Sigma公司(St. Louis,MO,USA),酶活力為6 680 U/mg;1-乙基-3-(3-二甲氨丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(EDC·HCl)、4-二甲氨基吡啶(DMAP)、L-DOPA購于Aldrich 公司(St. Louis,MO,USA);咖啡酸購于TCI公司(上海,中國);2-氨乙基嗎啉、N-氨丙基嗎啉、N-甲基嗎啉購于Sigma 公司(St.Louis,MO,USA);TYR抗體和α-促黑色素激素(α-MSH)抗體購于Abcom 公司(Cambridge,England);TRP-1抗體和內(nèi)參蛋白甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)抗體購于Proteintech公司 (Chicago,USA);TRP-2抗體購于Thermo Scientific公司(Waltham,MA,USA);羊抗鼠IgG和羊抗兔IgG購于生工生物工程有限公司(上海,中國);其他試劑均購于國藥集團化學試劑有限公司,分析純;使用的蒸餾水為去離子重蒸水．

1.2 儀 器

傅里葉IR儀(Nicolet iS5,Thermo Fisher公司);NMR儀(AVANCE-Ⅲ600 MHz,BRUKER公司);液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(LC-MS)儀(Waters 2767,Waters公司);熒光分光光度計(Cary Eclipse,Varian公司);多功能酶標儀(M-450,BIO-RAD公司);核酸蛋白分析儀(DU-800,Beckman公司)．

1.3 方 法

1.3.1 樣品制備

咖啡酸嗎啉胺的制備方法如下:咖啡酸溶于二氯甲烷中,加入等濃度的2-氨乙基嗎啉或N-氨丙基嗎啉,以EDC·HCl作為脫水劑,DMAP作為催化劑,再加入N-甲基嗎啉作為標準堿,于油浴中加熱攪拌反應6～7 h；反應結(jié)束后冷卻至室溫,旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去有機溶劑后得到黃色稠狀液體,再通過凝膠柱層析純化；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后得到黃色粉末,烘干,待用．

1.3.2 酪氨酸酶活力測定

按照文獻[11]的方法稍作修改:在磷酸鹽緩沖液(PBS,pH 6.8)中,以L-DOPA 為底物測定酪氨酸酶的活力．先加入0.1 mL含不同濃度的化合物于比色杯中,再加入2.8 mL在30 ℃恒溫水浴中預熱的底物溶液(含PBS和L-DOPA),然后加入0.1 mL酪氨酸酶水溶液,立刻充分混勻,在30 ℃恒溫條件下檢測波長475 nm處的吸光度隨時間的變化,從直線的斜率計算出酶的活力,產(chǎn)物的消光系數(shù)按3 700 L/(mol·cm)計算．

1.3.3 全波長掃描

采用酪氨酸酶二酚酶的測活體系[11],在含有0.5 mmol/LL-DOPA、1.33 μg/mL酪氨酸酶、0.05 mol/L PBS(pH 6.8)的反應體系中,采用DU-800型核酸蛋白分析儀,在200～800 nm光譜范圍內(nèi)，實時跟蹤不同濃度的樣品(C-1和C-2)作用下酪氨酸酶催化產(chǎn)物在相同時間后的變化,以及相同濃度的樣品作用下酪氨酸酶催化產(chǎn)物在不同時間后的變化．

1.3.4 熒光猝滅

采用Cary Eclipse熒光光度計測試酪氨酸酶內(nèi)源熒光強度的變化,激發(fā)光波長設(shè)定為280 nm,發(fā)射光夾縫寬度為10 nm,檢測波長范圍為300～450 nm．在2 mL酪氨酸酶的體系中加入不同濃度的激活劑后,對熒光強度進行掃描．每個濃度重復3次實驗．

熒光分子與猝滅劑間的猝滅速率都遵循Stern-Volmer曲線方程[12]:

F0/F=1+Kqτ0c(Q)=1+Ksvc(Q).

式中：F0和F分別是猝滅前、后的熒光強度,Kq是雙分子的動態(tài)猝滅速率常數(shù),τ0是不存在猝滅劑時的熒光生命周期(10-8s),c(Q)是熒光猝滅劑濃度,Ksv是Stern-Volmer曲線的猝滅速率常數(shù)．根據(jù)Stern-Volmer曲線方程,以F0/F對所加入的化合物終濃度c(Q)作圖,得到化合物對酪氨酸酶熒光的Stern-Volmer曲線,依此判斷其熒光猝滅機制．

1.3.5 化合物對酪氨酸酶的分子對接模擬

采用MOE軟件(CCG公司)進行蛋白質(zhì)-配體對接．在對接前,先將激活劑和酪氨酸酶的三維結(jié)構(gòu)能量最小化．分子對接的參數(shù)如下:Receptor和Site分別設(shè)置為Receptor Atoms和Dummy Atoms,Refinement設(shè)置為Forcefield;Retain的第一和第二得分都設(shè)置為10,第一次和第二次Rescoring都設(shè)置為London dG;MM/GBVI綁定自由能得分用于排名對接；其他參數(shù)使用軟件的默認設(shè)置．在對接構(gòu)象的過程中,選擇得分最高的位點進行對接,再根據(jù)所選模式分析酶蛋白分子與化合物綁定后的對接結(jié)果．

1.3.6 細胞毒理試驗

細胞毒理通過噻唑藍(MTT)試驗測定[13]．人體正常肝細胞LO2培養(yǎng)至密度為5×103/孔后,添加不同濃度的化合物與其孵育24和48 h；然后在每孔中加入10 μL MTT溶液(用PBS配制,終質(zhì)量濃度5 mg/mL),在37 ℃孵育4 h,棄上清液；每孔加入150 μL 二甲基亞砜(DMSO)并震蕩10 min,讓紫色甲瓚完全溶解；在570 nm下測定其吸光度．未加化合物處理時的吸光度作為細胞100%存活的標準．

1.3.7 細胞內(nèi)酪氨酸酶活力測定

人體黑色素瘤細胞M14內(nèi)酪氨酸酶活力的測定根據(jù)文獻[14]進行部分改進：收集細胞,1 500 r/min離心5 min后棄上清液,保留細胞沉淀；在細胞沉淀中加入0.01 mol/L含有1%(體積分數(shù))吐溫-100的PBS,然后懸浮細胞冷凍于-80 ℃；取出完全凍結(jié)的細胞,在室溫下自然融化，反復凍融2次后,12 000 r/min 離心15 min得到的上層清液即為酪氨酸酶液；在96孔板的各孔中加入10 μL不同濃度的化合物和10 μL細胞酪氨酸酶液,然后加入180 μL PBS配制的0.1% (質(zhì)量分數(shù))L-DOPA (pH 6.8)，在30 ℃下孵育30 min,于475 nm處測定其吸光度．

圖1 C-1和C-2的合成路徑與結(jié)構(gòu) Fig.1Synthetic processes and structures of compound C-1 and C-2

1.3.8 細胞內(nèi)蛋白表達量分析

采用不同質(zhì)量濃度(0,10,20,30,40 μg/mL)的化合物處理M14細胞,培養(yǎng)24 h后,經(jīng)0.25%(質(zhì)量分數(shù))胰蛋白酶消化,收集細胞；5 000 r/min離心取上清液,加入200 μL的RIPA(radio immunoprecipitation assay)裂解液,冰上裂解1 h；10 000 r/min離心取上清液,測定蛋白濃度,分裝,加入4×上樣緩沖液,100 ℃熱變性30 min；所得樣品進行十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(恒定電壓90 V,110 min)后轉(zhuǎn)膜(恒定電流300 mA,1 h),在4 ℃下孵育一抗過夜,用含1%(體積分數(shù))吐溫-20的Tris-鹽酸緩沖液洗滌3次后,室溫下孵育二抗1 h；再洗滌3次后顯影,分析相關(guān)蛋白的表達量．

2 結(jié)果與分析

2.1 咖啡酸嗎啉胺的合成路徑及結(jié)構(gòu)鑒定

咖啡酸嗎啉胺的合成路徑如圖1所示,純化后得到黃色粉末,進行結(jié)構(gòu)鑒定,結(jié)果如下：

2.2 化合物對酪氨酸酶的激活作用

(a)C-1和C-2作用下的酪氨酸酶活力測定;(b)和(c)分別為C-1和C-2的Lineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖,其中曲線0～4對應的 C-1濃度依次為0,0.125,0.250,0.375,0.500 mmol/L,C-2濃度依次為0,0.025,0.050,0.075,0.100 mmol/L．圖2 咖啡酸衍生物對酪氨酸酶的激活作用以及激活類型 Fig.2Activation activity of caffeic acid derivatives on tyrosinase activity and determination of the activation type of tyrosinase

從圖2(a)可以看出,C-1和C-2對酪氨酸酶均具有明顯的激活作用，其半激活質(zhì)量濃度(EC50)分別為0.06和0.12 mmol/L，由此可見,C-1對酪氨酸酶的激活效果約為C-2的2倍．由圖2(b)和(c)可知,Lineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖均為相交于第二象限的一組直線，直線縱軸截距和直線斜率隨著化合物濃度增大而減小,因此可以判斷C-1和C-2對酪氨酸酶的激活類型均屬于混合型激活．

(a)～(c)分別為體系中未加化合物、加入0.05 mmol/L C-1和C-2在連續(xù)時間內(nèi)L-DOPA氧化產(chǎn)物的累積光譜圖,其中 曲線0表示化合物在該波長范圍內(nèi)的光譜,曲線1～11分別代表加入酪氨酸酶0～10 min后的光譜．(d)和(e)分別為不同濃度的 C-1和C-2在相同時間(10 min)內(nèi)L-DOPA氧化產(chǎn)物的累積光譜圖,其中曲線0～6對應的C-1加入濃度依次為0,0.075, 0.150,0.225,0.300,0.375和0.450 mmol/L,C-2加入濃度依次為0,0.015,0.030,0.045,0.060,0.075和0.090 mmol/L．圖3 咖啡酸衍生物對酪氨酸酶催化氧化作用的全波長掃描分析 Fig.3Full wavelength scanning analysis of caffeic acid derivatives on tyrosinase catalytic oxidation

圖3(a)是L-DOPA在未加化合物的情況下,酪氨酸酶催化氧化作用不同時間后的紫外-可見光譜,475 nm處特征峰的累積量為0.41．由圖3(b)和(c)可以看出,在體系中添加C-1和C-2,10 min后產(chǎn)物累積量分別增加了78%和58%．由圖3(d)和(e)可以看出,隨著C-1和C-2濃度的增加,475 nm處的吸收峰也在不斷地增加．該結(jié)果進一步佐證了2種化合物對酪氨酸酶的激活作用．

2.3 化合物與酪氨酸酶的相互作用

從圖4(a)和(b)可以看出,酪氨酸酶的熒光強度隨著C-1和C-2濃度的增大而有規(guī)律地降低,且熒光發(fā)射波長出現(xiàn)略微紅移．以F0/F對C-1和C-2終濃度c(Q)作圖,得到化合物對酪氨酸酶熒光強度的Stern-Volmer曲線,如圖4(c)和(d)所示．通過計算可知,C-1和C-2的熒光猝滅速率常數(shù)Ksv分別為7.06×10-6和1.31×10-5L/mol；其動態(tài)猝滅速率常數(shù)Kq分別為706和13.1 L/(mol·s),均遠小于各類猝滅劑對生物大分子的最大Kq值2.0×1010L/(mol·s),說明C-1和C-2對酪氨酸酶的熒光猝滅均屬于動態(tài)猝滅機制．

(a)和(b)分別為C-1和C-2作用下酪氨酸酶的熒光譜圖，(a)中曲線0～10對應的C-1加入濃度依次為0,0.01,0.02,0.03, 0.04,0.05,0.06,0.07,0.08,0.09,0.10 μmol/L，(b)中曲線0～8對應的C-2加入濃度依次為 0,0.02,0.04,0.06, 0.08,0.10,0.12,0.14,0.16 μmol/L;(c)和(d)分別為不同濃度的C-1和C-2對酪氨酸酶熒光強度的Stern-Volmer曲線．圖4 不同濃度的咖啡酸衍生物對酪氨酸酶熒光強度的影響 Fig.4Impacts on changes of tyrosinase fluorescence by different concentrations of caffeic acid derivatives

通過分子對接模擬進一步探索了C-1、C-2與酪氨酸酶的對接模式以及酶催化部位，受體所暴露的差異性可通過與氨基酸殘基結(jié)合的強度顯示．從圖5的對接構(gòu)象可以看出,2種化合物均不能與酪氨酸酶的金屬銅離子相互作用,但可與活性中心的氨基酸殘基相互作用．如圖5(a)所示:C-1氨基上的自由氫可以與酪氨酸酶活性中心的Asn260殘基形成氫鍵,雜環(huán)供氧可以與Asn260和His244殘基形成氫鍵,這些結(jié)構(gòu)能夠改變蛋白質(zhì)的構(gòu)象;此外,C-1還能與活性中心的Val248、Val283、His61、His85、His263、His259、Phe90、Phe264和Glu256殘基相互作用．如圖5(b)所示:C-2氨基上的自由氫可以與酪氨酸酶活性中心的Asn260殘基形成氫鍵,雜環(huán)供氧可以與His61殘基形成氫鍵,這些結(jié)構(gòu)能夠改變蛋白質(zhì)的構(gòu)象;此外,C-2還能與活性中心的Val283、His94、His85、His263、His259、Phe264、Phe292、Phe90、Ala286、Arg268、Ser282、Thr84和Glu256殘基相互作用．

2.4 化合物對人正常肝細胞LO2的毒理試驗

通過MTT法檢測化合物對人體正常肝細胞LO2的影響．如圖6所示,LO2細胞在經(jīng)過不同質(zhì)量濃度 (5,10,20,40,60,80,100,120 μg/mL)的C1和C2處理24 h后,處理組與對照組之間并無明顯差異,而處理48 h后對LO2細胞的存活有一定促進作用,說明C-1和C-2無細胞毒性．

圖5 C-1(a)和C-2(b)與酪氨酸酶的氨基酸殘基之間的對接模型 Fig.5Binding modes of C-1(a) and C-2(b) with amino acid residues of tyrosinase

2.5 化合物對M14細胞內(nèi)酪氨酸酶的激活作用

由圖7可以看出,在濃度為0,0.1,0.2,0.3,0.4和0.5 mmol/L 的C-1和C-2的作用下,M14細胞內(nèi)酪氨酸酶活力增加,且激活作用呈現(xiàn)出濃度依賴性．相同濃度下,C-2對酪氨酸酶的激活效果比C-1好．

圖6 C-1(a)和C-2(b)對LO2細胞存活的影響 Fig.6Effects of C-1(a) and C-2(b) on LO2 cell viability

圖7 C-1和C-2對M14細胞內(nèi)酪氨酸酶活力的影響 Fig.7Effects of C-1 and C-2 on intracellular tyrosinase activity of M14 cells

2.6 化合物對黑色素合成蛋白表達量的影響

通過蛋白免疫印跡法檢測化合物對M14細胞中黑色素合成相關(guān)蛋白表達量的影響．由圖8可以看出,化合物C-1和C-2對TYR、TRP-1、TRP-2和α-MSH蛋白的表達量均起上調(diào)作用,而內(nèi)參GAPDH蛋白的表達量無明顯變化．

3 討 論

本研究中合成了2種新型的咖啡酸衍生物C-1和C-2,并分析發(fā)現(xiàn)其對酪氨酸酶具有較好的激活作用,激活類型均屬于混合型激活，其中C-1的激活效果更好,初步推測可能與碳鏈的長短有關(guān)．

圖8 C-1(a)和C-2(b)對M14細胞內(nèi)TYR、TRP-1、 TRP-2和α-MSH蛋白表達量的影響 Fig.8Effects of C-1(a) and C-2(b) on TYR,TRP-1, TRP-2 and α-MSH expression levels in M14 cells

熒光猝滅法經(jīng)常被用來研究配體與蛋白質(zhì)之間的相互作用．本研究結(jié)果顯示酪氨酸酶的熒光強度隨著C-1和C-2濃度的增大而降低,然而酪氨酸酶的熒光發(fā)射光譜并沒有隨著C-1和C-2濃度的增大而發(fā)生明顯的轉(zhuǎn)變,由此可知化合物與酪氨酸酶之間的相互作用只影響與酪氨酸酶的熒光基團緊密相連的微環(huán)境,而直接環(huán)境中的猝滅殘留物并沒有發(fā)生變化．C-1和C-2能夠使酪氨酸酶的最大熒光發(fā)射峰隨著濃度的增加而發(fā)生略微的紅移,對酪氨酸酶的熒光猝滅屬于動態(tài)猝滅機制．此外,隨著C-1和C-2濃度的增加,其對應的猝滅速率常數(shù)Ksv也增大．比較2種化合物的趨勢變化,酪氨酸酶與C-1之間呈現(xiàn)出更強的相互作用,而與C-2之間的相互作用較弱,這與酶活測定實驗的結(jié)果一致．

在分子對接的模擬中,C-1和C-2沒有直接綁定到酪氨酸酶活性中心的銅離子,而主要和酪氨酸酶的氨基酸殘基,如Asn260等形成氫鍵．這些結(jié)構(gòu)可能改變蛋白質(zhì)的構(gòu)象,從而影響酪氨酸酶活力．

在細胞水平上研究發(fā)現(xiàn)C-1和C-2對人體正常肝細胞LO2沒有毒害作用;此外,C-1和C-2還能增強人體黑色素瘤細胞M14內(nèi)的酪氨酸酶活力．通過蛋白免疫印跡進一步研究發(fā)現(xiàn),C-1和C-2對M14細胞內(nèi)的TYR、TRP-1、TRP-2和α-MSH幾個黑色素合成相關(guān)蛋白的表達量均起上調(diào)作用．因此,化合物可有效地提高細胞黑色素生成量．

綜上,本研究合成了2種新型的無毒化合物,具有改善細胞黑色素合成調(diào)控的功能,對應用于化妝品和制藥原料有潛在開發(fā)價值,且涉及到的咖啡酸衍生物合成及其對酪氨酸酶激活作用的研究方法,為治療酪氨酸酶低表達引起的相關(guān)疾病提供了理論依據(jù)．

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