張翔，陳雅慧，杜娟，張潔，殷松娜*

（延安大學(xué)醫(yī)學(xué)院1遺傳學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)教研室；2生理學(xué)教研室；3生物化學(xué)教研室；4解剖學(xué)教研室；延安716000）

關(guān)于RNA的修飾最早發(fā)現(xiàn)于tRNAs和rRNAs中[1,2]，迄今為止，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)有超過(guò)100種化學(xué)性質(zhì)不同的RNA修飾，其中大多數(shù)發(fā)現(xiàn)于不同生物體內(nèi)的tRNA和非編碼RNA[3]。其中，N6-甲基腺苷（m6A）甲基化修飾最早于20世紀(jì)70年代發(fā)現(xiàn)[4,5]，后續(xù)的研究證明，在不同的原核生物、真核生物和病毒的mRNA中均存在m6A的甲基化修飾[5-8]。m6A修飾是真核生物mRNA轉(zhuǎn)錄后修飾中最常見(jiàn)的一種（0.3%～0.5%）修飾方式，介導(dǎo)了超過(guò)80%的RNA堿基甲基化[9,10]。它是一種調(diào)節(jié)mRNA代謝和翻譯的修飾方式，在細(xì)胞分化、胚胎發(fā)育和壓力應(yīng)答等等多種生理功能中均有重要作用[11,12]。

1 m6A的分布

在真核生物中進(jìn)行的m6A的分析實(shí)驗(yàn)表明：在人類和小鼠胚胎干細(xì)胞中有數(shù)百個(gè)m6A位點(diǎn)具有高度保守性[13]，在酵母中其修飾基因的保守性更高。在酵母和人類中，m6A位點(diǎn)傾向富集于轉(zhuǎn)錄物的3’末端[11,12,14]，在各種哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的終止密碼子附近也有大量的m6A位點(diǎn)富集[13]，在mRNA的CDS區(qū)和長(zhǎng)的外顯子附近也多見(jiàn)m6A位點(diǎn)，而在起始密碼子附近卻少見(jiàn)。除此以外，在核糖體相關(guān)mRNA和microRNA靶位點(diǎn)及其鄰近區(qū)域中也發(fā)現(xiàn)有m6A的存在[15-17]。針對(duì)哺乳動(dòng)物中m6A位點(diǎn)的研究發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)哺乳動(dòng)物中的m6A位點(diǎn)存在共有序列：Rm6ACH（R = G或A，H = A，C或U），這與在METTL14、METTL3和 WTAP（分別為 GGAC，GGAC和GACU）的CLIP研究中觀察到的富集的結(jié)合基序相一致[18]。但是，截至目前為止，大家都認(rèn)為在體內(nèi)只有一小部分RACH位點(diǎn)可檢測(cè)到甲基化，而且認(rèn)為Rm6ACH序列不足以確定m6A的分布。正如對(duì)人類U6小核RNA（snRNA）上的m6A位點(diǎn)的研究所表明的，除了METTL14和METTL3以外，人類細(xì)胞至少還表達(dá)另外一種m6A甲基轉(zhuǎn)移酶，該位點(diǎn)的序列背景與RACH序列不匹配，并且該位點(diǎn)的甲基化不能被METTL3-METTL14的mRNA靶標(biāo)所覆蓋[19]。

2 m6A修飾酶和結(jié)合蛋白及其功能

m6A修飾是一種動(dòng)態(tài)可逆的修飾，在哺乳動(dòng)物mRNA中，m6A主要由METTL14和酵母IME4的直向同源物METTL3甲基轉(zhuǎn)移酶—“mRNA writer”產(chǎn)生，METTL3和METTL14可與調(diào)節(jié)亞單位WTAP結(jié)合形成200kDa甲基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合物[18,20]；YTH結(jié)構(gòu)域蛋白—“reader”則可結(jié)合m6A甲基化的mRNA；m6A可通過(guò)去甲基酶—“mRNA eraser”酶進(jìn)行酶促去除。

目前大多數(shù)已知的mRNA修飾酶在正常生長(zhǎng)期間均是核內(nèi)酶，這就決定了m6A修飾能夠從生命的最早階段開(kāi)始影響mRNA的生物發(fā)生，并且可以實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄控制回路與mRNA修飾狀態(tài)之間的耦聯(lián)。

2 .1 mRNA 讀碼器（mRNA writers）

在甲基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合物催化下，mRNA中的A堿基甲基化成m6A，其中甲基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合物包括METTL3（也稱為MT-A70，MTA或IME4），METTL14，WTAP（F1（2）d），VIRMA（KIAA1429/VIRILIZER）和RBM15（也稱為Spenito）[14,17,18,21-24]。在大多數(shù)真核生物中，核心m6A甲基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合物組分（METTL3，METTL14，WTAP和Vir）存在高度保守性，而在裂殖酵母、粟酒裂殖酵母以及線蟲(chóng)秀麗隱桿線蟲(chóng)中卻并未發(fā)現(xiàn)這幾種核心酶的存在。有研究證明了METTL3和METTL14可形成異源二聚體，二者協(xié)同催化m6A甲基化，而其單獨(dú)的催化活性則較低[18]。在小鼠胚胎干細(xì)胞系敲除METTL3或METTL14的研究顯示：其數(shù)千個(gè)位點(diǎn)上的mRNA甲基化減少高達(dá)99%[13,25]。而在HeLa細(xì)胞中敲減METTL4后，對(duì)其mRNA中大量的m6A并未檢測(cè)到有任何影響，但是，出現(xiàn)這種結(jié)果可能是該實(shí)驗(yàn)中所采用的的測(cè)定方法的有限的靈敏度所導(dǎo)致，而且該方法無(wú)法檢測(cè)到敲減METTL4后對(duì)mRNA亞群中的小亞群的修飾的改變[18]。對(duì)人類U6小核RNA（snRNA）上的m6A位點(diǎn)的研究表明，除了METTL14和METTL3以外，人類細(xì)胞至少還表達(dá)另外一種活性m6A甲基轉(zhuǎn)移酶，該位點(diǎn)的序列背景與RACH序列不匹配，并且該位點(diǎn)的甲基化不能被METTL3-METTL14的mRNA靶標(biāo)所覆蓋[19]。

2 .2 mRNA閱讀器（mRNA Readers）

m6A結(jié)合蛋白—YTH結(jié)構(gòu)域蛋白是mRNA上m6A閱讀器的標(biāo)志，它們對(duì)m6A甲基化的mRNA的親和力比未甲基化mRNA要高出10-50倍[26-28]。動(dòng)物有兩個(gè)YTH蛋白家族，一個(gè)家族在人類中包含兩個(gè)成員YTHDC1和YTHDC2，在果蠅中有一個(gè)YT521-B；另一個(gè)家族在人類中有3個(gè)成員（YTHDF1/2/3），在果蠅中有一個(gè)CG6422，而在植物中有更多的YTH蛋白（擬南芥中有13個(gè)），秀麗隱桿線蟲(chóng)中則沒(méi)有這些m6A結(jié)合蛋白[29]。有研究發(fā)現(xiàn)YTHDF2能夠通過(guò)促進(jìn)與衰變因子的共定位來(lái)增加m6A修飾的mRNA的轉(zhuǎn)換[30]，這種m6A的失穩(wěn)功能通過(guò)調(diào)節(jié)關(guān)鍵多能性因子在干細(xì)胞分化中發(fā)揮重要的生物學(xué)作用[25,31]。在不同的細(xì)胞中，單個(gè)YTH蛋白與m6A位點(diǎn)的不同亞群相互作用，它們對(duì)基因表達(dá)產(chǎn)生的影響也不盡相同，這表明，關(guān)于YTH的調(diào)節(jié)，還受到目前尚不了解的共同調(diào)節(jié)因子的控制[16, 32]。

2 .3 mRNA消碼器（mRNA Erasers）

FTO是發(fā)現(xiàn)的第一個(gè)涉及m6A修飾動(dòng)力學(xué)的哺乳動(dòng)物RNA去甲基化酶，也正是FTO的發(fā)現(xiàn)[33]，證明了m6A修飾是動(dòng)態(tài)可逆的。但最近的一篇報(bào)道表明，當(dāng)核苷酸序列中第一個(gè)與帽相鄰的核苷酸是腺苷時(shí)，F(xiàn)TO在體內(nèi)活性卻是致力于存在的甲基化，而催化這種m6A修飾的酶尚不清楚[34-36]，這也表明了FTO在m6A修飾過(guò)程中作用的復(fù)雜性。除了FTO以外，在哺乳動(dòng)物中，m6A還可以通過(guò)m6A RNA去甲基化酶ALKBH5恢復(fù)為腺苷。有研究發(fā)現(xiàn)，ALKBH5在小鼠的睪丸中高表達(dá)，是精子發(fā)生和小鼠生育所不可或缺的，發(fā)生ALKBH5缺陷的雄性小鼠的mRNA中m6A水平增高，使減數(shù)分裂中期階段的精母細(xì)胞凋亡受到影響進(jìn)而導(dǎo)致受精力受損[37]。但是在低等真核生物中是否存在去甲基化酶仍有待確定[34]。針對(duì)去甲基酶的序列或結(jié)構(gòu)偏好的分析可以解釋部分或全部所觀察到的m6A在各個(gè)RACH位點(diǎn)之間分布的特異性。

3 m6A在發(fā)育過(guò)程中的生物學(xué)功能及調(diào)節(jié)機(jī)制

3 .1 m6A在胚胎早期發(fā)育中的功能

有研究表明，m6A是擬南芥和小鼠生存所必需的一種表觀遺傳學(xué)修飾。Mettl3基因敲除的小鼠植入前胚胎干細(xì)胞和“幼稚”胚胎干細(xì)胞在mRNA中無(wú)m6A發(fā)生，它們無(wú)法充分終止其“幼稚”狀態(tài)，在胚胎植入后受到異常和限制性的譜系啟動(dòng)，導(dǎo)致早期胚胎死亡[25]；在擬南芥中，酵母和人類mRNA腺苷甲基化酶（MTA）的擬南芥直向同源物的失活則導(dǎo)致發(fā)育中的胚胎不能通過(guò)球形階段而死亡[38]。然而，最近的研究卻發(fā)現(xiàn)了YTHDF2缺陷型小鼠，該研究證明YTHDF2的缺失導(dǎo)致卵母細(xì)胞成熟過(guò)程中相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄物的量不可調(diào)節(jié)，導(dǎo)致特異性的YTHDF2缺陷型雌鼠不孕[39]。在哺乳動(dòng)物中，m6A可維持胚胎干細(xì)胞（ES）細(xì)胞分化，維持晝夜節(jié)律和劑量補(bǔ)償?shù)淖饔肹13,25,31,40-43]。在果蠅中，m6A缺失的果蠅雖能存活，但是不能飛行且生育力下降，還伴發(fā)有神經(jīng)、性別決定和劑量補(bǔ)償缺陷[17,21,44]。

3 .2 m6A在性別決定和劑量補(bǔ)償中的功能

在酵母、果蠅和哺乳動(dòng)物性發(fā)育的各個(gè)方面均有m6A的參與：m6A在酵母減數(shù)分裂中的作用、在果蠅中的性別決定和劑量補(bǔ)償作用、在哺乳動(dòng)物的劑量補(bǔ)償作用可能揭示了m6A在自然界中的性別決定機(jī)制進(jìn)化過(guò)程中的核心功能。

在哺乳動(dòng)物中，m6A通過(guò)增強(qiáng)X染色體失活的Xist功能來(lái)實(shí)現(xiàn)劑量補(bǔ)償作用。在果蠅中，m6A通過(guò)增強(qiáng)性別致死基因Sxl的剪接以實(shí)現(xiàn)Sxl表達(dá)的最大化來(lái)實(shí)現(xiàn)劑量補(bǔ)償作用：果蠅的Sxl mRNA前體中，m6A存在于編碼過(guò)早出現(xiàn)的終止密碼子的雄性特異性剪接外顯子兩側(cè)的內(nèi)含子中，這就使Sxl具有雌性表達(dá)特異性，由此來(lái)決定性別。為了在雌性中完全排除該外顯子，Sxl在m6A位點(diǎn)附近，結(jié)合在內(nèi)含子的任意一側(cè)，并需要YT521-B的協(xié)助來(lái)全面抑制外顯子保留，以實(shí)現(xiàn)Sxl最大程度的表達(dá)。除了其在性別決定中的作用以外，Sxl在劑量補(bǔ)償作用中也發(fā)揮功能：雄性中，Msl-2通過(guò)上調(diào)單X染色體的轉(zhuǎn)錄來(lái)中和雄性和雌性之間不同數(shù)量的X染色體；而雌性中存在的微量Msl-2可觸發(fā)劑量補(bǔ)償，因此，雌性中Sxl內(nèi)含子中的m6A通過(guò)增強(qiáng)剪接功能來(lái)確保有最大量的Sxl的表達(dá)，來(lái)抑制msl-2翻譯實(shí)現(xiàn)對(duì)異位劑量補(bǔ)償?shù)囊种芠17,21,40]。人類lncRNA Xist中的m6A能夠促進(jìn)異染色質(zhì)化以轉(zhuǎn)錄失活X染色體之一，從而發(fā)揮劑量補(bǔ)償作用，然而，lncRNA Xist中m6A驅(qū)動(dòng)這個(gè)X染色體染色質(zhì)的縮合的確切機(jī)制目前尚不清楚[40]。

秀麗隱桿線蟲(chóng)中的劑量補(bǔ)償機(jī)制不同于其他物種，在雌雄同體的秀麗隱桿線蟲(chóng)中，其2個(gè)X染色體的表達(dá)均下調(diào)約一半，這說(shuō)明秀麗隱桿線蟲(chóng)可能無(wú)需m6A來(lái)實(shí)現(xiàn)劑量補(bǔ)償作用。此外，m6A的缺失可以通過(guò)其他mRNA修飾來(lái)補(bǔ)償，可能是與秀麗隱桿線蟲(chóng)基因組中的反式剪接相關(guān)[45]。

3 .3 m6A在減數(shù)分裂中的功能

在釀酒酵母中，減數(shù)分裂需要通過(guò)對(duì)m6A的標(biāo)記轉(zhuǎn)錄物進(jìn)行翻譯來(lái)進(jìn)行正向選擇來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)翻譯過(guò)程的重構(gòu)[15]。在粟酒裂殖酵母中，YTH蛋白Mmi1在無(wú)m6A的情況下采用一種新的模式來(lái)結(jié)合RNA，然后Mmi1在營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)期間通過(guò)去除只在減數(shù)分裂轉(zhuǎn)錄物中存在的DSR元件而實(shí)現(xiàn)選擇性的去除減數(shù)分裂轉(zhuǎn)錄物[46,47]。有研究證明了m6A在小鼠減數(shù)分裂中的作用，而在果蠅中， fl(2)d和vir是調(diào)控性別致死基因Sxl的選擇性剪接所必需的。然而，m6A在內(nèi)含子對(duì)調(diào)控選擇性剪接中的功能仍然無(wú)法確定[17,21,42]。有研究證明，m6A在釀酒酵母中類似于有利于減數(shù)分裂轉(zhuǎn)錄物的翻譯來(lái)實(shí)現(xiàn)合子轉(zhuǎn)錄本的翻譯而實(shí)現(xiàn)母本-合子轉(zhuǎn)變。在斑馬魚中，受精后的母本-合子轉(zhuǎn)變（maternal-to-zygotic，MZT）過(guò)程中，合子去除母本的轉(zhuǎn)錄本，這一過(guò)程是通過(guò)m6A結(jié)合蛋白來(lái)標(biāo)記特異的母本轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行降解而實(shí)現(xiàn)對(duì)母本轉(zhuǎn)錄本的清除，在斑馬魚胚胎中去除YTHDF2，則會(huì)減緩m6A修飾的母本轉(zhuǎn)錄本的降解，并阻滯合子基因組的激活，胚胎無(wú)法實(shí)現(xiàn)母本-合子轉(zhuǎn)變，即引起斑馬魚幼蟲(chóng)的發(fā)育延遲[48]。

總之，m6A在增強(qiáng)選擇性剪接和刺激mRNA的核輸出以及翻譯中的作用提示了m6A從預(yù)設(shè)的調(diào)控中增強(qiáng)基因表達(dá)的廣泛功能。此外，m6A具有促進(jìn)m6A標(biāo)記的轉(zhuǎn)錄物的移除和平移沉默，以促進(jìn)發(fā)育轉(zhuǎn)變的功能，如在減數(shù)分裂開(kāi)始時(shí)的卵母細(xì)胞發(fā)育，在早期胚胎發(fā)生期間的母本-合子轉(zhuǎn)變過(guò)程中，以及從干細(xì)胞更新到分化開(kāi)始。

4 展望

在分子生物學(xué)的中心法則中，遺傳信息從DNA、RNA流向蛋白。RNA在其中兼具信息分子和調(diào)控分子雙重功能，RNA的轉(zhuǎn)錄后修飾為其功能的多樣化奠定了基礎(chǔ)。RNA表觀遺傳學(xué)由芝加哥大學(xué)華人科學(xué)家何川教授引領(lǐng)和發(fā)展的，2011年，mRNA m6A第一個(gè)去甲基化酶FTO的發(fā)現(xiàn)，證明了m6A修飾是動(dòng)態(tài)可逆的，開(kāi)啟了mRNA m6A研究的熱潮。在過(guò)去的5年里，關(guān)于mRNA修飾的范圍和功能的多樣性的理解發(fā)生了一場(chǎng)革命，m6A在定義全基因組mRNA修飾方面取得了根本性進(jìn)展。

m6A修飾是RNA中一種非常普遍的甲基化修飾方式，每條mRNA有3～5個(gè)殘基存在m6A修飾。針對(duì)m6A轉(zhuǎn)錄組研究的常用方法為m6A-seq，即通過(guò)m6A特異性抗體對(duì)細(xì)胞內(nèi)具有m6A修飾的RNA片段進(jìn)行免疫共沉淀，將富集下來(lái)的RNA片段進(jìn)行高通量測(cè)序，從而實(shí)現(xiàn)在全轉(zhuǎn)錄組范圍內(nèi)檢測(cè)m6A修飾。但是這種方法只能將m6A修飾定位在100～200nt的轉(zhuǎn)錄本區(qū)域中，無(wú)法實(shí)現(xiàn)對(duì)m6A在全轉(zhuǎn)錄組水平上的精確位置的定位。2015年6月，一種可以獲得單核苷酸分辨率m6A圖譜的新技術(shù)miCLIP方法誕生。此方法目前存在的問(wèn)題是，mRNA m6A修飾的潛在影響取決于其產(chǎn)生的分子結(jié)果，以及生成發(fā)生m6A修飾的轉(zhuǎn)錄物的百分比。例如，如果只有1%的轉(zhuǎn)錄物發(fā)生m6A修飾，那么導(dǎo)致加速mRNA降解的這個(gè)修飾則不太可能具有生物學(xué)效應(yīng)，而導(dǎo)致產(chǎn)生替代蛋白質(zhì)變體的修飾即使在非常低的水平，其功能仍可發(fā)揮。當(dāng)前對(duì)m6A的分析方法的局限是缺乏關(guān)于對(duì)m6A修飾程度的定量鑒定，使用來(lái)自不同生長(zhǎng)階段m6A pulldown中的特定序列的相對(duì)富集的變化能夠推斷m6A修飾的調(diào)節(jié)，但是被修飾的mRNA的絕對(duì)數(shù)量卻無(wú)從確定。目前雖然已經(jīng)開(kāi)發(fā)了一種可以在特定的mRNA位點(diǎn)對(duì)修飾的核苷進(jìn)行絕對(duì)定量的方法，但是這種技術(shù)尚無(wú)法在多位點(diǎn)進(jìn)行平行測(cè)量。未來(lái)我們需要更先進(jìn)的技術(shù)來(lái)解決現(xiàn)在暫時(shí)無(wú)法解決的問(wèn)題：m6A是如何選擇特定的mRNA的靶位點(diǎn)？該如何調(diào)控m6A標(biāo)記的位置？m6A是否采用共同轉(zhuǎn)錄的方式引入？未來(lái)的研究中該如何監(jiān)測(cè)m6A的動(dòng)態(tài)變化？