凌云，程婷，宋禮華

（1.績溪縣食品藥品監(jiān)督管理局，安徽 績溪 245300；2.安徽安科生物工程（集團(tuán)）股份有限公司，安徽合肥 230088）

鹽酸米托蒽醌（Mitoxantrone，DHAD）是一種具有蒽環(huán)結(jié)構(gòu)的廣譜抗腫瘤抗生素，通過其自身化學(xué)結(jié)構(gòu)的“嵌插”機(jī)制，可阻斷腫瘤細(xì)胞DNA的合成、轉(zhuǎn)錄，對多種臨床常見的腫瘤細(xì)胞有明確療效［1-3］。但該藥具有較明顯的骨髓抑制、心臟毒性及白細(xì)胞減少等不良反應(yīng)［4-5］。將抗腫瘤藥物制備成脂質(zhì)體，可改變藥物的分布性質(zhì)，從而實(shí)現(xiàn)對藥物動(dòng)力學(xué)的優(yōu)化，減少不良反應(yīng)［6］。在制備脂質(zhì)體時(shí)，通過添加聚乙二醇（PEG）磷脂，將高分子材料嵌插入脂質(zhì)體結(jié)構(gòu)從而改變脂質(zhì)體表面性質(zhì)，可顯著提高脂質(zhì)體的穩(wěn)定性，延長血循環(huán)時(shí)間提高藥物作用效果。隨著研究的不斷深入，PEG修飾技術(shù)與包封藥物的釋放性能之間的關(guān)系、是否會對釋藥造成負(fù)面影響，目前研究觀點(diǎn)仍未達(dá)成一致意見［7-8］。為探索PEG化修飾對脂質(zhì)體制劑細(xì)胞毒作用的影響，本課題制備了DHAD PEG化脂質(zhì)體（DHAD-PEG-L），以DHAD水溶液模擬常規(guī)DHAD制劑為參比、以人非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞為模型開展細(xì)胞藥效學(xué)試驗(yàn)，從而明確DHAD減毒增效的改造方向，以期提高藥物化療效果，減少不良反應(yīng)，提高患者生存質(zhì)量。

1 材料與方法

1.1 儀器 細(xì)胞培養(yǎng)箱（2123-TC，SHEL-LAB）；倒置顯微鏡（OLYMPUS）；光吸收讀板機(jī)（Molecular Devices）；超凈工作臺（蘇凈）；冷凍離心機(jī)（BECKMAN）；細(xì)胞培養(yǎng)瓶、96孔培養(yǎng)板（Costar）；Sephadex G-25葡聚糖凝膠柱（Pharmacia）；高效液相色譜（Waters）；紫外檢測儀（上海琪特）；Nano ZS粒度分析儀（Malvern）。

1.2 試劑 DHAD原料藥（湖北健源化工，純度＞99%）；PEG化空白脂質(zhì)體由安徽安科生物工程股份有限公司協(xié)助制備（成分規(guī)格：氫化磷脂8.8 g·L－1、PEG磷脂 2.95 g·L－1、膽固醇 2.95 g·L－1）；RPMI 1640培養(yǎng)基、小牛血清及胰蛋白酶（GiBco）；MTT（Solarbio）；L-谷氨酰胺、Triton100、丙酮酸鈉、二甲亞砜（DMSO）均購自國藥集團(tuán)有限公司（分析純）。

1.3 細(xì)胞 A549人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株（由安徽安科生物工程股份有限公司提供）。

1.4 方法

1.4.1 主動(dòng)載藥法制備脂質(zhì)體藥物 移取適量空白PEG化脂質(zhì)體至透析袋，置1 000倍體積的生理鹽水中透析10 h，置換PEG脂質(zhì)體外相液，并以1.0 mol·L－1NaOH溶液調(diào)節(jié)外相pH值至7.4附近。精密移取4.5 mL空白PEG脂質(zhì)體和0.5 mL DHAD溶液（10.0 g·L－1）至試管中混勻，60℃恒溫水浴孵育30 min，即得載藥PEG化脂質(zhì)體DHAD-PEG-L。

1.4.2 載藥脂質(zhì)體的理化表征 粒徑和Zeta電位：以適量生理鹽水對DHAD-PEG-L進(jìn)行稀釋后，使用粒度電位分析儀進(jìn)行測定，計(jì)算平均粒徑、電位和粒徑分布。包封率：使用Sephadex G-25葡聚糖凝膠柱洗脫脂質(zhì)體溶液，流動(dòng)相為生理鹽水，洗脫速度1.0 mL·min－1；收集脂質(zhì)體峰，以Triton-100溶解破壞脂質(zhì)體膜后使用HPLC以標(biāo)準(zhǔn)曲線法測定包封藥物的含量，參照以下公式計(jì)算包封率［9］。

1.4.3 細(xì)胞復(fù)蘇及培養(yǎng) A549細(xì)胞以37℃溫水融化復(fù)蘇，以1 000～2 000 r·min－1轉(zhuǎn)速離心3～5 min。小心吸去上清液，加入1.0 mL預(yù)熱的細(xì)胞培養(yǎng)液，將細(xì)胞吹散后轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶。補(bǔ)充 RPMI 1640培養(yǎng)基4.0 mL，并添加10%的小牛血清。置于培養(yǎng)箱中37℃常規(guī)培養(yǎng)（CO2濃度5%）。A549細(xì)胞消化傳代頻率為1次／周，換液間隔為3 d。

1.4.4 細(xì)胞增殖抑制試驗(yàn) 取對數(shù)生長期的A549細(xì)胞，用RPMI 1640培養(yǎng)基配制單細(xì)胞懸液（每毫升細(xì)胞個(gè)數(shù)1.0×105個(gè)），以每孔100.0μL接種于96孔板，37℃常規(guī)培養(yǎng)（CO2濃度5%）4 h。實(shí)驗(yàn)設(shè)3組：分別將DHAD-PEG-L、DHAD溶液和空白脂質(zhì)體稀釋成 250、25、2.5、0.25、0.025、0.002 5 mg·L－1共6個(gè)梯度濃度作為制劑測試組。其中，空白脂質(zhì)體的稀釋方法以4.5 mL空白PEG脂質(zhì)體加入0.5 mL生理鹽水溶液的混合物為原液，參照含藥組進(jìn)行同倍數(shù)稀釋。DHAD-PEG-L每孔加藥量為100.0μL，另設(shè)置空白對照組（加入生理鹽水與腫瘤細(xì)胞）和校零組（單純培養(yǎng)基）。繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，每孔加入5.0 g·L－1的MTT溶液20.0μL，震蕩混勻后繼續(xù)培養(yǎng)4 h后以2 000 r·min－1轉(zhuǎn)速離心10 min，棄上清液，每孔加入 DMSO 150.0μL，震蕩溶解結(jié)晶后以讀板機(jī)進(jìn)行光吸收掃描，設(shè)定波長490 nm，記錄數(shù)據(jù)并分析。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 半數(shù)抑制濃度IC50值的計(jì)算：每組吸光度A490nm均值依以下公式求算細(xì)胞抑制率，并使用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件計(jì)算IC50值。

DHAD-PEG-L、DHAD溶液和空白PEG脂質(zhì)體在不同濃度下對A549細(xì)胞抑制作用的結(jié)果，使用SPSS17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。以單因素方差分析法對腫瘤細(xì)胞抑制作用進(jìn)行組間比較，以P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 脂質(zhì)體的理化性質(zhì) 經(jīng)粒度電位分析儀檢測，本實(shí)驗(yàn)制備獲得的DHAD-PEG-L平均粒徑為（103.6±2.8）nm，平均Zeta電位為（－12.2±1.0）mV，粒徑分布 D10平均值為（38.2±1.1）nm，D50平均值為（79.6±2.5）nm，D90平均值為（160.7±3.1）nm。各批次DHAD-PEG-L的粒徑、粒徑分布和Zeta電位檢測結(jié)果如表1所示。

上述DHAD-PEG-L經(jīng)柱層析、表面活性劑破膜處理后通過HPLC進(jìn)行定量分析，計(jì)算獲得3批次DHAD-PEG-L的包封率分別為（95.2±2.4）%、（94.3±1.6）%和（95.8±1.8）%，平均包封率為（95.1±1.9）%。

表1 DHAD-PEG-L的粒徑參數(shù)及Zeta電位／x±s

2.2 IC50值 DHAD-PEG-L、DHAD溶液對 A549細(xì)胞作用48 h后的IC50值分別為（1.561±0.09）、（0.862±0.02）。

2.3 腫瘤細(xì)胞抑制作用的差異性 經(jīng)方差分析，各組的制劑類型因素和濃度因素有交互效應(yīng)（F＝13 770.736、P＜0.001），說明不同制劑對 A549細(xì)胞的抑制作用隨濃度變化而變化。三組制劑在不同濃度時(shí)細(xì)胞抑制率的組間比較采用單因素方差分析法，結(jié)果顯示DHAD-PEG-L組、DHAD溶液組各濃度的細(xì)胞抑制率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明兩種含藥制劑均能抑制 A549細(xì)胞增殖（FPEG＝26 754.289、PPEG＜0.001；FDHAD＝16 753.559、PDHAD＜0.001）；空白脂質(zhì)體組各濃度間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F空白脂質(zhì)體＝0.929、P空白脂質(zhì)體＝0.496），推斷空白脂質(zhì)體對A549細(xì)胞增殖沒有抑制作用。在相同濃度條件下，不同制劑組細(xì)胞抑制率的組間比較采用單因素方法分析后進(jìn)行兩兩比較，結(jié)果均差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。其中，當(dāng)藥物濃度范圍在0.002 5～0.25 mg·L－1時(shí)，DHAD-PEG-L的細(xì)胞抑制作用顯著強(qiáng)于DHAD溶液；當(dāng)濃度在2.5～250 mg·L－1時(shí)，DHAD-PEG-L的細(xì)胞抑制作用顯著弱于DHAD溶液。見表2。

表2 不同濃度的DHAD-PEG-L、DHAD溶液和空白脂質(zhì)體對A549細(xì)胞的抑制作用／x±s

圖1 兩種制劑對A549細(xì)胞增殖抑制作用的顯微成像圖（濃度0.25 mg·L－1）

通過顯微成像圖可以直觀看出，當(dāng)藥物濃度為0.25 mg·L－1時(shí)，經(jīng) DHAD-PEG-L作用的 A549細(xì)胞凋亡明顯，PEG修飾脂質(zhì)體的優(yōu)勢開始展現(xiàn)。見圖1。

3 討論

鑒于臨床上以DHAD治療人非小細(xì)胞肺癌應(yīng)用較為常見，本研究選擇A549細(xì)胞和MTT法開展細(xì)胞抑制實(shí)驗(yàn)研究，方法簡捷、可靠性高。值得注意的是，MTT法的常用掃描波段540～595 nm會與DHAD吸收波長范圍（500～700 nm）發(fā)生干擾，因此本研究選擇490 nm波長作為折中［10-11］，實(shí)驗(yàn)取得良好效果。

本研究表明，與高濃度藥物組（≥2.5 mg·L－1）相比較時(shí)，PEG脂質(zhì)體藥物并未體現(xiàn)藥效學(xué)優(yōu)勢，癌細(xì)胞的抑制作用反比常規(guī)制劑低，這可能與PEG脂質(zhì)體表面的毛線團(tuán)狀分子屏障有關(guān)，降低了腫瘤細(xì)胞與藥物的直接接觸和攝取。當(dāng)藥物濃度下降接近至常規(guī)用藥血藥濃度（≤0.25 mg·L－1）時(shí)，其細(xì)胞抑制作用開始優(yōu)于常規(guī)制劑，其機(jī)制可能與脂質(zhì)體包封高濃度藥物，使藥物局部濃度遠(yuǎn)高于普通溶液狀態(tài)有關(guān)［12］，當(dāng)載藥PEG脂質(zhì)體被細(xì)胞攝取或附著于表面進(jìn)行局部釋放時(shí)，可在腫瘤細(xì)胞局部形成高濃度作用區(qū)域，增強(qiáng)細(xì)胞抑制作用。這對于降低藥物的全身血藥濃度、實(shí)現(xiàn)靶向給藥從而減少或減輕患者的不良反應(yīng)有著重要意義。

脂質(zhì)體制劑經(jīng)PEG修飾后可獲得更長的血循環(huán)時(shí)間達(dá)到病灶［13］。本研究在理論上證實(shí)了注射相同劑量的PEG脂質(zhì)體藥物，相較于常規(guī)制劑，預(yù)期可使腫瘤部位獲得更高的藥物濃度，更好的抑制腫瘤生長，使患者耐受量增加，藥物毒副作用下降，減少不良反應(yīng)。然而，低濃度藥物組的PEG脂質(zhì)體對A549細(xì)胞總體抑制率不足10%，這表明在今后的研究中，應(yīng)當(dāng)加大載藥工藝和包封工藝的研究，并對細(xì)胞攝取機(jī)制進(jìn)一步探索，優(yōu)化脂質(zhì)體膜材料的成分組成和結(jié)構(gòu)，增強(qiáng)藥物在腫瘤細(xì)胞局部的毒性殺傷作用，從總體上優(yōu)化腫瘤的治療效果。

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