楊雪梅，顧以韌，梁 艷，陶 璇，楊躍奎，曾 凱，陳曉暉，鐘志君，呂學(xué)斌

（四川省畜牧科學(xué)研究院，動(dòng)物遺傳育種四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 610066）

miRNA是一類內(nèi)生的、長度約為20～22個(gè)核苷酸，通過結(jié)合到靶mRNA上參與基因轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控的非編碼小分子RNA，其在基因表達(dá)調(diào)控、脂肪細(xì)胞分化、脂質(zhì)代謝等生理過程中均發(fā)揮著重要的作用[1-3]。先前研究顯示miR-1可通過HDAC4作為靶基因促進(jìn)肌發(fā)生，對調(diào)節(jié)骨骼肌增殖與分化起了非常重要的作用[4]，它會(huì)與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，促進(jìn)心肌細(xì)胞膨脹，從而抑制心肌細(xì)胞的增殖；miR-369通過招募AGO2和FXR1蛋白復(fù)合體結(jié)合到腫瘤壞死抑制因子-α基因3′UTR區(qū)域的腺嘌呤/尿嘧啶富集元件上靶向調(diào)控TNF-α的表達(dá)[5]，TNF-α與豬肉品質(zhì)存在顯著相關(guān)。

鑒于這兩種miRNA與豬肉品質(zhì)調(diào)控存在的關(guān)系，研究采用Q-PCR技術(shù)對四川省4個(gè)地方豬種和約克夏背最長肌組織中miR-1和miR-369的表達(dá)與肉質(zhì)性狀的差異進(jìn)行了研究。該研究將為進(jìn)一步探明不同豬種肉質(zhì)差異形成的分子機(jī)制提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，并為培育優(yōu)質(zhì)高效的新品種/配套系提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物及樣本采集

該試驗(yàn)于2015年12月在四川省畜牧科學(xué)研究院種豬科研基地進(jìn)行。每個(gè)豬種隨機(jī)選取6頭，共計(jì)30頭，所有試驗(yàn)豬只于同一時(shí)間開始組建群體，30日齡斷奶，采用相同營養(yǎng)水平和飼喂方式，達(dá)到9月齡時(shí)進(jìn)行屠宰，屠宰前停食24 h，自由飲水。屠宰后迅速采集倒數(shù)3～4肋骨間對應(yīng)處的背最長肌組織，用于后續(xù)的肉質(zhì)相關(guān)表型指標(biāo)測定和miRNA熒光定量檢測。

1.2 肌內(nèi)脂肪含量（IMF）測定

采用瑞士步琪（BUCHI）全自動(dòng)快速抽提儀進(jìn)行抽提，程序設(shè)置為萃取2 h，淋洗5 min，干燥20 min，每個(gè)樣本獨(dú)立測定兩次。樣品處理和試驗(yàn)操作嚴(yán)格按照國標(biāo)GB/T 9695.1—2008《肉與肉制品游離脂肪含量測定》進(jìn)行。

1.3 肌纖維直徑測定

采用KD-2508型切片機(jī)（Kedee,China）制作背最長肌樣本的冰凍切片，H.E染色后用顯微成像系統(tǒng)（Optec,China）采集代表性區(qū)域圖像，通過Motic Images Advanced 3.2顯微圖像分析軟件測定每個(gè)樣品的肌纖維面積。

1.4 硫胺素含量測定

樣本處理和試驗(yàn)方法參照國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 5009.84—2003《食品中硫胺素（維生素 B1）的測定》。

1.5 眼肌面積和瘦肉率測定

測量左胴體倒數(shù)3～4肋眼肌的寬、高，按照寬×高×0.7計(jì)算眼肌面積。按豬胴體性狀測定技術(shù)規(guī)范（NY/T 825—2004）方法測定并計(jì)算瘦肉率。

1.6 miR-1和miR-369含量的測定

引物信息見表1。所有目的miRNA定量結(jié)果均通過溶解曲線分析驗(yàn)證PCR產(chǎn)物的特異性，確保產(chǎn)物無引物二聚體，每個(gè)樣本重復(fù)3次，每次檢測含3個(gè)陰性對照。采用2-ΔΔCt法計(jì)算目的miRNA的相對表達(dá)量。

表1 引物信息

1.7 統(tǒng)計(jì)方法

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Sigmaplot 12.0對性狀指標(biāo)和基因表達(dá)量進(jìn)行ANOVA分析，相關(guān)性采用Pearson Correlation程序分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 相關(guān)肉質(zhì)指標(biāo)含量

由表2可知，在5個(gè)豬種中，藏豬肌內(nèi)脂肪含量最高（5.62%），其次為雅南豬（5.09%），約克夏豬最低（2.06%），地方豬種極顯著高于外種豬（P＜0.01）。在4個(gè)地方豬種中，藏豬、雅南豬和內(nèi)江豬的肌內(nèi)脂肪含量極顯著高于成華豬（P＜0.01）；藏豬肌纖維直徑最?。?8.12 μm），顯著小于其它3個(gè)地方豬種（P＜0.05），約克夏肌纖維直徑最大（92.74 μm），極顯著大于 4個(gè)地方豬種（P＜0.01）；4個(gè)地方豬種的眼肌面積在14～22 cm2之間，藏豬和成華豬的眼肌面積顯著低于雅南豬、內(nèi)江豬（P＜0.05），約克夏豬的眼肌面積極顯著高于4個(gè)地方豬種（P＜0.01）；藏豬的瘦肉率最低（42.74%），約克夏豬的瘦肉率最高（63.54%），4個(gè)地方豬種瘦肉率之間差異不顯著，約克夏豬極顯著高于4個(gè)地方豬種（P＜0.01）；雅南豬的硫胺素含量最高，為 2.84 μg/g，其次是藏豬（2.18 μg/g），內(nèi)江豬硫胺素含量最低，為1.06 μg/g，其次為約克夏豬（1.21 μg/g），顯著低于其它3個(gè)豬種（P＜0.05），藏豬、成華豬和雅南豬無顯著差異。

表2 不同豬種相關(guān)肉質(zhì)指標(biāo)含量（n=6）

2.2 2種相關(guān)miRNA的表達(dá)水平

采用Q-PCR的方法，檢測了miR-369和miR-1在豬背最長肌中的相對表達(dá)量，其結(jié)果見表3。由表3可知，成華豬的miR-369的相對表達(dá)量最高，其次為雅南豬，最低的為內(nèi)江豬，內(nèi)江豬的miR-369的相對表達(dá)量極顯著低于其它4個(gè)豬種（P＜0.01），約克夏豬的miR-369的相對表達(dá)量顯著低于藏豬、成華豬和雅南豬（P＜0.05）；藏豬miR-1的相對表達(dá)量最高，其次為成華豬，最低的為內(nèi)江豬和約克夏豬，藏豬、成華豬和雅南豬的miR-1相對表達(dá)量極顯著高于內(nèi)江豬和約克夏豬（P＜0.01）。

表3 不同豬種的miR-369、miR-1水平（n=6）

2.3 2種miRNA的表達(dá)水平與肉質(zhì)相關(guān)指標(biāo)含量的相關(guān)性

采用Sigmaplot 12.0分析了肉質(zhì)性狀相關(guān)指標(biāo)和基因表達(dá)量的相關(guān)性，由表4可知，miR-369、miR-1在背最長肌中的表達(dá)水平與肌內(nèi)脂肪含量和硫胺素含量呈正相關(guān)（r肌內(nèi)脂肪含量=0.5～0.7；r硫胺素=0.6~0.9），其中miR-369與硫胺素呈顯著正相關(guān)（r=0.85，P<0.05）；miR-369、miR-1 在背最長肌中的表達(dá)水平與肌纖維直徑、眼肌面積、瘦肉率呈負(fù)相關(guān)（r肌纖維直徑=-0.1～-0.6；r眼肌面積=-0.3～-0.9；r瘦肉率=-0.3～-0.8），其中miR-1與眼肌面積呈顯著負(fù)相關(guān)（r=-0.89，P<0.05）。

表4 miR-369、miR-1與肉質(zhì)相關(guān)指標(biāo)的相關(guān)性分析（n=6）

3 討論

提供滿足消費(fèi)者需求的豬肉產(chǎn)品具有重要意義，近年來育種學(xué)家已在豬肉質(zhì)的調(diào)控機(jī)理方面做了大量研究[6-8]，然而這些研究主要集中在DNA和mRNA水平的編碼基因，隨著miRNA的發(fā)現(xiàn)和功能研究的深入，從轉(zhuǎn)錄后的miRNA水平探索豬肉質(zhì)差異形成的分子機(jī)理成為了研究的熱點(diǎn)。影響豬肉質(zhì)風(fēng)味的因素很多，其中肌內(nèi)脂肪含量是重要決定因素之一，其與肉的多汁性、嫩度和風(fēng)味密切相關(guān)[9]，肌肉中的脂肪越多，則肉的多汁性越好，在5個(gè)豬種中，4個(gè)地方豬種的肌內(nèi)脂肪含量在3.72%～5.62%之間，肉質(zhì)優(yōu)良，約克夏豬的肌內(nèi)脂肪含量2.06%，極顯著低于地方豬種；肌纖維直徑越細(xì)，肉質(zhì)就越細(xì)嫩，味美。研究顯示4個(gè)地方豬種的肌纖維直徑在60～80 μm之間，肉質(zhì)細(xì)嫩，約克夏豬肌纖維直徑為92.74 μm，極顯著高于4個(gè)地方豬種；胴體瘦肉率是評價(jià)胴體品質(zhì)的主要指標(biāo)，與眼肌面積呈極顯著正相關(guān)，與肌內(nèi)脂肪含量呈負(fù)相關(guān)，4個(gè)地方豬種的胴體瘦肉率在42%～50%之間，屬脂肪型豬種，約克夏豬達(dá)63.54%，極顯著高于地方豬種；硫胺素是一種非常重要的風(fēng)味前體物質(zhì)，其熱降解是食品加工過程中風(fēng)味形成的主要途徑之一[10]，研究顯示藏豬、成華豬、雅南豬肌肉中的硫胺素含量較高，風(fēng)味更好。由本研究可知，地方豬種均屬于肉質(zhì)優(yōu)良豬種，其風(fēng)味佳、口感好，但瘦肉率較低，可作為優(yōu)質(zhì)風(fēng)味豬培育的育種素材。

miRNA對豬肌肉發(fā)育有著重要的調(diào)節(jié)作用[4]，Chen等[11]2006年研究發(fā)現(xiàn)miR-1在骨骼肌細(xì)胞分化成熟過程中呈現(xiàn)一定的時(shí)空特異性表達(dá)，促進(jìn)骨骼肌細(xì)胞分化。miR-369靶向調(diào)控TNF-α的表達(dá)，在脂肪沉積過程中扮演著重要角色[5]。本研究采用熒光定量PCR技術(shù)對藏豬、成華豬、雅南豬、內(nèi)江豬和約克夏豬背最長肌組織中miR-1和miR-369差異表達(dá)進(jìn)行了研究。結(jié)果顯示背最長肌組織中2個(gè)miRNA的表達(dá)水平在5個(gè)豬種中趨于一致。相關(guān)性分析顯示，2種miRNA在背最長肌中的表達(dá)水平與肌內(nèi)脂肪含量和硫胺素含量呈正相關(guān)，與肌纖維直徑、眼肌面積和瘦肉率呈負(fù)相關(guān)，表明miR-1和miR-369對豬肉質(zhì)具有正調(diào)控作用，而對豬胴體性能具有負(fù)調(diào)控作用，其可以影響豬肌肉生長和脂肪沉積，為通過調(diào)控其表達(dá)水平實(shí)現(xiàn)對豬肉質(zhì)風(fēng)味的改善提供了可能。

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