郭 曉，王 蕊，吳 娟，紀(jì)曉坤，王 珩，張 艷，馬 陽(yáng)，杜 蕓*

（河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院癌檢中心，河北 石 家莊 050011）

表皮生長(zhǎng)因子(epidermal growth factor receptor，EGFR)是一種具有酪氨酸激酶活性的跨膜糖蛋白，在肺腺癌中突變率較高。2015年美國(guó)國(guó)立綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)(national comprehensive cancer network，NCCN)建議對(duì)晚期的非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)患者進(jìn)行EGFR基因常規(guī)檢測(cè)，對(duì)于敏感突變患者推薦靶向藥物作為一線治療[1]。目前，用于EGFR基因突變檢測(cè)的標(biāo)本大多采用腫瘤組織的石蠟標(biāo)本[2]，但晚期患者很難獲得，而此類患者常伴隨遠(yuǎn)處體表淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和胸腔積液，細(xì)胞學(xué)標(biāo)本的獲取相對(duì)容易且數(shù)量充足。本研究通過細(xì)針穿刺和抽取胸腔積液獲得新鮮細(xì)胞學(xué)標(biāo)本，經(jīng)HE染色、免疫細(xì)胞化學(xué)明確診斷后進(jìn)行EGFR基因突變檢測(cè)，EGFR基因突變陽(yáng)性的患者服用酪氨酸激酶抑制劑(tyrosine kinase inhibitor，TKI)或進(jìn)行化療，評(píng)估其預(yù)后。探討采用新鮮細(xì)胞學(xué)標(biāo)本進(jìn)行EGFR基因突變檢測(cè)的可行性和臨床意義。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

收集2013年1月至2015年1月河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院癌檢中心要求行EGFR基因突變檢測(cè)的313例晚期肺腺癌患者新鮮細(xì)胞學(xué)標(biāo)本及病歷資料，男性患者161例，女性患者152例；年齡28～89歲，平均年齡為60歲，其中≥60歲169例，＜60歲的144例；細(xì)針穿刺標(biāo)本112例，胸腔積液標(biāo)本201例。預(yù)后評(píng)估的納入標(biāo)準(zhǔn)：新鮮細(xì)胞學(xué)標(biāo)本檢測(cè)EGFR陽(yáng)性，無(wú)20號(hào)外顯子突變；有完整病例資料；無(wú)肺外原發(fā)性腫瘤；根據(jù)實(shí)體瘤療效評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)(response evaluation criteria in solid tumors，RECIST)，有明確可評(píng)估和測(cè)量的病灶；服用一線藥物后生存期≥1個(gè)月。

1.2 標(biāo)本采集及處理

1.2.1 針吸標(biāo)本采集及處理 細(xì)針穿入淋巴結(jié)負(fù)壓抽取少量?jī)?nèi)容物，一部分注入1.5 mL的EP管，置于-20℃冰箱保存，用于EGFR基因突變檢測(cè)；剩余部分制作10張細(xì)胞涂片，2張采用普通玻片用于常規(guī)診斷，8張采用防脫玻片用于免疫細(xì)胞化學(xué)診斷，均置于95%乙醇中固定。

1.2.2 胸腔積液標(biāo)本采集及處理 將送檢胸腔積液分成兩部分：一部分胸腔積液(約100～200 mL)倒入20 mL離心管，1 800 r/min離心2 min，棄上清，留取底層沉淀物，重復(fù)倒入離心管，直至將這部分胸腔積液全部離心完畢，最后一次留取5 mL上清液，混勻，置于-20 ℃冰箱保存，用于EGFR基因突變檢測(cè)；剩余胸腔積液用一次性病變細(xì)胞采集器富集細(xì)胞后，將載有細(xì)胞的膜片均勻地涂于10張載玻片，用途和固定同上。

以上標(biāo)本經(jīng)HE染色找到癌細(xì)胞且癌細(xì)胞占整張玻片上細(xì)胞總數(shù)的比例≥25%后進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)染色。

1.3 免疫細(xì)胞化學(xué)

結(jié)合臨床資料和其他影像學(xué)檢查結(jié)果，選擇NapsinA、TTF-1、CEA、CK7、CK5/6、P63、P40、Syn、CD56、E-cadherin、CR等抗體，采用SP法進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)染色：將防脫玻片從固定液中取出，風(fēng)干后水洗，置于過氧化氫中15 min；充分水洗后，抗原修復(fù)；滴加動(dòng)物非免疫血清，室溫孵育15 min；棄去多余血清后加一抗，4 ℃過夜；PBS沖洗，加二抗，孵育20 min；PBS沖洗，DAB顯色，蘇木素復(fù)染細(xì)胞核，然后酒精分化、氨水返藍(lán)、梯度酒精脫水。吹干，中性樹膠封片。

免疫細(xì)胞化學(xué)標(biāo)記后觀察目的細(xì)胞，抗體著色的位置準(zhǔn)確，在相應(yīng)部位出現(xiàn)明顯棕黃色或者棕褐色顆粒才可判定為陽(yáng)性。

1.4 EGFR基因突變檢測(cè)

1.4.1 DNA提取 采用德國(guó)QIAGEN公司提取新鮮細(xì)胞學(xué)標(biāo)本DNA的試劑盒(QIAamp DNA Mini Kit)，經(jīng)消化、結(jié)合、洗滌、洗脫等步驟在紫外線分光光度計(jì)下檢測(cè)DNA樣本的純度和濃度，確保其純度在1.7～2.1、濃度在2～10 ng/μL。

1.4.2 EGFR基因突變檢測(cè) 使用武漢海吉力生物科技有限公司研發(fā)的人類EGFR基因突變檢測(cè)試劑盒進(jìn)行檢測(cè)。該試劑盒采用擴(kuò)增阻滯突變系統(tǒng)(amplification refractory mutation system，ARMS)技術(shù)進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR，檢測(cè)人類EGFR基因外顯子18～21上的突變。主要步驟：將待測(cè)的DNA樣品、陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照各取40 μL，分別加入4 μL熱啟動(dòng)Taq DNA聚合酶，瞬時(shí)離心混勻后，依次取5 μL加入試劑盒的8聯(lián)條后，置于ABI7500實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀中，按照說明書設(shè)置程序。

1.4.3 檢測(cè)結(jié)果判讀 PCR儀收集到的信號(hào)應(yīng)滿足以下條件才能認(rèn)為結(jié)果可信：①陰性對(duì)照無(wú)FAM信號(hào)升起；②陽(yáng)性對(duì)照FAM信號(hào)CT值 應(yīng)符合10≤CT≤ 20；③外控反應(yīng)孔(EGFR 8聯(lián)PCR反應(yīng)條的第8孔)的FAM信號(hào)CT值 應(yīng)符合10≤CT≤ 25。

此試劑盒采用ΔCT值 來(lái)判斷樣本的結(jié)果。每個(gè)樣本檢測(cè)完成后均有7個(gè)檢測(cè)體系對(duì)應(yīng)的突變信號(hào)(FAM)CT值 和內(nèi)控信號(hào)(JOE/VIC)CT值 ，還有1個(gè)外控信號(hào)(FAM)CT值 。若突變信號(hào)CT值 ＞30，則檢測(cè)結(jié)果為陰性。若突變信號(hào)CT值≤30，則應(yīng)計(jì)算檢測(cè)體系與外控檢測(cè)體系FAM信號(hào)之間的ΔCT值 。EGFR基因的突變分布在18～21號(hào)外顯子上，因此可能存在多種突變共存的情況(見表1)。

表1 EGFR基因突變含量判斷

1.5 預(yù)后評(píng)估

將EGFR基因突變陽(yáng)性的患者按1.1中所述納入標(biāo)準(zhǔn)篩選，根據(jù)一線用藥情況分成兩組，即靶向治療組和化療組。靶向治療組：口服厄洛替尼150 mg/d或者吉非替尼250 mg/d。化療組：順鉑30 mg/m2，第1～3天靜脈滴注；紫杉醇135 mg/m2，第1天靜脈滴注，每3周為1個(gè)療程。所有入組患者接受治療直至出現(xiàn)疾病進(jìn)展或者不可耐受的副反應(yīng)，期間每3個(gè)月隨訪一次，觀察患者的客觀有效率(objective response rate，ORR)和無(wú)進(jìn)展生存期(progression free survival，PFS)。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析

運(yùn)用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)分析軟件，χ2檢驗(yàn)評(píng)價(jià)ORR，Kaplan-Meier曲線進(jìn)行PFS的分析。

2 結(jié)果

2.1 HE染色和免疫細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)果

313例患者中，找到癌細(xì)胞297例。找到癌細(xì)胞的患者中，確診為肺腺癌293例。

2.2 EGFR基因突變檢測(cè)結(jié)果

293例肺腺癌患者，288例提取DNA成功，提取成功率約為98.3%。這288例患者進(jìn)行EGFR基因突變檢測(cè)，發(fā)生基因突變130例，突變率為45.1%。其中18號(hào)外顯子突變的5例，占3.8%；19號(hào)外顯子突變60例，占46.2%；20號(hào)外顯子突變5例，占3.8%；21號(hào)外顯子突變60例，占60%。EGFR突變與患者的臨床特征關(guān)系見表2。

表2 EGFR突變與臨床特征的關(guān)系

2.3 預(yù)后

截止到2016年1月，符合納入標(biāo)準(zhǔn)的93例EGFR陽(yáng)性患者中，中位隨訪時(shí)間14個(gè)月，共死亡54例。靶向治療組和化療組ORR的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2≈24.544，P＜0.01)，即靶向治療組的療效優(yōu)于化療組(見表3)。靶向治療組和化療組的中位PFS分別為9.5個(gè)月和6個(gè)月，從圖1中可看出靶向治療組曲線在化療組之上，即靶向治療組的無(wú)進(jìn)展生存期長(zhǎng)于化療組。

表3 3組NSCLC患者的療效比較

3 討論

當(dāng)今，肺癌嚴(yán)重威脅人類的健康，是發(fā)病率和致死率最高的惡性腫瘤之一，而非小細(xì)胞肺癌又是肺癌中最常見的類型[3]。由于發(fā)病隱匿，大部分患者首次就診時(shí)已是晚期，失去了手術(shù)機(jī)會(huì)，預(yù)后較差。以鉑類為基礎(chǔ)的化療雖然是治療晚期非小細(xì)胞肺癌的標(biāo)準(zhǔn)用藥，但是可引起骨髓抑制、肝腎損害等毒副作用，極大地降低了患者的生存質(zhì)量[4]。隨著腫瘤分子生物學(xué)的發(fā)展，靶向治療以其選擇性高、副作用小、療效好的特點(diǎn)[5-7]，占據(jù)了越來(lái)越重要的地位。但是靶向藥物價(jià)格比較昂貴且并不會(huì)使所有的用藥患者都受益，只有選擇合適的靶點(diǎn)才能為肺癌的個(gè)體化治療提供依據(jù)。EGFR基因突變?cè)谖覈?guó)非小細(xì)胞肺癌中最常見[8]，該靶點(diǎn)的研究也成為最近的熱點(diǎn)。目前，EGFR 基因突變檢測(cè)大多為手術(shù)切除石蠟包埋的腫瘤組織標(biāo)本。對(duì)于晚期失去手術(shù)機(jī)會(huì)的肺癌患者很難獲得，因此，尋求一種替代標(biāo)本進(jìn)行EGFR基因突變檢測(cè)已成為當(dāng)務(wù)之急。

由于EGFR基因突變有一定的人群優(yōu)勢(shì)，多發(fā)生在女性、不吸煙、肺腺癌的患者中[9]，因此對(duì)于體表淋巴結(jié)腫大和胸腔積液，應(yīng)先明確性質(zhì)和來(lái)源。體表淋巴結(jié)腫大在晚期肺癌患者中較常見，僅憑腫大淋巴結(jié)的位置、外觀和影像學(xué)檢測(cè)很難確定其性質(zhì)，其原發(fā)部位也可以是全身各處。胸腔積液也在肺部疾病中較常見，尤其在肺腺癌中更加多見，但常規(guī)的細(xì)胞學(xué)檢查主要依賴于癌細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特點(diǎn)，由于癌細(xì)胞在積液中失去了原有的組織形態(tài)，加之間皮細(xì)胞受刺激反應(yīng)性增生也有一些“癌細(xì)胞”的形態(tài)學(xué)特點(diǎn)，因此僅依賴形態(tài)學(xué)也很難作出判斷，這就需要免疫細(xì)胞化學(xué)輔助診斷。同時(shí)在新鮮細(xì)胞學(xué)標(biāo)本中可能混有較多的非腫瘤細(xì)胞，因此需要一種敏感性高的方法，ARMS 法所需腫瘤組織量小，10 ng基因組背景下突變含量為1%的DNA樣本[10]，就可以測(cè)定EGFR的突變情況。因此通過細(xì)針穿刺和抽取胸腔積液獲得的新鮮細(xì)胞學(xué)標(biāo)本，操作簡(jiǎn)單易行、損傷小、費(fèi)用低、可重復(fù)性好、標(biāo)本來(lái)源充足且便于收集，一定程度上可以解決標(biāo)本獲取的問題。

本研究的288例新鮮細(xì)胞學(xué)標(biāo)本，18～21號(hào)外顯子總的突變率為45.1%(130/288)，與文獻(xiàn)[11]報(bào)道的EGFR基因的突變率為36.4%～66.3%基本一致。Kasaka等[12]、 Paez等[13]和 Lynch等[14]報(bào)道90%的EGFR突變發(fā)生在19號(hào)外顯子和20號(hào)外顯子上，本研究發(fā)生19和21號(hào)外顯子突變120例，兩者之和突變率占92.4%(120/288)，與報(bào)道也一致。同時(shí)結(jié)合新鮮細(xì)胞學(xué)檢測(cè)的EGFR陽(yáng)性患者靶向治療組的客觀有效率和無(wú)進(jìn)展生存期優(yōu)于化療組，與IPASS研究[15]、NEJGSG002研究[16]、 WJTOG3405研究[17]以 及OPTIMAL研究相同[18]，可以得出，新鮮細(xì)胞學(xué)標(biāo)本作為EGFR的檢測(cè)標(biāo)本結(jié)果準(zhǔn)確。

綜上所述，在臨床上無(wú)法獲得腫瘤細(xì)胞標(biāo)本的情況下，采用新鮮細(xì)胞學(xué)標(biāo)本作為該標(biāo)本的替代標(biāo)本是行之有效的。

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