孫鳳霞，孟 醒，孫蓉麗，張 娟，尹立紅，浦躍樸*

（東南大學公共衛(wèi)生學院環(huán)境醫(yī)學工程教育部重點實驗室，江蘇 南 京 210009）

苯是常見的環(huán)境污染物，是化學工業(yè)中常見的原料和試劑，用于制造橡膠、染料、殺蟲劑等。在日常生活中，苯主要來源于家庭裝修材料、汽車尾氣、汽油蒸汽等。苯具有較高毒性，通過呼吸道進入人體，是確認致癌物[1]。長期接觸低濃度苯可導致慢性苯中毒，影響人體骨髓的造血功能，臨床表現(xiàn)為血小板數(shù)量和白細胞計數(shù)顯著減少，嚴重者可導致再生障礙性貧血、骨髓增生不良綜合征甚至白血病[2]。苯主要通過代謝物來發(fā)揮毒性作用[3]，在細胞色素氧化酶P4502E1 作用下生成氫醌、苯酚、1,4-苯醌、兒茶酚胺等，苯酚及其他酚類化合物與葡萄糖醛酸或硫酸鹽形成共軛化合物，可以隨尿液排出體外[4]。

骨髓是苯代謝物導致造血抑制的主要靶器官[5]。苯進入人體，在肝內(nèi)代謝產(chǎn)生的氫醌被運輸進入骨髓后，在髓過氧化物酶的作用下生成苯醌，此氧化過程中產(chǎn)生ROS，致氧化與抗氧化系統(tǒng)失衡，導致氧化應激，影響骨髓細胞的遷移、發(fā)育和自我更新以及細胞周期狀態(tài)，最終導致骨髓衰竭[4，6-7]。苯及其代謝物導致骨髓造血毒性的機制目前尚未闡明，可能與誘導凋亡、DNA損傷、骨髓池的損耗有關[2，7]。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，相對于對照組，苯染毒的小鼠骨髓細胞內(nèi)活性氧上升，而缺氧誘導因子HIF-1α表達降低，推測HIF-1α可能參與苯毒性的調(diào)節(jié)過程[8]。骨髓微環(huán)境氧濃度低，HIF-1α在缺氧環(huán)境中高表達，在常氧狀態(tài)下很快被降解[9-10]。骨髓細胞可能通過HIF-1α通路表達與血管生成、移動性和葡萄糖代謝相關的基因來應對缺氧[11-12]。K562細胞是慢性髓性白血病細胞，本研究通過構(gòu)建HIF-1α高表達的K562細胞模型，研究苯代謝物1,4-苯醌、氫醌、苯酚對對照組K562細胞和高表達HIF-1α的K562細胞毒性的影響，進而探討HIF-1α 在苯的代謝物致造血毒性發(fā)生中的作用。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑

伊思柯夫改良培養(yǎng)液(Iscove’s modified Dulbecco’s medium，IMDM)購于Gibco公司；胎牛血清購于Gibco公司；1,4-苯醌(1,4-benzoquine，1,4-BQ)，溶于甲醇，購于Sigma公司；氫醌(hydroquinone，HQ)，溶于超純水，購于Sigma公司；苯酚(phenol，PH)，溶于甲醇，購于Sigma公司；四甲基偶氮噻唑鹽(diphenyltetrazolium bromide， MTT)購于Sigma公司；二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)購于泰坦公司；PBS購于Gibco公司；青霉素和鏈霉素購于Hyclone公司；遺傳霉素(geneticin，G418)購于VWR公司；殺稻瘟菌素購于翊圣生物公司；Quick Change試劑盒購于Stratagene公司；Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒和PI細胞周期試劑盒購于BD公司；低溫高速離心機購于Eppendorf 公司；二氧化碳培養(yǎng)箱購于Heraeus公司；Mithras LB941多功能酶標儀購于Berthold公司；BD FACS Calibur流式細胞儀購于BD公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞株的構(gòu)建及培養(yǎng) K562細胞株購自中國科學院上海細胞庫，常規(guī)培養(yǎng)于含體積分數(shù)10%胎牛血清、1%青霉素、1%鏈霉素的IMDM中，培養(yǎng)條件為37℃、CO2體積分數(shù)5%。采用Quick Change試劑盒定點突變HIF-1α的脯氨酸402、564(VHL結(jié)合位點)和天冬氨酸803位點(FIH結(jié)合位點)，抑制HIF-1α泛素化降解，得到蛋白穩(wěn)定表達的P1P2N-HIF-1α質(zhì)粒。通過慢病毒載體轉(zhuǎn)染進入慢性髓性白血病細胞系K562細胞，構(gòu)建HIF-1α穩(wěn)定高表達的K562 細胞，同時構(gòu)建對照組K562細胞。高表達HIF-1α的K562細胞的HIF-1α蛋白水平顯著高于對照組K562細胞。高表達HIF-1α的K562細胞具有殺稻瘟菌素抗性，所以為穩(wěn)定篩選細胞并維持其抗性，在細胞培養(yǎng)時加入終體積分數(shù)為1∶5 000的殺稻瘟菌素。對照組K562細胞具有遺傳霉素抗性，在完全培養(yǎng)基中加入1∶1 000的遺傳霉素以穩(wěn)定篩選細胞并維持其抗性。

1.2.2 MTT法檢測細胞增殖率 取對數(shù)生長期細胞，800 r/min離心5 min，加入完全培養(yǎng)基制成單細胞懸液，按每孔10 000個細胞接種于96 孔培養(yǎng)板中。用完全培養(yǎng)基稀釋1,4-苯醌及氫醌溶液至終濃度為0、10、20、40、80 μmol/L，苯酚終濃度為0、1、1.5、2、2.5、5 mmol/L，每個劑量組設5個復孔。每個劑量陰性對照組不加毒物，空白對照組不加細胞及毒物。染毒24 h結(jié)束后每孔加入20 μL MTT溶液(5 mg/mL)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，后將96 孔板1 000 r/min離心10 min，小心吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液，每孔加入150 μL DMSO溶解藍紫色結(jié)晶物，混勻后，在酶標儀上選擇490 nm波長測定吸光度D(490)值。按公式計算各組細胞相對增殖率。

1.2.3 PI/FITC雙染色法結(jié)合流式細胞術檢測苯代謝物誘導K562細胞凋亡的作用 采用的苯代謝物濃度：1,4-苯醌及氫醌溶液終濃度為0、10、20 μmol/L，苯酚終濃度為0、1、2 mmol/L。染毒24 h后1 500 r/min離心5 min，收集細胞，用PBS洗滌細胞1次后，1 500 r/min離心5 min，收集5×105個細胞，加入500 μL結(jié)合緩沖液懸浮細胞。在細胞懸液中加入5 μL異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC)混勻后，加入5 μL碘化丙啶(propidium iodide，PI)混勻。室溫避光反應15 min，1 h內(nèi)用流式細胞儀檢測。

1.2.4 碘化丙啶(PI)染色結(jié)合流式細胞術檢測細胞周期分布 細胞分組處理同1.2.3，染毒24 h后1 500 r/min離心5 min，收集細胞，用PBS洗滌細胞1次后，1 500 r/min離心5 min，收集1×106個細胞，加入500 μL 70%冷乙醇固定2 h至過夜，4 ℃保存。固定結(jié)束后，用PBS洗滌細胞3次，1 500 r/min離心5 min，加入400 μL PI染色混勻，1 h內(nèi)用流式細胞儀檢測。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 19.0進行統(tǒng)計分析，計量資料組間差異采用單因素方差分析，兩兩比較采用Dunnett-t檢驗法，兩組細胞間比較采用兩獨立樣本t檢驗，檢驗水準α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 苯代謝物對K562細胞的增殖抑制作用

3種苯代謝物染毒對照組K562細胞和高表達HIF-1α的K562細胞24 h后對其增殖率的影響見圖1，可見1,4-苯醌染毒后，兩株細胞在20～80 μmol/L濃度均出現(xiàn)增殖率降低且呈劑量效應關系(與未處理組比較，P＜0.05)；1,4-苯醌濃度為80 μmol/L時，高表達HIF-1α的K562細胞相對增殖率高于對照組K562細胞(P＜0.05，圖1A)。氫醌染毒后，對照組K562細胞在20～80 μmol/L濃度均出現(xiàn)細胞增殖率降低(與未染毒組比較，P＜0.05)，而高表達HIF-1α的K562細胞僅在80 μmol/L 濃度時增殖率降低，且在20和40 μmol/L時，高表達HIF-1α的K652細胞較對照組K562細胞增殖率高(P＜0.05，圖1B)。苯酚染毒后，對照組K562細胞在2.5 和5 mmol/L濃度時增殖率降低(與未染毒組比較，P＜0.05)，而高表達HIF-1α的K562細胞在1～5 mmol/L濃度染毒時增殖率與未處理組比較差異均無統(tǒng)計學意義(圖1C)。

圖1 苯代謝物染毒對照組K562細胞和高表達HIF-1α的K562細胞24 h后的增殖率

2.2 苯代謝物對K562細胞的凋亡誘導作用

3種苯代謝物染毒對照組K562細胞和高表達HIF-1α的K562細胞24 h后，流式細胞術檢測對其凋亡率的影響，結(jié)果見圖2。可見1,4-苯醌染毒后，兩株細胞的細胞凋亡率增加且呈劑量效應關系(與未染毒組比較，P＜0.05)，在20 μmol/L濃度時高表達HIF-1α的K562細胞較對照組K562細胞凋亡率降低(P＜0.05，圖2A)。不同濃度的氫醌和苯酚染毒24 h后，兩株細胞的凋亡率與未染毒組比較差異均無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，高表達HIF-1α的K562細胞的凋亡率較對照組K562細胞差異亦無統(tǒng)計學意義(P＞0.05，圖2B、2C)。

2.3 苯代謝物對K562細胞周期的影響

3種苯代謝物染毒對照組K562細胞和高表達HIF-1α的K562細胞24 h后的細胞周期分布見表1?？梢?，4-苯醌染毒后，相對于未染毒組，兩株細胞均出現(xiàn)S期比例上升，G2/M期比例下降(P＜0.05)，細胞阻滯在S期。在20 μmol/L濃度時，與對照組K562細胞相比，高表達HIF-1α的K562細胞S期、G2/M期比例上升(P＜0.05)。氫醌染毒后，與未染毒細胞比較，對照組K562細胞G0/G1期比例上升，G2/M期比例下降(P＜ 0.05)；高表達HIF-1α的K562細胞G0/G1期比例上升，S期比例下降(P＜0.05)。與對照組K562細胞相比，未染毒時高表達HIF-1α的K562細胞的G0/G1期和S期比例上升(P＜0.05)；10 μmol/L濃度染毒時高表達HIF-1α的K562細胞G0/G1期比例上升(P＜0.05)。苯酚染毒后，相對于未染毒組，對照組K562細胞G0/G1期比例上升；高表達HIF-1α的K562細胞G0/G1期比例下降，S期和G2/M期上升(P＜0.05)。與對照組K562細胞相比未染毒時高表達HIF-1α的K562細胞G0/G1期比例下降，G2/M期上升(P＜0.05)；1、2 mmol/L濃度苯酚染毒時高表達HIF-1α的K562細胞G0/G1期比例下降，S期和G2/M期上升(P＜ 0.05)。

圖2 苯代謝物染毒對照組K562細胞和高表達HIF-1α的K562細胞24 h后的凋亡率

表1 3種苯代謝物染毒對照組K562細胞和高表達HIF-1α的K562細胞24 h后的細胞周期分布(%，-x±s)

3 討論

苯是一種確認的致癌物，不僅在工業(yè)生產(chǎn)中應用廣泛，還普遍存在日常生活中，如加油站及汽車尾氣、家庭裝修材料等。我國存在大量苯接觸人群，如何更好地保護該人群健康是職業(yè)衛(wèi)生領域的重要問題之一。目前職業(yè)苯暴露的特點是低濃度長期暴露，主要引起造血系統(tǒng)損害。研究認為苯的血液毒性主要是其在體內(nèi)代謝過程中形成的代謝產(chǎn)物所引起。苯通過呼吸道進入機體后，在肝內(nèi)細胞色素酶P4502E1的催化下，氧化生成苯氧化環(huán)等，苯氧化環(huán)可以自發(fā)轉(zhuǎn)化為苯酚，也可以經(jīng)環(huán)氧化物酶催化生成兒茶酚，苯氧化環(huán)也可打開進一步氧化形成粘糠醛、黏糠酸；苯酚可以羥基化形成兒茶酚、氫醌、1,2,4-苯三醇等，氫醌進入骨髓，在髓過氧化物酶(MPO)的作用下進一步氧化生成1,4-苯醌[4]。苯酚及其酚類代謝物均可與谷胱甘肽、硫酸鹽或葡萄糖苷酸形成鹽類，通過尿液排出體外。上述代謝物在苯的骨髓造血毒性中發(fā)揮不同程度的作用。缺氧誘導因子HIF-1α，在常氧狀態(tài)下很快被泛素化降解，而在缺氧狀態(tài)下高表達。HIF-1α是調(diào)節(jié)代謝適應和細胞對缺氧反應的轉(zhuǎn)錄因子，對造血干細胞的增殖、自我更新、骨髓歸巢有重要作用[13-14]。

本研究中，構(gòu)建HIF-1α穩(wěn)定高表達的細胞模型，采用3種苯代謝物染毒高表達HIF-1α的K562細胞及對照組K562細胞24 h后，分別檢測其增殖率、凋亡率和細胞周期分布。結(jié)果顯示，1,4-苯醌染毒后，兩株細胞均呈現(xiàn)增殖抑制且呈劑量效應關系，1,4-苯醌濃度為80 μmol/L時，高表達HIF-1α的K562細胞較對照組K562細胞增殖抑制減弱。氫醌和苯酚在較高濃度染毒后，對照組K562細胞亦出現(xiàn)增殖抑制，而高表達HIF-1α的K562細胞增殖抑制不明顯。實驗結(jié)果表明高表達HIF-1α后，可削弱3種苯代謝物對K562細胞的增殖抑制效應。流式細胞術結(jié)果顯示，1,4-苯醌染毒后，兩株細胞的細胞凋亡率增加且呈劑量效應關系。高濃度1,4-苯醌染毒時，高表達HIF-1α的K562細胞較對照組K562細胞凋亡減弱。氫醌和苯酚染毒后，兩株細胞的凋亡率與未染毒組比較差異均無統(tǒng)計學意義，高表達HIF-1α 的K562細胞的凋亡率較對照組K562細胞亦無顯著差異。以上結(jié)果表明HIF-1α高表達后，較高濃度苯的代謝物對K562細胞的凋亡誘導作用減弱。細胞周期的檢測結(jié)果顯示，3種苯代謝物均可引起K562細胞周期阻滯在G0/G1期或S期。綜上結(jié)果，提示HIF-1α可在一定程度上降低苯代謝物引起的細胞毒性作用，其作用的發(fā)揮可能是通過調(diào)節(jié)細胞周期參與調(diào)節(jié)細胞增殖及凋亡。通過對3種苯代謝物細胞毒性的比較，發(fā)現(xiàn)1,4-苯醌引起的細胞毒性大于氫醌和苯酚。

既往研究使用苯的代謝物處理K562細胞后的細胞毒性結(jié)果和本研究結(jié)果基本一致[15-17]。 Jiang等[18]人通過腺病毒感染SCN-cells使HIF-1α高表達，使細胞增殖能力增強2倍、細胞遷移能力增強1.4倍。而Chen等[19]通過siRNA 降低K562細胞中的表達，結(jié)果發(fā)現(xiàn)HIF-1α低表達的K562細胞的增殖能力、集落形成能力降低。Zhang等[20]通過構(gòu)建HIF-1α敲除的CML小鼠模型，發(fā)現(xiàn)HIF-1α敲除的CML小鼠通過誘導白血病干細胞的凋亡、損害細胞周期進程進而削弱其增殖及自我更新能力。Meng等[8]發(fā)現(xiàn)苯染毒的小鼠骨髓細胞中，HIF-1α表達降低，提示HIF-1α參與到小鼠骨髓增殖抑制過程中。

因此，HIF-1α高表達對于苯代謝物誘導的細胞毒性具有保護作用，但具體的調(diào)控機制仍有待研究，本研究可為進一步探討HIF-1α在苯代謝產(chǎn)物誘導造血毒性中的作用提供線索。

[1] TOMATIS L. IARC benzene report[J]. Science，1982，218(4569)：214.

[2] SMITH M T. Overview of benzene-induced aplastic anaemia[J].Eur J Haematol，1996，57：107-110.

[3] SNYDER R，HEDLI C C. An overview of benzene metabolism[J].Environ Health Perspect，1996，104(6)：1165-1171.

[4] SNYDER R. Leukemia and benzene[J]. Int J Environ Res Public Health，2012，9(8)：2875-2893.

[5] MCHALE C M， ZHANG L， SMITH M T. Current understanding of the mechanism of benzene-induced leukemia in humans：implications for risk assessment[J]. Carcinogenesis，2012，33(2)：240-252.

[6] RICHARDSON C，YAN S，VESTAL C G. Oxidative stress，bone marrow failure，and genome instability in hematopoietic stem cells[J]. Int J Mol Sci，2015，16(2)：2366-2385.

[7] ZHAO Z，HE X，BI Y，et al. Induction of CYP4F3 by benzene metabolites in human white blood cells in vivo in human promyelocytic leukemic cell lines and ex vivo in human blood neutrophils[J]. Drug Metab Dispos，2009，37(2)：282-291.

[8] MENG X，ZHANG J，YIN L H，et al. Involvement of hypoxia-inducible factor-1 alpha (HIF-1 alpha) in inhibition of benzene on mouse hematopoietic system[J]. J Toxicol Environ Health A，2016，79(9/10)：402-406.

[9] TESTA U，LABBAYE C，CASTELLI G，et al. Oxidative stress and hypoxia in normal and leukemic stem cells[J]. Exp Hematol，2016，44(7)：540-560.

[10] SPENCER J A，F(xiàn)ERRARO F，ROUSSAKIS E，et al. Direct measurement of local oxygen concentration in the bone marrow of live animals[J]. Nature，2014，508(7495)：269-273.

[11] WU C，ZHOU Y，F(xiàn)AN W，et al. Hypoxia-mimicking mesoporous bioactive glass scaffolds with controllable cobalt ion release for bone tissue engineering[J]. Biomaterials，2012，33(7)：2076-2085.

[12] LI T S，HAMANO K，SUZUKI K，et al. Improved angiogenic potency by implantation of ex vivo hypoxia prestimulated bone marrow cells in rats[J]. Am J Physiol Heart Circ Physiol，2002，283(2)：468-473.

[13] HU C J，IYER S，SATAUR A，et al. Differential regulation of the transcriptional activities of hypoxia-inducible factor 1 alpha(HIF-1alpha) and HIF-2alpha in stem cells[J]. Mol Cell Biol，2006，26(9)：3514-3526.

[14] JENNIFER M. S，JONATHAN H，PRATIBHA S，et al.Pharmacologic increase in HIF1a enhances hematopoietic stem and progenitor homing and engraftment[J]. Blood， 2014，123(2)：203-207.

[15] 吳小榮，李曉飛，韓慶玲. 甲基化抑制劑對氫醌抑制K562細胞紅系分化的干預作用[C]//全國生化/工業(yè)與衛(wèi)生毒理學學術會議論文集. 大連：中國毒理學會，2010：241-242.

[16] 薛明，張光垚，吳曉榮. 苯代謝物苯酚對K562細胞的凋亡誘導和分化抑制作用[C]//中國毒理學會第五次全國學術大會論文集. 貴陽：中國毒理學會，2009：70.

[17] 韓慶玲，薛明，吳曉榮. 苯代謝物苯酚對K562細胞的凋亡誘導作用[C]//中國毒理學會第五次全國學術大會論文集. 貴陽：中國毒理學會，2009：138.

[18] JIANG Y Z，LI Y，WANG K，et al. Distinct roles of HIF1A in endothelial adaptations to physiological and ambient oxygen[J].Mol Cell Endocrinol，2014，391(1/2)：60-67.

[19] CHEN H，SHEN Y，GONG F，et al. HIF-alpha promotes chronic myelogenous leukemia cell proliferation by upregulating p21 expression[J]. Cell Biochem Biophys，2015，72(1)：179-183.

[20] ZHANG H J，LI H W，S. XI H L，et al. HIF1α is required for survival maintenance of chronic myeloid leukemia stem cells[J].BLOOD，2012，119(11)：2595-2607.