高 飛，王英濱

（1．中國醫(yī)科大學附屬第四醫(yī)院，遼寧沈陽110032；2． 沈陽醫(yī)學院附屬中心醫(yī)院，遼寧沈陽 110024）

膠質(zhì)瘤是顱內(nèi)最常見的惡性腫瘤，在所有顱內(nèi)腫瘤中約占44.69%。膠質(zhì)瘤由于浸潤性生長方式及侵襲性強的特性，目前單純用任何一種方法均不能徹底根治，極易復發(fā)，預后較差[1]。由于腦膠質(zhì)瘤患者生存期和生存質(zhì)量較差，因此給患者及其家庭造成沉重的負擔。近年來，醫(yī)護工作者逐漸重視膠質(zhì)瘤的綜合治療，包括化療、放療、生物治療及其他治療等。

化療是膠質(zhì)瘤治療中重要的一環(huán)，由于人體大腦具有血腦/瘤屏障，藥物很難通過；膠質(zhì)瘤中藥物有效濃度較低，腫瘤對藥物的敏感性不夠以及藥物對全身的毒副作用等因素影響了臨床療效。研究[2]發(fā)現(xiàn)，動脈內(nèi)注射化療藥物可以增加膠質(zhì)瘤內(nèi)部的藥物含量。目前超選擇性動脈化療藥物較多，其中順鉑(cisplatin，CDDP)是無機重金屬化合物，為細胞周期非特異性藥物，主要干涉DNA與RNA相關(guān)蛋白質(zhì)的合成。貝伐單抗(bevacizumab，BVZ)是一種重組的人類單克隆IgG1抗體，通過抑制人類血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)的生物學活性而起作用。目前研究顯示BVZ與其他化療藥物聯(lián)用可很大程度上改善腦膠質(zhì)瘤的治療[3]。但是，BVZ是否能夠單藥治療復發(fā)性惡性膠質(zhì)瘤方面的研究尚無報道。因此，本研究對C6膠質(zhì)瘤大鼠模型進行動脈介入超選化療，分別應用CDDP和BVZ作為化療藥物，探討動脈介入超選化療應用BVZ對膠質(zhì)瘤的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

C6膠質(zhì)瘤細胞[美國菌種保藏中心(ATCC)]；Wistar大鼠，體質(zhì)量180～200 g(中國醫(yī)科大學實驗動物中心)；貝伐單抗(瑞士Roche公司)。RPMI-1640培養(yǎng)基(美國Sigma公司)；VEGF、P21蛋白(P21)、B淋巴細胞瘤-2(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)、金屬基質(zhì)蛋白-2(matrix metalloproteinase-2，MMP-2) 抗體均購于美國Santa Cruz Biotechnology公司；辣根過氧化物酶標記的山羊抗小鼠、山羊抗兔IgG二抗均購于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；VEGF、P21、Bcl-2 和MMP-2引物購自生工生物工程(上海)股份有限公司；Real time-PCR試劑盒購自大連TaKaRa公司。

1.2 儀器與設備

腦立體定向儀(美國Stoelting公司)，倒置顯微鏡(日本Olympus公司)，-80 ℃超低溫冰箱(日本SANYO公司)，臺式低溫超速離心機(德國Sigma公司)，超凈工作臺(蘇州凈化設備集團)，CO2恒溫培養(yǎng)箱(美國Thermo Scientific公司)，聚丙烯酰胺凝膠電泳裝置(美國Bio-Rad公司)，轉(zhuǎn)印儀(北京市六一儀器廠)，Las3000成像系統(tǒng)(日本FUJIFILM公司)，凝膠成像分析軟件(江蘇捷達科技有限公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 C6細胞培養(yǎng) C6膠質(zhì)瘤細胞復蘇成功后，重懸于含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液中，于37℃、CO2體積分數(shù)為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，次日更換培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)，觀察細胞生長狀況。

1.3.2 建立腦膠質(zhì)瘤動物模型 60只SPF級SD大鼠(合格證號211002300016826)，由中國醫(yī)科大學實驗動物中心提供，雄性，體質(zhì)量180～200 g。大鼠用10%水合氯醛(3 mL/kg)腹腔注射進行麻醉，頭部固定在腦立體定位儀上。常規(guī)消毒后，沿中線縱向切開頭皮約1 cm，暴露顱骨。根據(jù)大鼠頭部立體定向解剖圖譜確定對應于右腦尾狀核的鉆孔位置：冠狀縫與矢狀中線交點處前1 mm，矢狀縫右3 mm。微量進樣器抽取C6細胞懸液10 μL(含1×105個細胞)，注射速度為1 μL/min，緩慢拔針。骨孔用牙托粉迅速封閉。縫合切口后，肌注青霉素0.1 mL，繼續(xù)飼養(yǎng)。

1.3.3 實驗動物分組及治療 C6膠質(zhì)瘤細胞種植后第7天開始，將建模成功的55只大鼠隨機分為5組，每組11只：對照組(經(jīng)尾靜脈注射等量生理鹽水)、靜脈注射順鉑組(V+CDDP，經(jīng)尾靜脈注射5 mg/kg CDDP[4])、靜脈注射貝伐單抗(V+BVZ，經(jīng)尾靜脈注射5 mg/kg BVZ[5])、動脈注射順鉑組(A+CDDP，經(jīng)頸動脈注入5 mg/kg CDDP)和動脈注射貝伐單抗組(A+BVZ，經(jīng)頸動脈注入5 mg/kg BVZ)。隔天注射1次，持續(xù)7 d。

1.3.4 各組大鼠腫瘤體積的測量 給藥治療7 d后，稱體質(zhì)量，10%水合氯醛將大鼠麻醉，生理鹽水灌流，后經(jīng)4%的多聚甲醛灌流。斷頭取腦膠質(zhì)瘤組織，放入30%蔗糖中脫水2 d，4%多聚甲醛固定24 h，液氮速凍后在-25 ℃的恒冷冰凍切片機上切片，厚度為8 μm，行HE染色。應用MCID圖像分析軟件測量計算腦膠質(zhì)瘤的病灶區(qū)面積，按下式計算腦腫瘤的體積：

腦腫瘤的體積=面積總和×組織間隔厚度

1.3.5 Real time-PCR檢測mRNA表達 給藥治療7 d后，取50 mg大鼠腦膠質(zhì)瘤組織，提取RNA，檢測濃度及D(260)/D(280)。按試劑盒說明書反轉(zhuǎn)錄為cDNA，引物如下：VEGF，上游引物5'-GGTGAGAGGTCTAGTTC CCGA-3'，下游引物5'-CCATGAACTTTCTGCTCTTC-3'；p21，上游引物5'-AGTAGACACGAAACAGGC-3'，下 游 引 物5'-TTCCCATCTTTGCTCATC-3'； Bcl-2， 上游引物5'-CGGGAGAACAGGGTATGA-3'，下游引物5'-CAGGCTGGAAGGAGAAGAT-3'； MMP-2： 上 游 引 物5'-GGAAGCATCAAATCGGACTG-3'，下游引物5'-GG GCGGGAGAAAGTAGCA-3'。反應條件：94 ℃、3 min，94 ℃、30 s，60 ℃、1 min，72 ℃、1 min(30個循環(huán))，72 ℃、2 min。mRNA相對表達差異采用2-ΔΔCT法計算，進行比較。

1.3.6 Western blot檢測蛋白表達 給藥治療7 d后，取50 mg大鼠腦膠質(zhì)瘤組織，提取蛋白。腦組織在預冷的組織裂解液中剪碎，勻漿約1 min，冰浴30 min，17 000 r/min、4 ℃離心1 h，收集上清。加入樣品緩沖液，然后將樣品置于沸水浴中加熱5 min使蛋白質(zhì)變性。8% SDS-PAGE電泳后進行轉(zhuǎn)印，5%脫脂奶粉4 ℃封閉過夜，第2天加入稀釋的一抗(1∶200)，室溫2 h，漂洗3次后，加入稀釋的相應二抗(1∶5 000)，室溫2 h。漂洗3次，發(fā)光顯色，Quantity One軟件對各組蛋白條帶光密度進行分析。

1.4 統(tǒng)計學分析

實驗數(shù)據(jù)采用SPSS for Windows18.0軟件進行統(tǒng)計-學分析。數(shù)據(jù)以x±s表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，以α=0.05為檢驗水準。

2 結(jié)果

2.1 不同治療方法對大鼠腫瘤體積的影響

對照組大鼠腦膠質(zhì)瘤體積為(9.02±0.74) mm3，V+CDDP組的腫瘤體積為(7.67±0.70) mm3、V+BVZ組為(6.57±0.69) mm3、A+CDDP組為(5.58±0.37) mm3、A+BVZ組為(4.81±0.20) mm3，均較對照組明顯減小，差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)；且A+CDDP組腫瘤體積較V+CDDP組相明顯縮小(P＜0.01)，A+BVZ組腫瘤體積較V+BVZ組明顯較小(P＜0.01)，結(jié)果顯示，動脈注射具有較強的抑制膠質(zhì)瘤體積的作用。同時，V+BVZ組腫瘤體積顯著小于V+CDDP組，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)，A+BVZ組腫瘤體積顯著小于A+CDDP組，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，提示BVZ對膠質(zhì)瘤的抑制作用較CDDP更強，見圖1。

圖1 不同治療方法對大鼠腦膠質(zhì)瘤體積的影響(n=11)

2.2 不同治療方法對大鼠腦膠質(zhì)瘤VEGF、P21、Bcl-2和MMP-2 mRNA表達水平的影響

利用Real time-PCR方法測定各組大鼠腦膠質(zhì)瘤組織中相關(guān)基因的表達(見圖2)。結(jié)果顯示，V+CDDP組、V+BVZ組、A+CDDP組和A+BVZ組的VEGF、Bcl-2及MMP-2的mRNA表達與對照組相比均明顯降低，差異均有統(tǒng)計學意義(P均＜0.05)；同時，P21的mRNA表達明顯增多，差異亦均有統(tǒng)計學意義(P均＜0.05)。與V+CDDP組相比，A+CDDP組的VEGF、Bcl-2及MMP-2的mRNA表達均顯著降低(P＜0.05)，A+BVZ組上述各mRNA表達也顯著低于V+BVZ組(P＜0.05)。另外，A+CDDP組P21的mRNA表達較V+CDDP組顯著升高(P＜0.01)， A+BVZ組 P21的 mRNA表 達 也 顯 著 高 于V+BVZ組(P＜ 0.01)，結(jié)果顯示，動脈注射降低VEGF、Bcl-2以及MMP-2的作用以及提高P21蛋白的作用更顯著。此外，V+BVZ組VEGF、Bcl-2和MMP-2的mRNA表達顯著低于V+CDDP組(P＜0.05)，A+BVZ組上述各mRNA表達也顯著低于A+CDDP組(P＜0.05)。而V+BVZ組P21的mRNA表達較V+CDDP組顯著升高(P＜0.05)。

圖2 不同治療方法對大鼠腦膠質(zhì)瘤VEGF、P21、Bcl-2和MMP-2 mRNA表達的影響(n=5)

2.3 不同治療方法對大鼠腦膠質(zhì)瘤VEGF、P21、Bcl-2和MMP-2蛋白表達的影響

Western blot檢測的各組大鼠腦膠質(zhì)瘤組織中相關(guān)蛋白的表達情況見圖3。統(tǒng)計分析結(jié)果顯示，V+CDDP組、V+BVZ組、A+CDDP組和A+BVZ組的VEGF、Bcl-2、MMP-2表達與對照組相比均明顯降低，差異均有統(tǒng)計學意義(P均＜0.05)；同時，P21蛋白表達明顯增多，差異亦有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。A+CDDP組VEGF、Bcl-2和MMP-2蛋白表達與V+CDDP組相比均顯著降低(P均＜0.05)，A+BVZ組上述蛋白表達也均顯著低于V+BVZ組(P均＜0.05)。A+CDDP組P21表達較V+CDDP組顯著升高(P＜0.05)，A+BVZ組P21表達也顯著高于V+BVZ組(P＜0.01)，結(jié)果顯示，動脈注射降低VEGF、Bcl-2及MMP-2的表達與升高P21蛋白表達的作用較靜脈注射更顯著。此外，V+BVZ組VEGF、Bcl-2和MMP-2蛋白的表達顯著低于V+CDDP組(P＜0.05)，A+BVZ組上述蛋白表達也顯著低于A+CDDP組(P＜0.05)。V+BVZ組P21蛋白表達較V+CDDP組顯著升高(P＜0.05)，A+BVZ組P21蛋白表達也顯著高于A+CDDP組(P＜0.05)。結(jié)果顯示，BVZ降低VEGF、Bcl-2和MMP-2蛋白的表達與升高P21蛋白的作用較CDDP更顯著。

圖3 不同治療方法對大鼠腦膠質(zhì)瘤VEGF、P21、Bcl-2及MMP-2蛋白表達的影響(n=5)

3 討論

膠質(zhì)瘤傳統(tǒng)的靜脈化療因血腦屏障和血瘤屏障的制約，療效明顯受限。隨著神經(jīng)介入技術(shù)的飛速發(fā)展，經(jīng)動脈超選化療，由于其可能克服經(jīng)靜脈化療的局限正受到越來越多的關(guān)注[6]。 Tomokatsu等[7]發(fā)現(xiàn)經(jīng)動脈灌注可以使嘧啶亞硝脲(nimustine，ACNU)更易進入腫瘤及瘤周組織，而灌注前10 min輸入20%甘露醇可使腫瘤及瘤周組織中的ACNU濃度達到最高。Levin 等[8]研究表明，灌注側(cè)的藥物濃度比同劑量靜脈用藥高4倍。在灌注時用定量輸液泵快速輸入化療藥物，可避免藥物在血流中形成層流，促進藥物在遠端各血管分支內(nèi)均勻分布，達到最大療效。劉灃等[9]發(fā)現(xiàn)單次經(jīng)頸內(nèi)動脈灌注ACNU較單次經(jīng)靜脈灌注能更有效地抑制腦膠質(zhì)瘤的生長。還有研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)[10]，經(jīng)動脈灌注途徑對大鼠腦膠質(zhì)瘤進行化療，增加化療藥物的療效，能更有效控制腫瘤的生長。本實驗結(jié)果顯示，動脈注射CDDP和BVZ后，大鼠腦膠質(zhì)瘤體積較對照組明顯縮小，并且與靜脈注射相比均具有較強的抑制膠質(zhì)瘤生長的作用。膠質(zhì)細胞瘤一般有一條或兩條主要動脈供血，研究認為腫瘤組織動脈的血流率低，動脈灌注化療藥物可以直接將藥物送到腫瘤位置，減少體內(nèi)循環(huán)，提高腫瘤內(nèi)藥物的作用濃度[11-12]，藥物的半衰期短，而對周圍腦組織及全身各系統(tǒng)的毒副作用減少，故動脈超選化療是治療腦膠質(zhì)瘤的最佳途徑。

腦膠質(zhì)瘤通常存在異常過度的血管生成，而促血管形成因子血管內(nèi)皮生長因子A(VEGFA)的高表達與此過程密切相關(guān)[13]。BVZ是人工合成的VEGF單克隆抗體，以VEGF為靶點競爭性結(jié)合VEGF受體，從而抑制內(nèi)皮細胞的有絲分裂和血管生成，達到阻斷腫瘤的血液供應的效果，最后抑制腫瘤在體內(nèi)擴散。有報道顯示，BVZ可作為單一用藥及聯(lián)合其他化療藥物用來治療如轉(zhuǎn)移性結(jié)腸癌、肺癌等其他實體性惡性腫瘤[14]。Hacibekiroglu等[15]使用BVZ單藥治療復發(fā)性膠質(zhì)瘤患者，結(jié)果發(fā)現(xiàn)20%達到部分緩解，38%病情穩(wěn)定。日本一項研究結(jié)果顯示[16]使用BVZ單藥治療復發(fā)性高級別膠質(zhì)瘤 患者，疾病緩解率為27.6%。本研究結(jié)果將BVZ應用治療腦膠質(zhì)瘤大鼠，也發(fā)現(xiàn)BVZ對膠質(zhì)瘤具有較強的抑制作用。

另外VEGF與膠質(zhì)瘤異常過度的血管生成有關(guān)[17]，P21是細胞周期蛋白依靠性激酶抑制劑家族中的重要成員，它通過抑制周期素依賴激酶復合物活性，將腫瘤抑制作用與細胞周期控制過程緊密相連[18]。Bcl-2在細胞凋亡過程中起到抑制細胞凋亡的作用[19-20]。基質(zhì)金屬蛋白酶2(MMP-2)，幾乎能降解細胞外基質(zhì)(extracellular matrixc，ECM)中的各種蛋白成分，破壞腫瘤細胞侵襲的組織學屏障，在腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移中起關(guān)鍵作用[21]。本實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)動脈注射降低VEGF、Bcl-2、MMP-2蛋白表達及升高P21蛋白表達的作用較靜脈注射更顯著。同時，BVZ較CDDP的作用更顯著。

綜上所述，應用BVZ動脈超選化療，能有效控制腦膠質(zhì)瘤的生長，并且對腦膠質(zhì)瘤異常的血管生成、細胞周期、細胞凋亡以及侵襲遷移等過程都可能產(chǎn)生影響，從而達到較好的治療效果。目前膠質(zhì)瘤的治療仍是世界公認的難題，為了延長膠質(zhì)瘤患者的生存期以及生活質(zhì)量，醫(yī)務工作者在不斷的探索新療法。動脈超選化療能有效控制腦膠質(zhì)瘤的大小，對其深入探討和完善將可為臨床應用提供一個有效的治療手段。

[1] 陳圣攀，左曉坤，夏鷹. 腦膠質(zhì)瘤的治療進展[J]. 中華神經(jīng)創(chuàng)傷外科電子雜志，2017，3(2)：105-108.

[2] 唐濤，丁長青，孫祖杰，等. 高級別惡性腦膠質(zhì)瘤術(shù)后三維適型放療聯(lián)合經(jīng)頸動脈灌注化療的效果分析[J]. 中國當代醫(yī)藥，2017，24(8)：59-62.

[3] 顏元良，徐志杰，錢龍，等. 貝伐單抗聯(lián)合放化療治療腦膠質(zhì)瘤療效的系統(tǒng)評價[J]. 中國臨床藥理學與治療學，2016，21(1)：64-70.

[4] 羅福祥，盧軍，張海英，等. 新疆阿魏乙酸乙酯部位對小鼠S180實體瘤的抑制作用[J]. 中國藥房，2016，27(31)：4388-4391.

[5] 張雪鵬，孫影，張云鵬. 治療大鼠顱內(nèi)膠質(zhì)瘤的實驗研究[J].中國現(xiàn)代醫(yī)學雜志，2013，23(17)：11-16.

[6] 白俊利，王愛民，劉麗君，等. 經(jīng)頸動脈灌注ACNU、VM-26聯(lián)合治療復發(fā)性腦膠質(zhì)瘤的臨床研究[J]. 解放軍預防醫(yī)學雜志，2016，34(4)：85-86.

[7] TOMOKATSU H，KIYOAKI M， YOSHIKAZU S， et al.Influence of modes of ACNU administration on tissue and blood drug concentration in malignant brain tumors[J]. Neurosurg，1987，66：372-378.

[8] LUTZ R J，DEDRIEK R L，BORETOS J W，et al. Mixing studies during intraearotid artery infusions in an in vitro model[J].Neurosurg，1986，64(2)：277-283.

[9] 劉灃，劉健，楊華，等. 腦膠質(zhì)瘤經(jīng)頸內(nèi)動脈灌注ACNU的療效觀察[J]. 中國微侵襲神經(jīng)外科雜志，2006，11(5)：228-229.

[10] 王昆鵬，趙文清，王維興，等. 動脈灌注化療對大鼠腦膠質(zhì)瘤的治療作用及其機制[J]. 吉林大學學報(醫(yī)學版)，2015，41(2)：327-332.

[11] 曾志文，劉秋明，王紅，等. 晚期乳腺癌介入治療與全身化療的療效比較[J]. 當代醫(yī)學，2017，23(18)：136-137.

[12] 陳博年，吳劍涓. 腦膠質(zhì)瘤的藥物治療[J]. 天津藥學，2011，23(1)：58-62.

[13] DESJARDINS A， REARDON D A， COAN A， et al.Bevacizumab and daily temozolomide for recurrent glioblastoma[J]. Cancer，2012，118(5)：1302-1312.

[14] 徐彩虹，陳俊. 貝伐單抗聯(lián)合吉非替尼片治療非小細胞肺癌的臨床研究[J]. 中國臨床藥理學雜志，2017，33(8)：684-686.

[15] HACIBEKIROGLU I， KODAZ H， ERDOGAN B， et al.Single-agent bevacizumab is an effective treatment in recurrent glioblastoma[J]. Med Oncol，2015，32(2)：460.

[16] NAGANE M，NISHIKAWA R，NARITA Y，et al. Phase Ⅱstudy of single-agent bevacizumab in Japanese patients with recurrent malignant glioma[J]. Jpn J Clin Oncol， 2012，42(10)：887-895.

[17] 馬慶防，黎軍，王永楠，等. COX-2與MMP-9和VEGF在膠質(zhì)瘤中的表達及意義[J]. 中華腫瘤防治雜志，2016：24-25.[18] 董志強，李強，賀振華，等. P21和survivin蛋白在腦膠質(zhì)瘤組織中的表達及其臨床意義[J]. 吉林大學學報(醫(yī)學版)，2015，41(5)：1004-1007，1106.

[19] 王芳，劉瑾. 重組人Bcl-2及Ercc-1基因腺病毒的構(gòu)建及對肺癌細胞凋亡的影響[J]. 實用醫(yī)學雜志，2015，31(5)：2443-2446.

[20] 楊天權(quán)，王杭州，王勇強，等. NF-κB1通過促進BCL2表達抑制膠質(zhì)瘤細胞的早期凋亡[J]. 臨床神經(jīng)外科雜志，2017，14(5)：326-330.

[21] 高海東，壽記新，付旭東，等. ICAM-1、MMP-2在人腦膠質(zhì)瘤的表達及相關(guān)性研究[J]. 中華神經(jīng)醫(yī)學雜志，2015，14(7)：674-677.