張朝寧 李金田* 劉永琦 藺興遙

（1．甘肅中醫(yī)藥大學中醫(yī)臨床基礎教研室，甘肅 蘭 州 730000；2．敦煌醫(yī)學與轉(zhuǎn)化省部共建教育部重點實驗室，甘肅 蘭 州 730000）

惡性腫瘤是一種嚴重威脅人類健康的疾病，放療是治療惡性腫瘤的重要手段之一，但在放療過程中射線可損傷腫瘤周圍健康組織，產(chǎn)生輻射旁效應，影響治療效果和患者對治療的依從性，因而輻射旁效應是輻射生物學及臨床腫瘤放療領(lǐng)域的研究熱點。輻射旁效應是指受輻射的細胞除自身產(chǎn)生變化之外，還將損傷信號傳遞至周圍未受輻射的細胞，誘導未受輻射的細胞產(chǎn)生與受輻射的細胞相同或相似生物學反應的現(xiàn)象[1]。其生物學效應主要包括DNA損傷、基因表達異常、細胞增殖與凋亡、炎癥反應、致瘤性轉(zhuǎn)化及癌癥形成[2-5]等。輻射旁效應的發(fā)生機制及時間效應目前尚未完全清楚，且主要集中在體外研究中，對于更能模擬腫瘤放療過程的體內(nèi)研究尤顯不足。因此，本實驗用不同劑量的X射線(2、4和8 Gy)照射大鼠右肺部(鉛皮屏蔽身體其余部位)建立輻射損傷模型，在照射后的不同時間點(6、24和48 h)檢測線粒體凋亡通路中關(guān)鍵基因Cytc、Caspase-9、Caspase-3、Bax、Bcl-2在直接照射右肺組織及未受照射左肺及左腎組織中的mRNA表 達變化，為輻射誘發(fā)體內(nèi)旁效應研究提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF級雄性Wistar大鼠70只，2～3月齡，體質(zhì)量(200±20) g，由甘肅中醫(yī)藥大學SPF級實驗動物中心提供[合格證號SCXK(甘)2015-0002]。所有動物實驗均經(jīng)過甘肅中醫(yī)藥大學醫(yī)學與實驗動物倫理委員會審查批準。

1.2 實驗試劑

Trizol試 劑 (美 國 Invitrogen公 司 ， 批 號 94206)；DEPC處理水(北京索萊寶科技有限公司，批號R1600)；SYBR Fast qPCR試劑盒(大連寶生物工程有限公司，批號R820)；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(大連寶生物工程有限公司，批號RR036A-2)；異丙醇、無水乙醇、氯仿(天津富于精細化工有限公司)；苦味酸(北京鑫鼎鵬飛科技發(fā)展有限公司)。

1.3 主要儀器及設備

組織勻漿器(美國Bio-Gen，型號PRO200)；熒光定量PCR儀(美國Bio-Rad公司，型號C1000)；低溫高速離心機(德國Kendro公司，型號D37520)；旋渦振蕩器(美國Coleparmer Votex-Genie)；Airtech超凈工作臺(上海博迅實業(yè)公司)；Bicmate 3S超微量紫外分光光度計(美國Thermo Fisher公司)；X射線輻射儀(美國Faxitron公司，型號RX650)。

1.4 實驗方法

1.4.1 大鼠分組 70只SPF級雄性Wistar大鼠，常規(guī)適應性飼養(yǎng)3 d，觀察無異常者納入實驗組。用5%苦味酸溶液涂染動物背部做標記，查隨機數(shù)字表將其隨機分為10組，1個正常對照組和9個不同劑量，照射后不同時間檢測的輻射組，分別為2 Gy輻射后6 h組、2 Gy輻射后24 h組、2 Gy輻射后48 h組、4 Gy輻射后6 h組、4 Gy輻射后24 h組、4 Gy輻射后48 h組、8 Gy輻射后6 h組、8 Gy輻射后24 h組、8 Gy輻射后48 h組，每組7只。

1.4.2 大鼠飼養(yǎng)條件 大鼠在甘肅中醫(yī)藥大學SPF級實驗動物中心飼養(yǎng)[SPF級實驗動物設施使用證號為SYXK(甘)2015-0005]。動物飼養(yǎng)室環(huán)境：溫度20～25℃、相對濕度40%～70%。

1.4.3 大鼠照射條件 在中國科學院蘭州近代物理研究所X射線輻射儀下進行照射，照射前打開X射線輻射儀并預熱30 min，調(diào)試X射線的劑量率。同時將輻射各組大鼠用10%的水合氯醛腹腔注射麻醉(3 mL/kg)，固定于屏蔽模具內(nèi)，X射線單次照射右肺部。劑量率為0.8 Gy/min，各組吸收劑量分別為2、4、8 Gy。正常對照組的大鼠同步進行相同麻醉，但不予照射。

1.4.4 大鼠肺及腎組織取材 分別于照射后6、24、48 h處死大鼠，取出右肺、左肺、左腎，冰生理鹽水沖洗、剪切，分別放入相應的凍存管，-80 ℃凍存，備用。

1.4.5 大鼠肺及腎組織目的基因mRNA的檢測采用實時熒光定量PCR(quantitative real-time PCR，qPCR)檢測肺和腎組織中Cytc，Caspase-9、Caspase-3、Bax、Bcl-2 mRNA的表達。各目的基因及內(nèi)參引物由上海生工生物工程有限公司設計合成，并在GenBank上核對證實(見表1)。按照Trizol說明書從肺、腎組織中提取總RNA，紫外分光光度計測定吸光度D(260)和D(280)值，取RNA 2 μg加入逆轉(zhuǎn)錄體系，逆轉(zhuǎn)錄條件為 37 ℃ 、 5 min， 85 ℃ 、 5 s， 4 ℃ 、 10 min。 以cDNA為模板，上PCR儀進行擴增。反應體系為SYBR Fast Real-time PCR Mix (2×) 12.5 μL，引物2 μL，cDNA 2 μL，并加滅菌蒸餾水至25 μL。反應條件為95℃、5 s，60 ℃、10 s，循環(huán)40次。用2-△△CT法進行相對定量分析。

表1 各目的基因及內(nèi)參引物序列

1.5 統(tǒng)計學處理

數(shù)據(jù)采用SPSS 20.0軟件進行統(tǒng)計分析，服從正態(tài)-或近似正態(tài)分布的計量資料以x±s表示，組間比較采用單因素方差分析進行處理，兩兩比較時采用SNK法，重復測量設計的計量資料用方差分析，以α=0.05為檢驗水準。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠肺和腎組織中Cytc mRNA相對表達量的比較

右肺、左肺、左腎中，2、4、8 Gy輻射各組Cytc mRNA相對表達量在照射后均明顯升高，與正常對照組相比，差異均有統(tǒng)計學意義(P均＜0.01)。見表2。

表2 各組大鼠肺腎組織中Cytc mRNA相對表達量比較(-x±s，n=7)

2.2 各組大鼠肺腎組織中Caspase-9 mRNA相對表達量的比較

右肺、左肺、左腎中，2、4、8 Gy輻射各組Caspase-9 mRNA相對表達量在照射后均明顯升高，與正常對照組相比，差異均有統(tǒng)計學意義(P均＜0.01)。見表3。

表3 各組大鼠肺腎組織中Caspase-9 mRNA相對表達量的比較，n=7)

表3 各組大鼠肺腎組織中Caspase-9 mRNA相對表達量的比較，n=7)

與正常對照組比較，**P＜0.01.

組別 右肺 左肺 左腎正常對照組 1.00±0.07 1.00±0.06 1.00±0.07 2 Gy輻射后6 h組 3.91±0.73** 2.46±0.50** 2.38±0.76**24 h組 2.41±0.03** 2.39±0.29** 2.50±0.58**48 h組 3.12±0.28** 2.68±0.17** 2.73±0.37**4 Gy輻射后6 h組 3.49±0.06** 2.50±0.59** 2.39±0.49**24 h組 2.60±0.25** 2.59±0.58** 2.53±0.42**48 h組 2.68±0.32** 2.42±0.42** 2.34±0.49**8 Gy輻射后6 h組 2.83± 0.21** 2.36±0.53** 2.36±0.39**24 h組 2.35±0.17** 2.88±0.06** 2.59±0.12**48 h組 4.13±0.50** 2.57±0.60** 3.11±0.37**

2.3 各組大鼠肺腎組織中Caspase-3 mRNA相對表達量的比較

右肺、左肺、左腎中，2、4、8 Gy輻射各組Caspase-3 mRNA相對表達量在照射后均明顯升高，與正常對照組相比，差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05或P＜0.01)。見表4。

表4 各組大鼠肺腎組織中Caspase-3 mRNA相對表達量比較(，n=7)

表4 各組大鼠肺腎組織中Caspase-3 mRNA相對表達量比較(，n=7)

與正常對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01.

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2.4 各組大鼠肺腎組織中Bax m RNA相對表達量的比較

右肺中，除8 Gy輻射后48 h組之外，其余各組Bax mRNA相對表達量在照射后均明顯升高，與正常對照組相比，差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05或P＜0.01)。左肺中，輻射各組Bax mRNA相對表達量在照射后均明顯升高，與正常對照組相比，差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。左腎中，除2 Gy輻射后6 h組之外，其余各組Bax mRNA相對表達量在照射后均明顯升高，與正常對照組相比，差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。見表5。

表5 各組大鼠肺腎組織中Bax mRNA相對表達量比較(，n=7)

表5 各組大鼠肺腎組織中Bax mRNA相對表達量比較(，n=7)

與正常對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01.

組別 右肺 左肺 左腎正常對照組 1.00±0.05 1.00±0.32 1.00±0.12 2 Gy輻射后6 h組 12.14±0.21** 6.37±0.72** 2.04±0.50 24 h組 7.86±0.64** 8.38±0.55** 4.33±1.03**48 h組 7.57±0.48** 7.06±0.82** 4.16±0.58**4 Gy輻射后6 h組 14.72±1.22** 6.25±0.78** 5.70±0.24**24 h組 6.07±0.68** 6.31±1.18** 7.71±2.08**48 h組 9.26±0.91** 7.35±1.31** 7.04±1.67**8 Gy輻射后6 h組 2.44±0.23* 7.41±1.06** 10.03±2.32**24 h組 6.87±0.69** 10.98±1.90** 16.25±0.67**48 h組 1.35±0.45 5.81±0.61** 7.83±0.54**

2.5 各組大鼠肺腎組織中Bcl-2 mRNA相對表達量的比較

右肺、左肺中，2、4、8 Gy輻射各組Bcl-2 mRNA相對表達量在照射后均明顯降低，與正常對照組相比，差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05或P＜0.01)。左腎中，除8 Gy輻射后6 h組之外，其余各組Bcl-2 mRNA相對表達量在照射后均明顯降低，與正常對照組相比，差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05或P＜0.01)。見表6。

表6 各組大鼠肺腎組織中Bcl-2 mRNA相對表達量比較(，n=7)

表6 各組大鼠肺腎組織中Bcl-2 mRNA相對表達量比較(，n=7)

與正常對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01.

組別 右肺 左肺 左腎正常對照組 1.00±0.10 1.00±0.09 1.00±0.09 2 Gy輻射后6 h組 0.50±0.06** 0.62±0.09* 0.61±0.06*24 h組 0.46±0.05** 0.72±0.02* 0.55±0.14*48 h組 0.68±0.02* 0.60±0.09* 0.65±0.09*4 Gy輻射后6 h組 0.58±0.08* 0.75±0.10* 0.56±0.05*24 h組 0.59±0.04* 0.65±0.05* 0.52±0.16*48 h組 0.48±0.05** 0.64±0.09* 0.65±0.08*8 Gy輻射后6 h組 0.55±0.06* 0.58±0.11* 0.81±0.13 24 h組 0.45±0.02** 0.48±0.08** 0.49±0.07**48 h組 0.48±0.09** 0.76±0.08* 0.67±0.05*

3 討論

研究已經(jīng)證實輻射誘發(fā)的體內(nèi)旁效應不僅能在相鄰組織或同一器官的不同部位產(chǎn)生，還可在被屏蔽的某些遠源器官中發(fā)生，即同一機體不同器官之間的旁效應現(xiàn)象[6-7]。也有研究表明，細胞凋亡是輻射旁效應早期的生物學效應[8]，線粒體參與了輻射旁效應的早期過程，Cytc在輻射旁效應信號響應中發(fā)揮了關(guān)鍵作用[9-11]。線粒體是細胞凋亡信號轉(zhuǎn)導途徑中起主要調(diào)節(jié)作用的細胞器，線粒體接受輻射誘導的信號刺激后，對凋亡信號進行整合、處理并釋放內(nèi)外膜間隙的促凋亡因子如Cytc等，激活下游通路中的Caspase家族，使凋亡進入不可逆轉(zhuǎn)的階段[12-13]。Bcl-2家族在此過程中發(fā)揮了重要作用，促凋亡基因Bax可以引起線粒體釋放Cytc，抑凋亡基因Bcl-2可以中和Bax的表達，還可抑制Cytc的釋放，使Cytc無法達到激活下游Caspase的表達閾值，從而保護細胞不發(fā)生凋亡[14-15]。

輻射旁效應依賴的參數(shù)包括輻射劑量、劑量率、劑量分級、輻射質(zhì)量、細胞或組織類及所研究的生物學終點。其中輻射劑量與旁效應水平的研究顯示旁效應損傷的程度存在劑量響應曲線的飽和效應，輻射劑量越高，旁效應損傷不會加重，可能還會因為負反饋調(diào)節(jié)等機制而減輕。但是對放射治療技術(shù)如近距離放射治療、立體定向放射外科手術(shù)、術(shù)中放療及網(wǎng)格療法等應用高劑量的輻射而言，研究旁效應的劑量是非常重要的[16-17]。旁效應的時間效應也未完全清楚，因此，本實驗基于凋亡相關(guān)基因的表達變化探討體內(nèi)旁效應與輻射劑量及輻射后時間的關(guān)系。

實驗結(jié)果顯示，不同劑量的X射線(2、4、8 Gy)照射大鼠右肺后不同時間點(6、24和48 h)，大鼠右肺組織中Cytc、Caspase-9、Caspase-3 mRNA表達均明顯上調(diào)，除8 Gy輻射后48 h組之外，右肺中Bax的表達也明顯上調(diào)，Bcl-2在照射后各個時間點的表達均下調(diào)，表明線粒體響應了輻射誘導的細胞應激，對信號刺激整合判斷后釋放Cytc，Cytc表達增加激活了下游通路中的Caspase-9，進一步激活效應子Caspase-3的表達，誘導細胞凋亡。Caspase-3激活表達后可以酶解滅活Bcl-2，Bcl-2表達下調(diào)，不能中和Bax的表達，Bax表達上調(diào)，促使凋亡發(fā)生。

在左肺組織中，Cytc、Caspase-9、Caspase-3、Bax m RNA表達在照射后各個時間點均明顯上調(diào)，Bcl-2 mRNA表達明顯下調(diào)。在左腎組織中，Cytc、Caspase-9 mRNA表達在照射后各個時間點明顯上調(diào)，除8 Gy輻射后6 h組之外，Bcl-2表達明顯下調(diào)。除2 Gy輻射后6 h組之外，左腎中Bax mRNA表達均明顯上調(diào)，且在照射后24 h達到峰值，48 h有所下降，呈現(xiàn)動態(tài)變化，分析認為可能是受照射后腎臟啟動自我修復機制，對損傷進行修復的原因；8 Gy輻射后的各組Bax表達量最高，與已經(jīng)報道的旁效應的飽和效應存在矛盾，分析認為體內(nèi)旁效應的影響因素非常復雜，與所檢測的生物學終點密切相關(guān)。左腎中不同輻射劑量組Caspase-3 mRNA表達量在照射后各個時間點均明顯高于正常對照組、右肺及左肺的表達量，分析認為可能是Caspase-3的表達水平與組織類型有關(guān)，但是在同樣的組織中，檢測指標不同，旁效應水平又有所變化。

總之，我們的實驗結(jié)果表明未直接照射的左肺和左腎組織也對輻射產(chǎn)生了響應，輻射誘導了體內(nèi)旁效應的產(chǎn)生。不同輻射劑量之間尚未發(fā)現(xiàn)明顯的效應差異，研究中的最低輻射劑量和最高輻射劑量均可誘導旁效應的發(fā)生，這與國內(nèi)外研究報道類似，無論何種射線照射，旁效應存在劑量響應曲線的飽和效應[18-19]。右肺、左肺、左腎組織中，Cytc、Caspase-9、Bcl-2未發(fā)現(xiàn)一致的表達規(guī)律和動態(tài)變化的特點，我們分析認為輻射旁效應的時間效應受多種因素的影響，也因檢測指標的不同而不同，故照射后各個時間點之間未發(fā)現(xiàn)明顯的效應差異。但是Bax在旁器官腎臟中的表達不符合飽和效應，且出現(xiàn)了動態(tài)變化的特點；Caspase-3在腎臟中的表達明顯高于對照組、右肺、左肺的表達量，因而在體內(nèi)旁效應中，輻射劑量、組織類型和所檢測的指標是不可忽略的影響因素，在臨床放療時，要綜合各種影響因素評判射線對正常組織的損傷。

綜上所述，不同劑量X射線照射大鼠右肺后誘導出現(xiàn)了線粒體凋亡通路中相關(guān)基因的異常表達，未照射左肺及左腎組織也呈現(xiàn)相似的基因表達變化，表明未直接照射組織也對輻射產(chǎn)生了響應，輻射誘導了體內(nèi)旁效應的發(fā)生，但其具體的發(fā)生機制仍需進一步研究。

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