劉 芳 秦雙紅 趙燕霞

（1．第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院皮膚科，陜西西安710032；2．第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院病理科，陜西西安 710032；3．解放軍第518醫(yī)院，陜 西西安 710043）

肝細(xì)胞肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC)在全球最常見的惡性腫瘤中排名第5，每年有超過70萬的新發(fā)病例，年死亡人數(shù)高達(dá)25萬人[1-2]。 既往研究[3-4]認(rèn)為，HCC的發(fā)生、發(fā)展多由于遺傳與環(huán)境因素間相互作用，是一個(gè)由多誘因、多基因參與、多步驟調(diào)控的復(fù)雜過程，但其具體的發(fā)生機(jī)制仍不明確。肝癌的發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜，但是肝癌與脂代謝的研究已成為近年來人們關(guān)注的焦點(diǎn)。

肝細(xì)胞內(nèi)中性脂質(zhì)(neutral lipids)主要貯存在脂滴(lipid droplet，LD)中。現(xiàn)有研究表明，脂滴并非僅僅是細(xì)胞內(nèi)一個(gè)簡單的能量貯存器，而是一個(gè)復(fù)雜、活動旺盛、動態(tài)變化的多功能細(xì)胞器，可能在脂質(zhì)代謝、儲存、轉(zhuǎn)運(yùn)、蛋白降解及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中起著重要的作用[5-6]。作為脂質(zhì)中心及能量代謝的樞紐，脂滴的生物學(xué)研究越來越受到學(xué)者們的重視。肝臟是人體最重要脂肪代謝器官，大多數(shù)內(nèi)源性脂質(zhì)和載脂蛋白均由肝臟合成，正常生理?xiàng)l件下維持脂代謝的穩(wěn)態(tài)。固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白-1c(sterol regulatory element binding protein-1c，SREBP-1c)是肝臟內(nèi)脂肪合成基因的重要轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，近年來研究發(fā)現(xiàn)其在調(diào)控肝癌等多種腫瘤脂肪代謝方面發(fā)揮著重要的作用[7-9]。因此，我們通過應(yīng)用慢病毒載體構(gòu)建SREBP-1c 過表達(dá)細(xì)胞模型，為今后進(jìn)一步研究脂滴代謝對HCC 生物學(xué)行為的影響及分子機(jī)制提供基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)工具。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 質(zhì)粒、菌株和細(xì)胞 慢病毒載體系統(tǒng)購自美國Addgene網(wǎng)站，包括psPAX2(Addgene plasmid 12260)、pmD2.G(Addgene plasmid 12259)；質(zhì)粒pLenti6.3/V5、pENTRTM- 3C、重組酶(Gateway LR ClonaseTMII)和大腸桿菌DH5α購自Invitrogen公司；Blasticidin購自Sigma 公司。質(zhì)粒pLenti 6.3-mCherry由第四軍醫(yī)大學(xué)生化教研室惠贈。質(zhì)粒pCMV5-HA-SREBP-1c由清華大學(xué)生命科學(xué)院周林康博士惠贈。293T細(xì)胞及小鼠肝癌HepG2細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 主要酶和試劑 Taq酶、限制性內(nèi)切酶EcoR I、Not I、T4 DNA連接酶、DNA marker和Prime STAR②Max DNA Polymerase均購自TaKaRa公司。脂質(zhì)體Lipofectamine 2000購自Invitrogen公司。小提質(zhì)粒試劑盒和膠回收試劑盒購自寶生物工程大連有限公司。

1.2 方法

1.2.1 SREBP-1c基因的提取及鑒定 按照SREBP-1c基因序列(GenBank登錄號NM 011480.3)，設(shè)計(jì)SREBP-1c全長的引物，由北京奧科生物技術(shù)公司合成。序列如下：F，5′-CGGAATTCATGGACGAGCTGG CCTTC-3′(EcoR I，劃線部分為酶切位點(diǎn))；R，5′-ATAAGAATGCGGCCGCCTAGCTGGAAGTGACGGT CCT-3′(Not I，劃線部分為酶切位點(diǎn))。以質(zhì)粒pCMV5-HA-SREBP-1c為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)，62 ℃退火15 s。PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳鑒定，然后按照膠回收試劑盒說明書回收DNA片段。用EcoR I和Not I分別對SREBP-1c和質(zhì)粒pENTRTM-3C進(jìn)行雙酶切。酶切產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析后，將目的和載體片段進(jìn)行膠回收，用T4 DNA連接酶連接，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)菌。收集菌體沉淀，按質(zhì)粒小提試劑盒說明書提取質(zhì)粒，酶切鑒定。經(jīng)過酶切鑒定的陽性克隆，送北京奧科生物技術(shù)公司進(jìn)行測序。

1.2.2 重組慢病毒載體pLenti6.3-SREBP-1c的構(gòu)建及包裝 對測序正確的質(zhì)粒pENTR-3C-SREBP-1c進(jìn)行載體重組。將pENTR-3C-SREBP-1c質(zhì)粒和目的載體pLenti6.3用LR ClonaseTMII酶和蛋白酶K在37 ℃孵育。電泳鑒定后將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)

細(xì)菌，小量培養(yǎng)篩選出菌株。按質(zhì)粒小提試劑盒說明書提取質(zhì)粒，酶切鑒定。北京奧科生物技術(shù)公司測序鑒定。將鑒定正確的重組質(zhì)粒pLenti6.3-SREBP-1c 4 μg、PsPAX2 3 μg、pmD2.G 1 μg的混合液與Lipofectamine 2000溶液輕柔混勻，待其形成DNA-脂質(zhì)體復(fù)合物后，共轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞中。37 ℃孵育48 h后收集上清液，使用0.45 μm濾器過濾，收集病毒上清液，計(jì)算pLenti6.3-SREBP-1c病毒液的滴度后分裝-80 ℃保存。同樣方法制備慢病毒對照組pLenti6.3-mCherry。

1.2.3 篩選穩(wěn)定表達(dá)SREBP-1c和mCherry的HepG2細(xì)胞 將HepG2細(xì)胞鋪于6孔板中，使細(xì)胞密度為2×105/mL，培養(yǎng)至細(xì)胞匯合度達(dá)到30%～50%時(shí)開始進(jìn)行病毒感染，將病毒液和高糖DMEM培養(yǎng)液按1∶1 比例混合，每孔加入2 mL混合培養(yǎng)液。先用帶有紅色熒光的pLenti6.3-mCherry病毒上清分別按不同濃度加入每孔細(xì)胞培養(yǎng)液中，感染48 h，熒光顯微鏡下觀察紅色熒光蛋白的表達(dá)，以估測感染效率。用感染效率最高且對細(xì)胞狀態(tài)影響最小的病毒量感染靶細(xì)胞。2 d后更換為含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，待細(xì)胞長滿后加入含有3 μg/mL Blasticidin的培養(yǎng)液2 mL，每3～4 d更換該培養(yǎng)液直至陰性對照孔細(xì)胞全部死亡。經(jīng)過10～14 d的篩選后，我們獲得了穩(wěn)定表達(dá)SREBP-1c的HepG2細(xì)胞株，同法篩選穩(wěn)定表達(dá)mCherry 的HepG2細(xì)胞株。

1.2.4 Real-time PCR檢測SREBP-1c mRNA的表達(dá)

根據(jù)目的基因設(shè)計(jì)Real-time PCR引物，引物由北京奧科生物技術(shù)公司合成，序列如下：F，5′-GGAGCCA TGGATTGCACATT-3′；R，5′-GCTTCCAGAGAGGAG GCCAG-3′。按照RNA提取試劑盒說明書提取細(xì)胞總RNA，用Prime Script RT試劑盒將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA為模板進(jìn)行熒光定量PCR，檢測SREBP-1c mRNA表達(dá)量的變化，確認(rèn)SREBP-1c過表達(dá)的細(xì)胞株。應(yīng)用SYBR?Premix Ex TaqTMII(Perfect Real Time)試劑盒進(jìn)行Real-time PCR。按SYBR?Premix Ex TaqTMII(2×) 12.5 μL，PCR 上、下游引物(10 μmol/L)各1μL，cDNA 1 μL，dH2O(滅菌蒸餾水)9.5 μL，總體系25μL配制PCR反應(yīng)液(反應(yīng)液配制在冰上進(jìn)行，以兩步法進(jìn)行PCR擴(kuò)增，95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃、5 s，60℃、30 s，72 ℃、30 s，40個(gè)循環(huán)，最后60 ℃延伸30 s，相對定量計(jì)算公式：倍數(shù)變化=2－△△CT。

1.2.5 Western blot檢測SREBP-1c蛋白的表達(dá)水平

將HepG2細(xì)胞、轉(zhuǎn)染SREBP-1c和mCherry的HepG2細(xì)胞分別接種到25 cm2的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中(約106個(gè)細(xì)胞)。培養(yǎng)至細(xì)胞匯合度約90%后吸棄培養(yǎng)液，0.25%胰蛋白酶消化收集并用PBS洗滌1次。加入RIPA細(xì)胞裂解液冰浴裂解細(xì)胞，4 ℃、12 000 r/min離心5 min，取上清。用Bio-Rad Protein Assay進(jìn)行蛋白定量。稀釋至同樣濃度后加入1×上樣緩沖液，煮沸變性。隨后取30 μg總蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳分離，接著將蛋白電轉(zhuǎn)至PVDF膜上，將PVDF膜浸于含5%脫脂奶粉的PBST中，室溫?fù)u床上緩搖封閉1 h。封閉后用PBST緩沖液洗滌3次，每次5 min。相應(yīng)的一抗以1∶1 000稀釋，將膜置于一抗中4 ℃過夜。次日，室溫復(fù)溫1 h，用PBST洗膜3次，每次5 min。再加入二抗，以1∶5 000稀釋，將膜置于二抗中室溫?fù)u床上緩搖1 h。用PBST緩沖液洗滌3次，每次5 min。ECL顯色液顯影，壓X光膠片，常規(guī)顯影定影。

1.2.6 檢測SREBP-1c過表達(dá)對HepG2細(xì)胞內(nèi)脂滴的

影響 在穩(wěn)定表達(dá)SREBP-1c及陰性對照的HepG2細(xì)胞中加入200 μmol/L的油酸刺激24 h后檢測脂滴：①Hoechst 33258細(xì)胞核染色。先將1 mg的Hoechst 33258溶解于5 mL的0.01 mol/L PBS中，配制成儲存液，終濃度為500 mg/L；使用時(shí)用PBS以1∶50～1∶100稀釋后染色細(xì)胞，37 ℃ 作用10 min，PBS洗3次，每次5 min。②Bodipy 493/503中性脂質(zhì)染色。首先將1 mg的Bodipy 493/503溶解于1 mL的無水乙醇中，配制成終濃度為1 mg/mL的儲存液；使用時(shí)用PBS以1∶100稀釋后染色細(xì)胞，37 ℃ 作用10 min，PBS洗3次，每次5 min。防熒光淬滅封片劑封片，采圖。③肝細(xì)胞內(nèi)甘油三酯含量的測定。吸棄培養(yǎng)液，用PBS洗滌細(xì)胞兩遍，然后加入胰酶消化細(xì)胞，再用含有10%胎牛血清的培養(yǎng)液終止消化，并均勻吹打細(xì)胞，將各孔細(xì)胞懸液分別移入離心管中，采用Folch法抽提脂肪，利用氮?dú)飧稍镉袡C(jī)相，用1 mL氯仿/甲醇(2∶1)重新溶解。利用薄層色譜法分離甘油三酯，標(biāo)準(zhǔn)品通過Bio-Rad公司的圖像采集系統(tǒng)和Quantity One軟件進(jìn)行定量分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果

2.1 載體pENTR-3C-SREBP-1c的構(gòu)建和鑒定

以質(zhì)粒pCMV5-HA-SREBP-1c為模板，進(jìn)行PCR反應(yīng)后得到3 406 bp (SREBP-1c全長)片段(圖1)，連接進(jìn)入pENTRTM-3C質(zhì)粒中，陽性克隆用EcoR I和Not I雙酶切鑒定后送測序。測序結(jié)果顯示與GenBank 公布序列一致。

圖1 PCR擴(kuò)增SREBP-1c基因電泳結(jié)果

2.2 重組載體pLenti6.3-SREBP-1c的構(gòu)建和鑒定

進(jìn)一步將構(gòu)建成功的pENTR-3C-SREBP-1c質(zhì)粒和pLenti6.3質(zhì)粒進(jìn)行重組，EcoR I和Not I雙酶切鑒定后送測序(圖2)。測序結(jié)果證明我們成功的構(gòu)建了pLenti6.3-SREBP-1c的全長質(zhì)粒。

圖2 慢病毒載體的PCR鑒定

2.3 重組慢病毒的PCR擴(kuò)增鑒定

將重組后的慢病毒載體及包裝質(zhì)粒利用Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，分別于轉(zhuǎn)染24和48 h后收集上清培養(yǎng)液，過濾后得到重組慢病毒。同法制備mCherry對照組病毒懸液，包裝成功的293T細(xì)胞可見紅色熒光蛋白表達(dá)。收集培養(yǎng)皿中的細(xì)胞，提取RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA后以此為模板擴(kuò)增獲得SREBP-1c寡核苷酸序列(圖3)。

2.4 建立穩(wěn)定表達(dá)SREBP-1c的HepG2肝癌細(xì)胞株

為了排除病毒系統(tǒng)對肝細(xì)胞的影響，我們構(gòu)建了SREBP-1c穩(wěn)定表達(dá)的HepG2細(xì)胞系。加入含有10 μg/mL Blasticidin的DMEM培養(yǎng)液1 d后，各組細(xì)胞開始出現(xiàn)死亡。10 d左右，陰性對照組細(xì)胞全部死亡，pLenti6.3-SREBP-1c和pLenti6.3-mCherry均有少量細(xì)胞存活，繼續(xù)篩選至14 d，此時(shí)收集細(xì)胞。以pLenti6.3-mCherry為對照組，Western blot結(jié)果顯示，pLenti6.3-SREBP-1c慢病毒感染的HepG2細(xì)胞內(nèi)SREBP-1c的蛋白表達(dá)水平比對照組提高3.2倍。Real-time PCR的結(jié)果證實(shí)，在SREBP-1c穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中，SREBP-1c的mRNA水平較對照組升高了約11.4倍(P＜0.01，見圖4)。這些均證明我們成功構(gòu)建了SREBP-1c穩(wěn)定表達(dá)的HepG2細(xì)胞株。

圖3 重組慢病毒的PCR鑒定

2.5 SREBP-1c過表達(dá)對HepG2細(xì)胞內(nèi)脂滴的影響

Bodipy493/503熒光染料顯示肝細(xì)胞中的脂滴，結(jié)果發(fā)現(xiàn)SREBP-1c過表達(dá)能夠明顯增加肝細(xì)胞內(nèi)脂滴的數(shù)量和大小。肝細(xì)胞內(nèi)甘油三酯定量結(jié)果顯示，其甘油三酯含量是對照組的3.2倍(P＜0.01，見圖5)。

3 討論

脂代謝與多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路密切相關(guān)，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長、增殖、分化、凋亡、炎癥、運(yùn)動及膜平衡[10]。脂代謝紊亂可以改變細(xì)胞膜的構(gòu)成及通透性，導(dǎo)致多種疾病的發(fā)生和發(fā)展[11]， 如腫瘤[12]、 糖尿病[13]、心臟病[14]等 。Ackerman等[15]研究發(fā)現(xiàn)脂肪酸代謝能為腫瘤的發(fā)生發(fā)展提供賴以生存的微環(huán)境。同時(shí)，也有研究表明脂代謝異常參與調(diào)控多種腫瘤的惡性表型[16]。

HCC是全球高發(fā)病率和死亡率的惡性腫瘤之一。最近研究表明，非酒精性脂肪肝，特別是非酒精性肝炎與HCC的發(fā)生密切相關(guān)[17-18]。這些數(shù)據(jù)提示HCC中肝細(xì)胞脂質(zhì)代謝異常，脂質(zhì)代謝紊亂可能是HCC發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一[19]。

脂滴作為脂代謝的核心細(xì)胞器，能夠特異地儲存中性脂質(zhì)，其數(shù)目和大小與脂代謝的平衡有著十分密切的關(guān)系。脂代謝的調(diào)控十分復(fù)雜，與多條信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路密切相關(guān)。其中，固醇調(diào)節(jié)原件結(jié)合蛋白(SREBPs)在調(diào)節(jié)脂肪細(xì)胞合成、脂肪酸自穩(wěn)態(tài)和組織細(xì)胞脂肪沉積方面起著關(guān)鍵作用[20-21]，SREBPs高表達(dá)可以導(dǎo)致脂肪合成相關(guān)酶基因高表達(dá)，造成脂肪在非脂肪組織中堆積。SREBPs由Briggs等[22]在1993年首次發(fā)現(xiàn)，并且成功分離。SREBPs是具有“堿性螺旋-環(huán)-螺旋-亮氨酸拉鏈”(basic h elix-loop- h elix-leucine z ipper，bHLH-ZIP)結(jié)構(gòu)的核轉(zhuǎn)錄因子超家族，廣泛分布于哺乳動物的肝臟、白色脂肪組織、腎上腺及乳腺組織等處[23]。迄今為止，在哺乳動物中發(fā)現(xiàn)SREBPs包含SREBP-1a， SREBP-1c及 SREBP-2三 種 異 構(gòu) 體 。 其中，SREBP-1c作用于脂肪酸合成酶等靶基因，主要負(fù)責(zé)調(diào)控游離脂肪酸和甘油三酯的生物合成。Beatrice等[8]發(fā)現(xiàn)SREBP-1c通過激活A(yù)kt/mTORC1信號通路調(diào)控脂質(zhì)合成，影響腫瘤細(xì)胞的生長和生存。

圖4 攜帶SREBP-1c的慢病毒在HepG2細(xì)胞中的表達(dá)

圖5 SREBP-1c過表達(dá)對HepG2細(xì)胞內(nèi)脂滴的影響

因此，我們構(gòu)建和使用攜帶SREBP-1c序列的慢病毒，感染HepG2細(xì)胞，建立SREBP-1c基因過表達(dá)細(xì)胞模型。經(jīng)Real-time PCR鑒定，篩選出來的過表達(dá)細(xì)胞株SREBP-1c的mRNA水平升高了約11.4倍。Western blot發(fā)現(xiàn)過表達(dá)細(xì)胞株SREBP-1c蛋白水平比對照組提高3.2倍。免疫熒光顯示過表達(dá)SREBP-1c能夠明顯增加HepG2細(xì)胞內(nèi)脂滴的數(shù)量和大小，細(xì)胞內(nèi)甘油三酯定量結(jié)果顯示其甘油三酯含量明顯升高。本文通過成功構(gòu)建的SREBP-1c過表達(dá)細(xì)胞模型，為今后進(jìn)一步研究脂滴代謝在調(diào)控HCC脂肪代謝過程中的作用和分子機(jī)制提供了重要的研究工具。

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