王若珺 李若瑜

(北京大學第一醫(yī)院皮膚性病科 北京大學真菌和真菌病研究中心 皮膚病分子診斷北京市重點實驗室，北京 100034)

皮膚是人體與外界環(huán)境的重要屏障，寄居著豐富的微生物群落，包括細菌、真菌、病毒等，通常不具有致病性，起到抵御外界病原微生物侵入、防止水分丟失等作用。在濕潤、干燥、脂溢性等不同環(huán)境的皮膚部位，微生物的群落構(gòu)成具有很大差異[1]。隨著對真菌內(nèi)基因組轉(zhuǎn)錄間隔區(qū) (internal transcribed spacer, ITS)高通量測序研究的深入，真菌微生態(tài)與皮膚疾病之間的關(guān)系逐漸引起人們重視。目前已證實，在銀屑病、特應(yīng)性皮炎、脂溢性皮炎等皮膚疾病中，皮膚真菌微生態(tài)會出現(xiàn)變化。本文將就皮膚正常真菌微生態(tài)構(gòu)成、微生態(tài)研究方法學以及真菌微生態(tài)與皮膚疾病間關(guān)系3方面分別進行綜述。

1 皮膚正常真菌微生態(tài)

皮膚表面的正常細菌和真菌菌群相對穩(wěn)定[1]。按照生理學特征可將皮膚分為四類：濕潤 (肘窩、腘窩、腹股溝、手指縫、足趾縫和鼻孔)、干燥 (前臂、小魚際、臀部)、脂溢 (鼻唇溝、面頰、眉心、外耳道、耳后皺襞、枕后、胸骨柄和后背)和足趾甲[2]。既往對皮膚細菌微生態(tài)的研究顯示，正常的細菌群落主要由厚壁菌門 (Firmicutes)、變形菌門 (Proteobacteria)、擬桿菌門 (Bacteroidetes)和放線菌門 (Actinobacteria)構(gòu)成[2]。細菌微生態(tài)的復(fù)雜性和穩(wěn)定性在不同皮膚部位差別很大，而不同個體相似的生理環(huán)境中微生態(tài)群落構(gòu)成相似。例如，外耳道和耳后等脂溢性環(huán)境主要為葡萄球菌和丙酸桿菌，而腋下、腹股溝等濕潤環(huán)境則主要為棒狀桿菌[2]。

真菌培養(yǎng)已經(jīng)證實，人類正常皮膚中存在馬拉色菌屬、念珠菌屬等多種真菌。馬拉色菌屬 (Malasseziaspp.)是人體皮膚最常見的正常寄生菌，具有親脂性，生長需要皮脂腺分泌的脂質(zhì)化合物，在前額、前臂、腹股溝、耳后、肘窩等部位含量最豐富[3]。馬拉色菌包括糠秕馬拉色菌 (M.furfur)、合軸馬拉色菌 (M.sympodialis)、球形馬拉色菌 (M.globosa)、限制馬拉色菌 (M.restricta)、厚皮馬拉色菌 (M.furfur)等14個菌種，其中11種參與人體皮膚微生態(tài)構(gòu)成[4]。馬拉色菌屬不同分離株的生長速度不同，糠秕馬拉色菌和球形馬拉色菌生長速度快，實驗室分離率高，曾被認為是皮膚中含量最豐富菌種。既往的定量培養(yǎng)方法顯示，后背皮膚糠秕馬拉色菌含量較高，頭皮和前額皮膚球形馬拉色菌含量較高[5]。然而，近年的分子學研究則發(fā)現(xiàn)，皮膚中的含量最豐富的為球形馬拉色菌和限制馬拉色菌，含量遠高于糠秕馬拉色菌[6-8]。進一步微生態(tài)分析證實，手臂、足部、軀干和頭面部等不同部位的皮膚中，馬拉色菌屬的結(jié)構(gòu)有明顯區(qū)別，但不同個體的相同身體部位差別不大[4]。在外耳道、耳后和前額皮膚中，限制馬拉色菌含量最豐富，后背、枕后部和腹股溝區(qū)球形馬拉色菌最豐富，鼻孔、肘窩等其他身體部位則為馬拉色菌的混合菌種，而足部的真菌構(gòu)成多樣化，包括馬拉色菌、曲霉 (Aspergillus)、隱球菌 (Cryptococcus)、紅酵母 (Rhodotorula)和附球菌 (Epicoccum)等[4]。

2 皮膚真菌微生態(tài)的研究方法

與皮膚的細菌微生態(tài)相比，真菌微生態(tài)的研究難度更大，其原因主要有3方面因素：①真菌在皮膚中的含量遠低于細菌，難以獲得充分樣本量。②人類細胞DNA會污染樣本，干擾特異性區(qū)段的擴增。③真菌具有堅固的細胞壁，難以破壞細胞壁并提取出高質(zhì)量遺傳物質(zhì)，其難度遠高于細菌和人類細胞[9]。皮膚取材的方法包括拭子擦取和刀片刮取，有時需要使用擦拭-刮取-擦拭等組合方法。為獲得最大微生物量，通常取材前12～24 h內(nèi)不允許洗浴或使用潤膚劑。取材后的樣本應(yīng)凍存于-20℃或-80℃條件。DNA提取需要使用較強的物理方式裂解真菌，常用滾珠和酶混合裂解方法。目前針對真菌微生態(tài)的DNA提取步驟尚缺少方法學上的對照研究[9]。

真菌菌種的分子鑒定基于高通量測序方法，目前常用的測序區(qū)段包括18S rRNA區(qū)和位于18S、5.8S和28S rRNA區(qū)內(nèi)的ITS區(qū)[10]。以全基因組DNA為模板，應(yīng)用聚合酶鏈式反應(yīng) (polumerase chain reaction, PCR)擴增上述區(qū)段，可得到數(shù)百萬至數(shù)億條序列，根據(jù)95%～99%相似度分類至種水平的分類操作單位 (operational taxonomic units, OTUs)，與Pubmed等數(shù)據(jù)庫進行人工比對，即可通過DOTUR等軟件分析樣本微生物的結(jié)構(gòu)[2]。微生物群落的豐度 (richness)和均衡度 (evenness)可以用香農(nóng)多樣性指數(shù) (Shannon’s diversity index)表示，其他分析方法還包括：β多樣性，用于樣品兩兩之間的比較分析，衡量不同樣本間的變化；排序分析，包括主成分分析 (principal component analysis, PCA)和主坐標分析 (principal coordinates analysis, PCoA)，用于研究樣本間相似性和差異性；聚類分析，通過繪制熱圖 (heatmap)，提示樣本間菌屬菌落構(gòu)成的相似性；物種進化樹的樣本群落分布圖，可將不同樣本的構(gòu)成在物種進化分類樹中顯示，提示樣本間的進化關(guān)系。此外，宏基因組測序能夠反映樣本中功能基因的構(gòu)成[1-2]。

3 真菌微生態(tài)與皮膚疾病

既往對人體腸道、口腔等器官的微生態(tài)研究已證實，真菌微生態(tài)的改變與多種疾病的發(fā)生相關(guān)。例如，腸道內(nèi)真菌菌落結(jié)構(gòu)和細菌結(jié)構(gòu)密切關(guān)聯(lián)，真菌菌落的變化會引起腸壁中炎癥反應(yīng)增強，誘發(fā)炎癥性腸病[11]；口腔黏膜真菌微生態(tài)發(fā)生變化與慢性黏膜念珠菌感染有關(guān)[12]。隨著皮膚真菌微生態(tài)研究的深入，已證實皮膚真菌的菌落構(gòu)成改變與多種炎癥性、感染性皮膚疾病的發(fā)生相關(guān)。

特應(yīng)性皮炎是由皮膚干燥及屏障功能受損所導(dǎo)致的慢性瘙癢性皮膚炎癥性疾病。既往對細菌16s rRNA DNA區(qū)的測序分析結(jié)果顯示，特應(yīng)性皮炎患者皮膚中細菌群落結(jié)構(gòu)發(fā)生紊亂，細菌微生態(tài)的整體多樣性降低，葡萄球菌屬相對增多，特別是金黃色葡萄球菌比例明顯增加，并且與特應(yīng)性皮炎嚴重程度正相關(guān)[13]。金黃色葡萄球菌可通過產(chǎn)生肽鏈形成生物膜形成定植，以及釋放δ-毒素誘導(dǎo)肥大細胞脫顆粒誘發(fā)皮膚過敏反應(yīng)[14-16]。對特應(yīng)性皮炎患者皮膚樣本中真菌D1/D2 LSU rDNA的序列分析研究顯示，患者皮膚中馬拉色菌屬仍為主要菌屬，占63.2%～72.7%，其中限制馬拉色菌和球形馬拉色菌在患者和健康人中含量均最高，而二者的含量比在不同嚴重程度患者皮膚中具有差異，其中輕度特應(yīng)性皮炎患者最高[含量比=(3.1～3.4)∶1]，高于中度和重度特應(yīng)性皮炎患者[含量比分別為 (2.1～4.1)∶1和 (1.1～1.4)∶1][17]。此外，患者皮膚中非馬拉色菌屬酵母菌的多樣性增加，并且與病情嚴重程度呈正比，其中白念珠菌、阿薩希毛孢子菌、異常維克漢姆酵母等酵母菌在患者中檢出率增高。主坐標分析顯示，健康人、輕中度患者和重度患者在PCoA維度上具有差異，說明真菌微生態(tài)的改變與疾病嚴重程度相關(guān)[17]。

銀屑病是慢性炎癥性皮膚疾病，病因包括遺傳易感性和環(huán)境暴露等。既往皮膚細菌微生態(tài)的研究已證實，銀屑病的發(fā)生與溶血性鏈球菌定植和葡萄球菌超抗原激活T淋巴細胞相關(guān)，而其他可能的相關(guān)微生物還包括金黃色葡萄球菌、馬拉色菌、白念珠菌和人乳頭瘤病毒等[18]。Alekseyenk等[18]研究顯示，銀屑病患者皮膚細菌微生態(tài)的豐度及均衡度均較正常人降低 (P<0.01)，β多樣性分析則顯示患者皮損處的微生態(tài)組內(nèi)差異高于健康對照，提示患者皮膚的壓力環(huán)境會對正常菌群進行篩選。另一項基于鳥槍法宏基因組學測序 (shotgun metagenomics sequencing)的研究發(fā)現(xiàn)，銀屑病與葡萄球菌含量增加相關(guān)，并且兩株含葡萄球菌分泌抗原基因的菌株在病損部位含量豐富[19]。迄今為止，僅有1項針對銀屑病皮膚真菌微生態(tài)的研究，結(jié)果顯示，銀屑病皮損部位的真菌微生態(tài)的整體豐度升高，而馬拉色菌含量較正常對照降低，且球形馬拉色菌和限制馬拉色菌在患者皮膚中含量偏低，真菌菌落結(jié)構(gòu)PCoA分析顯示銀屑病患者與健康人群具有差異[20-21]。此外，研究顯示馬拉色菌定植水平與銀屑病面積與嚴重程度指數(shù)評分 (psoriasis area and severity index, PASI)無明顯相關(guān)性[22]。

脂溢性皮炎是一種常見的皮膚疾病，表現(xiàn)為紅斑上覆著油膩的黃色鱗屑、結(jié)痂，常累及頭皮、耳后、眉弓、鼻唇溝和前胸等皮脂腺豐富部位。既往基于培養(yǎng)的研究認為糠秕馬拉色菌為脂溢性皮炎的主要致病菌，而分子學研究則顯示，與脂溢性皮炎的發(fā)生相關(guān)的真菌主要是球形馬拉色菌和限制馬拉色菌，并且與其中特定亞種相關(guān)[23]。對脂溢性皮炎患者頭皮皮膚的高通量測序研究證實，患者和健康對照頭皮中含量最高的真菌分別是擔子菌和子囊菌，但患者子囊菌門的支頂孢屬和青霉菌屬的含量明顯升高[24]。Soares等[25]研究發(fā)現(xiàn)，脂溢性皮炎患者皮損中限制馬拉色菌含量最高，球形馬拉色菌次之，合軸馬拉色菌、厚皮馬拉色菌僅在少數(shù)樣本中測出，另有3個新馬拉色菌屬種型與脂溢性皮炎的發(fā)生有關(guān)。令人意外的是，糠秕馬拉色菌遺傳物質(zhì)在皮膚中含量較低，甚至在部分標本中通過高通量測序方法未被檢出，但可能受到取材方法等因素影響。[25]。此外，馬拉色菌菌種水平微生態(tài)結(jié)構(gòu)相近的樣本，亞種水平構(gòu)成仍有較大區(qū)別，但亞種與疾病間關(guān)系尚需進一步研究[25]。

痤瘡為人類最常見的皮膚疾病，以往認為，革蘭陽性親脂性的痤瘡丙酸桿菌是導(dǎo)致痤瘡發(fā)生的關(guān)鍵因素。微生態(tài)研究顯示，痤瘡丙酸桿菌是未治療痤瘡患者和健康人皮膚表面含量最豐富的細菌，系統(tǒng)使用異維A酸或抗生素治療后，其含量顯著下降[26]。然而，Dreno等[27]進行的另一項微生態(tài)分析顯示，患者面部的痤瘡丙酸桿菌的相對含量反而較健康對照低，僅占細菌菌群的不到2%，而葡萄球菌在患者痤瘡、膿皰等病損部位的含量較高，與疾病嚴重度正相關(guān)。除丙酸桿菌和葡萄球菌外，馬拉色菌在所有痤瘡炎性皮損處中均可檢測到，是痤瘡中真菌菌群的主要成分，其中限制馬拉色菌含量最高，提示馬拉色菌可能與痤瘡的產(chǎn)生有關(guān)[28]。此外，Barnard等[29]的宏基因組學研究顯示，痤瘡患者皮膚微生態(tài)中各功能基因間的相互平衡性起到重要作用，其作用甚至高于某些單一菌株的作用。

皮膚慢性潰瘍在糖尿病、老年人和免疫受損患者等人群中具有較高致殘率和致死率。微生態(tài)分析顯示，在皮膚慢性傷口中，細菌微生態(tài)穩(wěn)定性降低則愈合速度加快，截肢、傷口惡化或骨髓炎等臨床并發(fā)癥減少；系統(tǒng)性使用抗生素可使微生態(tài)穩(wěn)定性降低，促進愈合[30-31]。此外，皮膚慢性傷口的真菌微生態(tài)在不同時間和個體中也具有顯著差異，并可提示疾病預(yù)后。傷口真菌微生態(tài)子囊菌比例升高，愈合時間延長；而出現(xiàn)截肢等臨床并發(fā)癥時，真菌微生態(tài)豐度和穩(wěn)定性均升高，這可能是由于微生態(tài)穩(wěn)定性高伴隨生物膜形成，導(dǎo)致愈合不良[32]。

除上述皮膚疾病外，Gupta等[33]對花斑糠疹中馬拉色菌的研究顯示，與正常皮膚相比，皮損處球形馬拉色菌、合軸馬拉色菌和糠秕馬拉色菌的分離率提高。實時定量熒光PCR分析顯示，花斑糠疹皮損處檢出率最高的馬拉色菌種分別為球形馬拉色菌 (95.8%)、限制馬拉色菌 (91.7%)和合軸馬拉色菌 (50.0%)，均明顯高于正常皮膚[34]。然而目前尚無針對花斑糠疹的細菌和真菌微生態(tài)研究。

4 總結(jié)與展望

人類與細菌、真菌、病毒等微生物的群落長期處于共生關(guān)系，微生物在人體生理和免疫功能等方面都發(fā)揮重要作用。近年來，皮膚微生態(tài)的研究發(fā)展迅速，已有較多研究證實細菌微生態(tài)與多種炎癥性疾病、感染性疾病的發(fā)生和慢性傷口的愈合有關(guān)。

真菌的微生態(tài)研究僅在最近幾年才開始引起重視。目前皮膚真菌微生態(tài)的研究尚存在取材、DNA提取等方法學上的困難，需要進一步優(yōu)化研究方法，以得到準確、可靠的數(shù)據(jù)。皮膚的微生態(tài)環(huán)境中，真菌與細菌之間具有復(fù)雜的相互作用。目前研究已證實，包括馬拉色菌在內(nèi)的多種真菌菌落構(gòu)成會對銀屑病、特應(yīng)性皮炎、脂溢性皮炎等疾病產(chǎn)生影響，但仍需要更多的大規(guī)模對照研究證實。

此外，皮膚真菌感染是常見的皮膚科疾病，皮膚癬菌病、花斑糠疹、黏膜念珠菌病等感染性疾病的發(fā)生與真菌微生態(tài)之間的關(guān)系也逐漸引起學者重視。皮膚和黏膜的真菌感染常見于免疫功能受損人群，例如，HIV感染患者口腔內(nèi)的細菌菌群結(jié)構(gòu)改變，穩(wěn)定性降低，而真菌菌群多樣性提高，念珠菌、曲霉等機會致病菌含量增多，可能與慢性黏膜真菌感染有關(guān)[35]。白念珠菌通過細胞膜Dectin-1蛋白識別，經(jīng)SYK和CARD9途徑介導(dǎo)產(chǎn)生炎癥反應(yīng)[36-37]。研究已證實，dectin-1缺陷小鼠腸道內(nèi)念珠菌含量提高，其他酵母菌減少，并且腸道炎癥反應(yīng)增強，提示真菌微生態(tài)的改變與炎癥性腸病的產(chǎn)生密切相關(guān)[38]。HIV感染患者以及先天性CARD9、DECTIN1基因缺陷等免疫受損的患者，皮膚真菌微生態(tài)的改變與疾病發(fā)生的關(guān)系有待未來進一步研究。