姜富貴+韓紅+陳雪梅+李祥明+盛清凱

摘要：為了研究乳酸菌和納豆芽孢桿菌對霉菌毒素的吸附作用，采用L9（34）正交試驗設計，研究不同菌濃度、環(huán)境溫度及吸附時間對吸附作用的影響。結果表明，乳酸菌和納豆芽孢桿菌對黃曲霉毒素B1和伏馬毒素B1的吸附作用主要受菌濃度的影響（P<0.05），溫度和時間對吸附強度無顯著影響。濃度為1×109 CFU/mL時，乳酸菌對黃曲霉毒素B1的吸附強度（18.02%）顯著高于納豆芽孢桿菌（13.88%）（P<0.05），對伏馬毒素B1的吸附強度（13.45%）顯著低于納豆芽孢桿菌（17.62%）（P<0.05）。建議提高菌群數(shù)量及種類以去除飼料中霉菌毒素的危害。

關鍵詞：乳酸菌；納豆芽孢桿菌；黃曲霉毒素B1；伏馬毒素B1；吸附作用

中圖分類號：S182文獻標識號：A文章編號：1001-4942（2018）01-0127-05

Abstract To investigate the adsorption of Lactobacillus and Bacillus natto on mycotoxin， the L9（34） orthogonal experimental design method was used to study the effects of different bacterial concentrations， environmental temperatures and times on adsorption in this experiment. The results showed that the adsorption of Lactobacillus and Bacillus natto on aflatoxin B1 and fumonision B1 were mainly affected by their concentrations （P<0.05）， but not significantly affected by adsorption time and environmental temperature. The adsorption intensity of Lactobacillus on aflatoxin B1 （18.02%） was higher than that of Bacillus natto （13.88%） at the concentration of 1×109 CFU/mL， whereas that of Lactobacillus on fumonision B1 （13.45%） was lower than that of Bacillus natto （17.62%） （P<0.05）. So increasing the amounts and species of microorganisms should be proposed to reduce the risk of mycotoxin in feed.

Keywords Lactobacillus； Bacillus natto； Aflatoxin B1； Fumonision B1； Adsorption

霉菌毒素是一類在霉菌生長過程中產(chǎn)生的有毒次級代謝產(chǎn)物[1]。動物飼喂霉菌毒素污染的飼料，會出現(xiàn)急性或慢性中毒癥狀，包括動物生長受到抑制，飼料利用率降低，動物產(chǎn)仔數(shù)、禽類產(chǎn)蛋率和孵化率下降等[2]。發(fā)酵脫毒法對飼料營養(yǎng)成分的損失小，是應用前景非常廣闊的一種生物解毒方法，存在微生物吸附作用、酶降解作用以及有機酸抑制作用三種作用方式[3]，但發(fā)揮生物脫毒主效作用的方式到目前為止仍不清楚。雖然國家飼料添加劑品種目錄（2013）規(guī)定飼料中可以允許添加的微生物有30多種，但具體哪種微生物的脫毒效果最好也難以判定。因此，本研究選取在飼料中常見且對動物和人影響較大的黃曲霉毒素B1和伏馬毒素B1為研究對象，探索飼料中常用的乳酸菌和納豆芽孢桿菌對兩種霉菌毒素的吸附作用，以及環(huán)境溫度和吸附時間對吸附作用的影響，旨在為去除飼料中的霉菌毒素提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

乳酸菌（植物乳桿菌）和納豆芽孢桿菌（枯草芽孢桿菌），由山東省農業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所提供。黃曲霉毒素B1（AFB1）和伏馬毒素B1（FB1），購自上海優(yōu)甘生物科技有限公司。AFB1和FB1檢測試劑盒，購自ROMER國際貿易北京有限公司。

1.2 試驗設計與方法

試驗采用L9（34）正交試驗設計（詳見表1）。分別取不同濃度菌溶液3 mL放入5 mL離心管中，然后于4℃冷凍離心機10 000×g離心10 min。棄去上清液，在沉淀的菌泥中加入3 mL滅菌生理鹽水，然后輕輕吹打、混勻。向各離心管中分別加入50 μL霉菌毒素溶液（AFB1濃度為2 μg/mL，F(xiàn)B1濃度為50 μg/mL），混勻，在不同試驗溫度和160 r/min振蕩條件下，培養(yǎng)相應時間。試驗結束后，樣品在4℃冷凍離心機10 000×g離心10 min，取出上清液，采用酶聯(lián)免疫法測定霉菌毒素量，計算吸附強度。每試驗重復3次，每次采樣后平行3次測定。

吸附強度（%）=（1-上清液中霉菌毒素的量/試驗前加入量）×100。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用SAS 9.1的PROC GLM過程分析各處理組的吸附強度，采用student-t檢驗進行比較，使用SAS程序的CORR過程對相關系數(shù)進行分析，P<0.05為差異顯著。

2 結果與分析

2.1 乳酸菌濃度、溫度及時間對AFB1吸附強度的影響

由表2可以看出，乳酸菌對AFB1的吸附強度在不同濃度間有顯著差異（P<0.05），不同溫度間和不同時間都沒有顯著差異（P﹥0.05）。乳酸菌濃度越高對AFB1的吸附強度越大。對AFB1吸附強度影響最強的因素是乳酸菌濃度，其次是時間，溫度的影響最小。endprint

2.2 乳酸菌濃度、溫度及時間對FB1吸附強度的影響

由表3可以看出，3種濃度乳酸菌對FB1的吸附有顯著影響（P<0.05），乳酸菌濃度越高對FB1的吸附強度越大。對FB1吸附強度影響最強的因素是乳酸菌濃度，其次是溫度和時間。

2.3 納豆芽孢桿菌濃度、溫度及時間對AFB1吸附強度的影響

由表4可以看出，3種濃度納豆芽孢桿菌對AFB1的吸附有顯著影響（P<0.05），納豆芽孢桿菌濃度越高對AFB1的吸附強度越大。對AFB1吸附強度影響最強的因素是納豆芽孢桿菌濃度，其次是時間和溫度。

2.4 納豆芽孢桿菌濃度、溫度及時間對FB1吸附強度的影響

由表5可以看出，3種濃度納豆芽孢桿菌對FB1的吸附有顯著影響（P<0.05），納豆芽孢桿菌濃度越高對FB1的吸附強度越大。對FB1吸附強度影響最強的因素是納豆芽孢桿菌濃度，其次是時間和溫度。

2.5 兩種菌之間不同影響因素對不同毒素吸附影響的比較

由表6看出，菌種濃度為1×109 CFU/mL時，乳酸菌對AFB1的吸附強度顯著高于納豆芽孢桿菌（P<0.05），對FB1的吸附強度顯著低于納豆芽孢桿菌（P<0.05）；菌種濃度為1×108、1×107 CFU/mL時，乳酸菌對AFB1和FB1的吸附強度均顯著高于納豆芽孢桿菌（P<0.05），表明菌種的吸附與菌種種類和濃度相關。

由表7看出，乳酸菌和納豆芽孢桿菌之間菌種濃度對于AFB1、FB1吸附強度k值的相關系數(shù)都大于0.9900，溫度在0.8941～0.9684，而時間的相關系數(shù)最小，表明這兩種菌在同等濃度、同樣溫度的條件下對同種毒素有相似的吸附，同樣的吸附時間可能存在差異。

3 討論與結論

吸附是指物質（主要是指固體物質）表面吸住周圍介質（液體或氣體）中分子或離子的現(xiàn)象。依據(jù)吸附劑與吸附質之間作用力的性質，吸附可分為物理吸附和化學吸附。物理吸附不具選擇性，吸附作用力為范德華力，且不受溫度影響；而化學吸附具選擇性，吸附劑只對某些吸附質產(chǎn)生吸附作用[4]。本試驗中乳酸菌和納豆芽孢桿菌對AFB1、FB1的吸附受溫度影響小，且對不同霉菌毒素吸附強度不同，推斷乳酸菌和納豆芽孢桿菌的吸附可能以物理吸附為主[5]。微生物細胞壁主要由甘露聚糖、葡聚糖和蛋白質等組成，含有-COOH、-NH2、-SH、-OH等官能團，這些物質中的氮、氧、硫等原子都可以提供孤對電子與霉菌毒素配位。目前未見納豆芽孢桿菌對霉菌毒素的吸附報道。本試驗中乳酸菌吸附AFB1的結果與Zeng等[6]、Khanafari等[7]和Huang等[8]一致，但與殷傳振[9]結果不同，原因在于殷傳振[9]是混合菌發(fā)酵處理，非單一菌的吸附試驗。本試驗乳酸菌吸附對FB1的吸附結果與Zhao等[10]和Zhang等[11]相同。乳酸菌、納豆芽孢桿菌吸附霉菌毒素，這可能與微生物吸附重金屬鎘[12]、塑化劑[13]等相似，不同之處在于吸附強度存在差異。

本試驗中對霉菌毒素吸附的主要影響因素為菌種濃度，其次為溫度和時間，這與馮艷忠[14]結果相似。本試驗結果顯示乳酸菌和納豆芽孢桿菌這兩種微生物對AFB1和FB1這兩種霉菌毒素的作用相似，不過本試驗擴大了微生物種類和霉菌毒素種類。乳酸菌與納豆芽孢桿菌對AFB1和FB1吸附強度的差異，可能源自乳酸菌與納豆芽孢桿菌的細菌表層結構差異[15]以及AFB1、FB1的分子量、結構不同。菌種濃度為1×109 CFU/mL時乳酸菌對FB1的吸附強度低于納豆芽孢桿菌，而1×108 CFU/mL時高于納豆芽孢桿菌，其原因是否與兩種菌的次級代謝物差異有關有待研究。

本試驗中乳酸菌、納豆芽孢桿菌吸附霉菌毒素，為霉菌毒素脫毒及降解創(chuàng)造了條件。盡管霉菌毒素被吸附后其危害仍然存在[16]，但乳酸菌、納豆芽孢桿菌和蒙脫石等吸附劑[17]一樣有助于霉菌毒素的體外排泄，減緩霉菌污染飼料的毒性。另外納豆芽孢桿菌等的吸附還可能促進霉菌毒素與微生物分泌的酶制劑的接觸，有利于霉菌毒素的酶解[18，19]。本試驗中乳酸菌對AFB1的吸附強度為18.02%，低于發(fā)酵飼料的脫毒比例[3]，表明吸附作用在生物脫毒中處于次要、輔助作用，微生物分泌酶的酶解可能為主要作用。飼料發(fā)酵過程中乳酸菌、納豆芽孢桿菌等擴繁，細菌數(shù)量不斷增加，同時其分泌的霉菌毒素降解酶含量也同時增加，吸附和酶解二者之間的共同作用有待進一步研究。

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