王玉+黃顯德+魏代福+溫亮+楊舉田+陳秀齋+田延平

摘要：采用RT-PCR方法擴增馬鈴薯Y病毒（Potato virus Y，PVY）衣殼蛋白（coat protein，CP）基因，將其連接到原核表達載體pEHISTEV上，獲得重組質(zhì)粒pEHISTEV-PVY-CP，轉(zhuǎn)化大腸桿菌Rosetta，經(jīng) IPTG誘導后，可以表達出分子量為35 kD的融合蛋白。切膠回收融合蛋白，免疫新西蘭大耳兔制備PVY CP抗血清。間接ELISA結(jié)果表明，該抗血清的效價為1∶16384，Western blot分析表明該抗血清只與感染PVY的普通煙植株有特異性反應，而與健康普通煙和感染PVX的普通煙植株無反應。本研究為PVY的血清學檢測以及早期預警奠定了基礎。

關鍵詞：馬鈴薯Y病毒；衣殼蛋白；原核表達；抗血清制備

中圖分類號：S532：Q786 文獻標識號：A文章編號：1001-4942（2018）01-0111-04

Abstract The coat protein （CP） gene of Potato virus Y （PVY） was amplified by RT-PCR and was cloned into prokaryotic expression vector pEHISTEV to produce recombinant plasmid pEHISTEV-PVY-CP， which was transformed into competent cells of Escherichia coli strain Rosetta， and a 35 kD fusion protein was expressed after induced by IPTG. The fusion protein was cut from the gel and used as antigen to immunize rabbits for production of polyclonal antiserum against the PVY CP. The titer of the resultant antiserum was 1∶16384 in ELISA. In Western blot assay， the antiserum showed specific positive reaction only with Nicotiana tabacum plants infected with PVY， but not with healthy Nicotiana tabacum plants or those infected with Potato virus X. The results laid bases for serological test and early warning work of PVY.

Keywords Potato virus Y； Coat protein； Prokaryotic expression； Antiserum preparation

馬鈴薯Y病毒（Potato virus Y，PVY）是危害馬鈴薯、煙草等茄科植物的主要病毒之一。PVY侵染馬鈴薯可引起葉脈壞死、褐脈、黃斑壞死等癥狀，導致馬鈴薯減產(chǎn)80%以上[1-3] ，對生產(chǎn)造成嚴重的損失；PVY侵染煙草后可造成煙葉產(chǎn)量損失達20%～50%，嚴重時可造成絕收[4，5]。PVY自1931年首次在馬鈴薯中發(fā)現(xiàn)以來，已在全球廣泛傳播[6]。20世紀 90 年代初， PVY 在中國及亞洲地區(qū)周邊國家呈上升發(fā)展趨勢，目前該病毒在世界各地均有發(fā)生[7-10]。

馬鈴薯Y病毒（Potato virus Y，PVY）屬于馬鈴薯Y病毒屬（Potyvirus），主要由蚜蟲以非持久方式傳播。病毒粒體為彎曲線狀，無包膜，大小約11 nm×700～900 nm，基因組為長約10 kb的正單鏈RNA，通過多聚蛋白策略編碼1個多聚蛋白，經(jīng)蛋白酶切割后形成10個蛋白，PVY 基因組內(nèi)還有一個由移碼翻譯產(chǎn)生的PIPO蛋白，通過這兩種方式最后形成11個成熟的多功能蛋白[11-14]。

目前，血清學方法由于具有操作簡單、特異性強、靈敏度較高等特點而被廣泛應用于病毒病的快速檢測。本試驗，我們選用質(zhì)粒 pEHISTEV構(gòu)建PVY CP的原核表達載體并在大腸桿菌中高效表達，通過免疫新西蘭大耳兔制備相應的特異性抗血清，以期為 PVY檢測和預警奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

菌株Escherichia coli DH5α、Rosetta （DE3）由本實驗室保存，原核表達載體pEHISTEV由英國安德魯斯大學劉煥庭老師惠贈；反轉(zhuǎn)錄酶、Taq DNA聚合酶、限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶、無RNA酶的水等均購自TaKaRa公司；植物總RNA提取試劑盒TRIzol、DNA凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒購自北京全式金公司；硝酸纖維素膜為 PallGelman 公司產(chǎn)品；堿性磷酸酯酶標記的羊抗兔IgG、辣根過氧化物酶標記的鼠抗兔IgG、弗氏完全佐劑及不完全佐劑購自Sigma 公司；Western blot 所用蛋白Marker 購自Thermo公司；IPTG、DTT、KCl 等試劑為國產(chǎn)分析純。

1.2 試驗方法

1.2.1 原核表達載體的構(gòu)建 根據(jù)PVY-N605（GenBank序列號：X97895）基因組序列設計引物擴增PVY CP基因。正向引物為PVY-CP-NcoⅠ-F：5′-CAT GCC ATG GCT TGG AAT GCA ACA ATC GAT GCA G-3′，下劃線部分為NcoⅠ酶切位點；反向引物為PVY-CP-BamHⅠ-R：5′-CGC GGA TCC TTA CAT GTT CTT CAC TCC AAG TAG AGT ATG C-3′，下劃線部分為BamHⅠ酶切位點。以本實驗室采集的感染PVY的普通煙葉片為材料，參照TransZol 試劑盒說明書提取葉片總RNA。以總RNA 為模板，在隨機引物的引導下利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成第一鏈 cDNA。利用引物PVY-CP-NcoⅠ-F和PVY-CP-BamHⅠ-R，以cDNA為模板進行PCR，擴增CP基因。PCR反應程序：98℃預變性30 s；98℃ 10 s，64.8℃ 20 s，72℃ 30 s，30個循環(huán)；72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，使用DNA凝膠回收試劑盒回收目的片段。endprint

將目的片段和pEHISTEV分別用NcoⅠ和BamHⅠ雙酶切，利用T4 DNA連接酶進行連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E. coli DH5α感受態(tài)細胞，篩選陽性克隆送濟南博尚公司測序驗證。序列正確的重組質(zhì)粒命名為pEHISTEV-PVY-CP。

1.2.2 目的基因的誘導表達 將pEHISTEV-PVY-CP轉(zhuǎn)化大腸桿菌Rosetta，涂布到含50 mg/L卡那霉素的LB平板上。挑取單菌落接種到含50 mg/L卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)過夜。取1 mL培養(yǎng)液稀釋于100 mL含50 mg/L卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃、150 r/min培養(yǎng)至OD600≈0.6。IPTG終濃度設0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mmol/L 5個處理，于28℃、150 r/min誘導4 h。取誘導菌液1 mL，12 000 r/min離心2 min，加適量TE緩沖液（pH值8.0）振蕩懸浮，再加入等體積的2×SDS上樣緩沖液，100℃煮沸5 min后進行SDS-PAGE電泳。通過比較蛋白表達量，篩選最佳IPTG濃度。誘導時間設1、2、3、4、5 h和6 h共6個處理，在最佳IPTG濃度下，篩選最適誘導時間。

1.2.3 抗血清的制備、效價及特異性的測定 通過SDS-PAGE電泳對原核表達產(chǎn)物進行分離，用冰冷的0.25 mol/L KCl和1 mmol/L DTT染色，切取乳白色目的條帶，加入適量0.9%生理鹽水在滅菌的研缽中研磨。采用皮下多點注射的方法免疫新西蘭大耳兔，初次免疫用等體積的弗氏完全佐劑乳化，之后改用弗氏不完全佐劑。每隔一周免疫一次，免疫劑量為3 mL，共免疫4次。第四次免疫后一周取血，通過離心分離血清。

取PVY接種的普通煙葉片，按1∶10（W/V）抗原包被緩沖液（0.05 mol/L碳酸鹽緩沖液，pH值9.6），充分研磨后8 000～10 000 r/min離心2 min，取上清包被酶聯(lián)板，每孔100 μL。以用同樣的方法處理的健康普通煙葉片作為陰性對照，以0.05 mol/L碳酸鹽緩沖液為空白對照?？寡灏凑?∶26～1∶215進行梯度稀釋。利用ELISA法測定抗血清效價。顯色后使用酶標儀讀取405 nm的OD值，I（待測樣品讀數(shù)-空白讀數(shù)）/ H（陰性樣品讀數(shù)-空白讀數(shù)）≥3為陽性反應。

以感染PVY的普通煙葉片為檢測對象，健康普通煙葉片為陰性對照，同時以感染馬鈴薯X病毒（PVX）的普通煙葉片為對照，參照Towbin等[11]的方法進行Western blot，分析抗血清的特異性。

2 結(jié)果與分析

2.1 PVY CP基因的克隆

利用引物PVY-CP-NcoⅠ-F和PVY-CP-BamHⅠ-R通過PCR擴增得到825 bp的CP基因。純化回收后用NcoⅠ和BamHⅠ雙酶切，克隆到同樣酶切處理的pEHISTEV載體中，獲得重組質(zhì)粒pEHISTEV-PVY-CP。通過PCR擴增和測序證明其開放閱讀框正確。

2.2 PVY CP誘導表達和SDS-PAGE分析

將pEHISTEV-PVY-CP轉(zhuǎn)化大腸桿菌Rosetta，菌液經(jīng)不同濃度IPTG和時間誘導后，進行SDS-PAGE分析。結(jié)果表明，與未誘導菌液相比，包含pEHISTEV-PVY-CP的Rosetta菌液在不同的IPTG濃度及時間段下均表達出約35 kD的蛋白條帶（圖1、2），與預期大小一致，說明PVY CP在大腸桿菌中得到了正確表達。在IPTG終濃度為0.2～1.0 mmol/L時，隨著IPTG濃度的增加，PVY CP表達量無顯著差異（圖1），我們選擇IPTG終濃度為0.2 mmol/L。在IPTG終濃度為0.2 mmol/L、誘導時間為1～6 h情況下，隨著誘導時間的增長，目的蛋白的表達量增加（圖2），我們將誘導時間定為6 h。

2.3 抗血清效價

從SDS-PAGE凝膠中切下目的蛋白條帶，經(jīng)乳化后免疫新西蘭大耳兔，獲得PVY CP 抗血清。以感染PVY的普通煙葉片為材料，以健康普通煙葉片為陰性對照，利用ELISA測定抗血清效價。結(jié)果表明，當病汁液稀釋10倍，抗血清稀釋16 384倍時仍呈現(xiàn)明顯的陽性反應，而稀釋32 768倍時檢測結(jié)果為陰性，說明抗血清的效價為1∶16384（表1）。

2.4 抗血清特異性檢測

Western blot結(jié)果顯示，所制備的PVY CP抗血清僅與感染PVY的普通煙樣品發(fā)生特異性反應，而與健康普通煙葉片或感染PVX的普通煙樣品均無反應（圖3），說明制備的血清有良好的特異性M：蛋白分子質(zhì)量標準；1：PVY侵染的普通煙葉片；2：PVX侵染的普通煙葉片；3：健康的普通煙葉片。

3 討論與結(jié)論

馬鈴薯Y病毒是危害馬鈴薯和煙草的主要病毒之一。除單獨侵染外，在自然環(huán)境中PVY還常與煙草蝕紋病毒（TEV）、煙草脈帶花葉病毒（TVBMV）、馬鈴薯X病毒（PVX）等復合侵染[15-17]。與TMV和PVX相比，PVY在植株內(nèi)的積累水平較低，不易獲得大量提純病毒，且利用常規(guī)方法提取植物病毒時不能完全排除寄主蛋白，用這樣的病毒制劑制備的血清容易產(chǎn)生假陽性。本研究利用大腸桿菌表達的PVY CP制備了抗血清，該抗血清效價為1∶16384，只與PVY有特異性反應，與健康植株和PVX無反應，并且與寄主蛋白也無反應，說明獲得的抗血清效價高、特異性好，為PVY的快速檢測和早期預警奠定了良好的基礎。

參 考 文 獻：

[1] Whitworth J L， Nolte P， Mcintosh C， et al. Effect of Potato virus Y on yield of three potato cultivars grown under different nitrogen levels[J]. Plant Disease，2006， 90（1）：73-76.endprint

[2] Nolte P， Whitworth J L， Thornton M K， et al. Effect of seedborne Potato virus Y on performance of Russet Burbank， Russet Norkotah， and Shepody potato[J]. Plant Disease， 2007， 88（3）：248-252.

[3] Glais L， Tribodet M， Kerlan C. Genomic variability in Potato potyvirus Y （PVY）： evidence that PVYNW and PVYNTN variants are single to multiple recombinants between PVYO and PVYN isolates[J]. Archives of Virology， 2002， 147（2）：363-378.

[4] 陳瑞泰， 朱賢朝， 王智發(fā)，等. 全國16個主產(chǎn)煙?。▍^(qū)）煙草侵染性病害調(diào)研報告[J]. 中國煙草科學， 1997， 18（4）：1-7.

[5] 白金鎧. 煙草病害防治圖冊[M]. 沈陽：遼寧科學技術出版社， 1993.

[6] Smith K M. On the composite nature of certain potato virus diseases of the mosaic group as revealed by the use of plant indicators and selective methods of transmission[J]. Astrophys. J.， 1931， 245：66-71.

[7] Beczner L， Horvath J， Romhanyi I， et al. Studies on the etiology of tuber necrotic ringspot disease in potato[J]. Potato Research， 1985， 27（3）：339-352.

[8] Wang F， Wu Y H， Gao Z L， et al. First report of Potato virus Y in Kalimeris indica in China[J]. Plant Disease， 2012， 96（12）：1827.

[9] Ogawa T， Tomitaka Y， Nakagawa A， et al. Genetic structure of a population of Potato virus Y inducing potato tuber necrotic ringspot disease in Japan； comparison with North American and European populations[J]. Virus Research， 2008， 131（2）：199.

[10]孫琦， 張春慶. PVYN與PVY0病毒RT-PCR快速檢測體系研究[J]. 中國農(nóng)業(yè)科學， 2005， 38（1）：213-216.

[11]高芳鑾， 常飛， 沈建國， 等. PVYNTN-NW榆林分離物的全基因組序列測定與分析 [J]. 中國農(nóng)業(yè)科學， 2015， 48（2）： 270-279.

[12]Chung B Y W， Miller W A， Atkins J F， et al. An overlapping essential gene in the Potyviridae [J]. Proceedings of the National Academy of Sciences， 2008， 105（15）： 5897-5902.

[13]Revers F， Le Gall O， Candresse T， et al. New advances in understanding the molecular biology of plant/potyvirus interactions [J]. Molecular Plant-Microbe Interactions， 1999， 12（5）： 367-376.

[14]高芳鑾， 沈建國， 史鳳陽，等. 馬鈴薯Y病毒pipo基因的分子變異及結(jié)構(gòu)特征分析[J]. 遺傳， 2013， 35（9）：1125-1134.

[15]蔡海林， 何命軍， 謝鵬飛，等. 煙草馬鈴薯Y病毒病的生物防治研究進展[J]. 湖南農(nóng)業(yè)科學， 2012（15）：76-79.

[16]蘭玉菲， 劉金亮， 高瑞，等. 煙草脈帶花葉病毒cp基因的原核表達及抗血清制備[J]. 植物病理學報， 2007，37（5）：461-466.

[17]Shew H D， Lucas G B. Compendium of tobacco diseases [M]. Minnesota：APS Press， 1991.endprint