尚衛(wèi)瓊+段志芬+楊毅堅(jiān)+李友勇+成浩+劉杰+楊興榮+楊盛美+矣兵+劉本英+畢曉清

摘要：豐富的遺傳變異對(duì)提高作物的環(huán)境適應(yīng)性和加快遺傳改良進(jìn)度至關(guān)重要。為進(jìn)一步了解云南大葉茶種質(zhì)資源的遺傳多樣性，利用28對(duì)SSR引物對(duì)94份大葉茶種質(zhì)材料進(jìn)行遺傳多樣性分析，結(jié)果共檢測(cè)到等位基因128個(gè)，平均每個(gè)位點(diǎn)為4.57個(gè)；Shannon信息指數(shù)（I）在0.91～1.66之間，最小為5087位點(diǎn)0.91，最大為1696位點(diǎn)1.66，平均每個(gè)位點(diǎn)為1.30；多態(tài)性信息含量（PIC）數(shù)值在0.476～0.753之間，最小為5087位點(diǎn)0.476，最大為1696位點(diǎn)0.753，平均值為0.64；平均觀測(cè)雜合度和平均期望雜合度分別為0.71、0.70。通過對(duì)94份供試材料來源地遺傳分化分析和聚類分析表明，材料的遺傳變異主要存在于不同來源地之間而非同一來源地內(nèi)。并且多數(shù)同一來源的材料分散在不同類群中，材料來源地間遺傳距離與地理距離不存在顯著的相關(guān)性。研究認(rèn)為，聚類結(jié)果與多態(tài)性信息含量等參數(shù)值分析結(jié)果一致，表現(xiàn)出豐富的遺傳多樣性。這可為云南茶樹資源的育種和創(chuàng)新利用提供研究基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：云南；大葉茶 ； EST-SSR；分子標(biāo)記

中圖分類號(hào)：S571.1文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A文章編號(hào)：1001-4942（2018）01-0016-07

Abstract Abundant genetic variation is very important for improving environmental adaptability and genetic improvement of crop. In order to know the genetic diversity of Daye tea germplasm resources in Yunnan， 94 tea germplasms were selected for the analysis using 28 pairs of SSR primers.A total of 128 distinctive loci were detected with the mean as 4.57； the Shannons information index （I） ranged from 0.91 to 1.66 with the mean as 1.30， and 0.91 and 1.66 were in the loci 5087 and 1969 respectively； the polymorphism information content （PIC） ranged from 0.476 to 0.753 with the mean as 0.64，and 0.476 and 0.753 were also in the loci 5087 and 1696 respectively； the average observed heterozygosity and the average expected heterozygosity were 0.71 and 0.70 respectively. The results of genetic differentiation analysis and cluster analysis for the source areas of 94 tea germplasms showed that genetic variation mainly existed between the germplasms from different source areas but not from the same source area， and most germplasms from the same source area distributed in different groups；there was no significant correlation between the genetic distance and the geographical distance. It was concluded that the cluster analysis and the analysis of PIC had the same results， which showed abundant genetic diversity. These results could provide research foundations for breeding， innovation and utilization of Yunnan tea germplasms.

Keywords Yunnan； Daye tea； EST-SSR； Molecular marker

茶樹種質(zhì)資源是茶樹育種、遺傳研究和生產(chǎn)利用的物質(zhì)基礎(chǔ)。云南具有十分豐富和多樣化的生物種質(zhì)資源，還是世界茶樹起源中心和茶樹多樣性分布中心[1]，其茶樹種質(zhì)資源共涉及茶組植物35個(gè)種3個(gè)變種（其中26個(gè)種為云南獨(dú)有），種類和類型約占世界茶樹種類的74.5%。目前，共保存有山茶科山茶屬茶組植物28個(gè)種3個(gè)變種共計(jì)2 157份茶樹種質(zhì)資源，它們具有明顯的地域特色，多以云南特有的大葉茶資源為主，也包括一些中小葉種、小葉種、野生資源和特有地方品種資源。

種質(zhì)資源的科學(xué)鑒定和評(píng)價(jià)是優(yōu)異資源發(fā)掘和利用的前提。分子標(biāo)記作為以生物體的遺傳物質(zhì)DNA的多態(tài)性為基礎(chǔ)的遺傳標(biāo)記在茶樹資源遺傳多樣性分析中被廣泛運(yùn)用[2]，主要包括RFLP、RAPD、AFLP、SSR、SCAR、ISSR等技術(shù)。EST-SSR技術(shù)是在SSR標(biāo)記基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種新的標(biāo)記技術(shù)，除了具有SSR標(biāo)記[3-5]的特點(diǎn)外，還有成本低、通用性好、條帶清晰、帶形容易統(tǒng)計(jì)等優(yōu)點(diǎn)[6]。在茶樹遺傳多樣性、指紋圖譜、分子鑒別等研究上得到很好應(yīng)用，證明是一種非常有效、可靠的分子技術(shù)[7]。云南作為大葉茶種質(zhì)資源最豐富的地區(qū)，可為分析茶樹的遺傳多樣性和茶樹育種提供物質(zhì)基礎(chǔ)和廣闊的利用空間，其中一些特殊的茶樹資源是學(xué)術(shù)研究的重要課題。周萌等[8]對(duì)云南地區(qū)100份野生和22份茶樹品系進(jìn)行遺傳多樣性分析，結(jié)果表明云南野生茶樹品系具有豐富的遺傳多樣性；劉本英等[9]對(duì)云南的134份茶樹資源進(jìn)行遺傳多樣性和親緣關(guān)系分析，結(jié)果各茶組間也表現(xiàn)出豐富的遺傳多樣性，這都可為云南茶樹育種提供一定的理論基礎(chǔ)。但是就目前而言，利用DNA分子標(biāo)記在云南茶樹種質(zhì)資源上的研究報(bào)道尚為數(shù)不多，對(duì)優(yōu)異資源的篩選還主要單純依賴茶樹生化成分分析，這對(duì)茶樹育種起到嚴(yán)重的滯后作用。本試驗(yàn)通過選擇包括云南不同地區(qū)94份大葉茶種質(zhì)資源為材料，利用28對(duì)SSR引物對(duì)其進(jìn)行遺傳多樣性和親緣關(guān)系分析，以期進(jìn)一步了解云南大葉茶各地區(qū)的種質(zhì)資源信息，為后期的優(yōu)良種質(zhì)資源收集、保護(hù)和利用提供科學(xué)依據(jù)。endprint

1 材料與方法

1.1 材料

在“國(guó)家種質(zhì)勐海茶樹分圃”內(nèi)選擇具有代表性的大葉茶資源材料94份，采其新梢一芽二葉4～5枝，放置于預(yù)先標(biāo)號(hào)且裝有干燥硅膠的自封袋中，-80℃冰箱保存?zhèn)溆?。供試材料的基本信息見?。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取 將各份供試材料分別進(jìn)行打樣磨碎，采用改良的CTAB法[10]提取基因組DNA。利用0.8%瓊脂糖凝膠電泳和Nanodrop 2000分光光度計(jì)測(cè)定DNA的純度和濃度，稀釋至20 ng/μL，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 SSR引物及PCR擴(kuò)增 28對(duì)SSR引物用于樣品材料的擴(kuò)增，其序列參照文獻(xiàn)[11]～[14]。所有引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。PCR擴(kuò)增反應(yīng)在PTC-200型PCR儀上進(jìn)行，反應(yīng)體系為10 μL，包括上下游引物各0.2 μL，10×Buffer（Mg2+）1 μL，dNTP 0.2 μL，Taq酶0.5 U，加ddH2O至10 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃ 3 min；94℃ 30 s，退火30 s，72℃ 30 s，30個(gè)循環(huán)；72℃ 10 min，4℃保存。PCR產(chǎn)物用10%聚丙烯酰胺凝膠在電泳儀上進(jìn)行電泳檢測(cè)，電壓170 V，時(shí)間120 min。銀染顯色，使用凝膠成像儀拍照記錄。

1.2.3 數(shù)據(jù)處理 電泳圖上的條帶處理參照張成才等[15]的方法，將電泳圖上的條帶由大到小按照A、B、C、D、E等依次賦值，缺失條帶以“-”表示，統(tǒng)計(jì)樣品材料的基因型。使用Popgene Ver.1.32軟件計(jì)算每對(duì)引物的觀測(cè)等位基因數(shù)（Na）、觀測(cè)雜合度（Ho）、期望雜合度（He）、Shannon 信息指數(shù)（I）和Fit、Fis、Fst等數(shù)值。其中，F(xiàn)it指計(jì)算出的基因型的實(shí)際頻率與理論期望頻率在所在群體中的偏離程度，F(xiàn)is指基因型的實(shí)際頻率與理論期望頻率在亞群體（居群間或物種間）中的偏離程度，F(xiàn)st表示亞群體之間的遺傳分化程度。根據(jù)公式Nm=0.25×（1-Fst）/Fst計(jì)算放映基因流強(qiáng)度（Nm）。通過PIC-CALC0.6計(jì)算各位點(diǎn)的多態(tài)性信息含量（PIC，polymorphism information content），分子系統(tǒng)樹狀圖采用非加權(quán)配對(duì)平均算術(shù)法（UPGMA）聚類分析構(gòu)建，分析其遺傳多樣性和親緣關(guān)系。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同來源大葉茶資源材料的遺傳多樣性分析

運(yùn)用28對(duì)SSR引物對(duì)94份云南地區(qū)大葉茶資源的遺傳多樣性進(jìn)行分析，測(cè)定其等位基因數(shù)、Shannon信息指數(shù)、觀測(cè)雜合度、期望雜合度和多態(tài)性信息含量數(shù)值。圖1為28對(duì)引物中編號(hào)5122擴(kuò)增產(chǎn)物的聚丙烯酰胺電泳圖。28對(duì)引物在94份個(gè)體中的遺傳多樣性分析結(jié)果見表2。共檢測(cè)出128個(gè)觀測(cè)等位基因，每個(gè)位點(diǎn)擴(kuò)增出的等位基因數(shù)在3～6個(gè)之間，平均每個(gè)位點(diǎn)為4.57個(gè)。Shannon信息指數(shù)（I）在0.91～1.66之間，最小為5087位點(diǎn)0.91，最大為1696位點(diǎn)1.66，平均每個(gè)位點(diǎn)為1.30，除5087位點(diǎn)Shannon信息指數(shù)小于1以外，其它位點(diǎn)值都大于1。觀測(cè)雜合度（Ho）數(shù)值在0.41～0.98之間，最小為1696位點(diǎn)0.41，最大為5115位點(diǎn)0.98，平均值為0.71。期望雜合度（He）數(shù)值在0.53～0.78之間，最小為5087位點(diǎn)0.53，最大為1696位點(diǎn)0.78，平均值為0.70。多態(tài)性信息含量（PIC）數(shù)值在0.476～0.753之間，最小為5087位點(diǎn)0.476，最大為1696位點(diǎn)0.753，平均值為0.643。期望雜合度（He）作為度量群體遺傳多樣性水平的重要參數(shù)，在28個(gè)位點(diǎn)中，平均觀測(cè)雜合度值略大于期望雜合度。12個(gè)位點(diǎn)（4119、5061、5129、1696、1926、5017、2049、5123、1051、5073、1651、E-140）的觀測(cè)雜合度數(shù)值低于期望雜合度數(shù)值。3個(gè)位點(diǎn)（1916、5129、1696）的等位基因數(shù)為6個(gè)，說明在群體遺傳結(jié)構(gòu)中有較高的重要性，而5087位點(diǎn)的等位基因數(shù)為3個(gè)，具有較低的遺傳重要性。多態(tài)性信息含量（PIC）是一個(gè)衡量位點(diǎn)多態(tài)性的重要指標(biāo)，除位點(diǎn)5087（0.476）的數(shù)值在0.25～0.50之間以外，其它27個(gè)位點(diǎn)的數(shù)值都大于0.50，說明位點(diǎn)5087表現(xiàn)為中度遺傳多態(tài)性，而其它27個(gè)位點(diǎn)表現(xiàn)為高度遺傳多態(tài)性，表明94份云南地區(qū)大葉茶資源材料具有豐富的遺傳多態(tài)性，都可作為茶樹遺傳育種的重要材料。

2.2 不同來源大葉茶材料遺傳分化分析

對(duì)94份材料的不同來源地間遺傳分化進(jìn)行分析，結(jié)果（表3）表明，統(tǒng)一來源地內(nèi)基因多樣性（Fis）平均值為-1.0000，并且全部引物都為-1.0000，都表現(xiàn)為雜合體偏高；不同來源地間基因多樣性（Fit）平均值為0.6261，表明供試茶樹資源總體雜合子不足。不同來源地間遺傳分化系數(shù)（Fst）為0.8130，表明81.3%的遺傳分化系數(shù)存在于材料不同來源地間。材料不同來源地間基因流（Nm）平均值為0.0575，基因流較大，說明不同來源地間基因交流程度很高。因此，本試驗(yàn)中供試材料的遺傳變異主要存在于不同來源地之間而非同一來源地內(nèi)。

2.3 不同來源大葉茶材料聚類圖與遺傳多樣性分析

94份供試材料基于Neis遺傳距離構(gòu)建的UPGMA聚類圖如圖2所示。在大類群中，可將94份材料分為4大類，高良野茶（22）和黃泥河野茶（27）為一個(gè)大類。安康大葉茶（1）、大卵圓大葉茶（93）、文家塘大葉茶（94）、溫泉原頭茶（68）、下街大葉茶（91）、景新小黃茶（92）、小廠大葉茶（71）、羊岔街野茶（75）、元江磨房茶（78）、腰街大葉茶（76）、育樂野茶（77）、元江軟茶（80）、鎮(zhèn)沅大葉（82）、者竜峨大葉（81）、孟連大葉茶（85）、三中大葉茶（84）、幫崴坎子茶（86）和大曼呂大葉茶（87）共18份材料聚為一個(gè)大類。其它材料則分散分布于聚類圖中，形成兩個(gè)大類。各兩份供試材料均具有較大的遺傳距離和較低的遺傳相似度，下街大葉茶（91）和景新小黃茶（92）遺傳距離最小為0.3391，相似度0.7124；其次是蚌崗大葉茶（8）和德思里茶（17）的遺傳距離為0.3700，相似度0.6908；幫崴壩子茶（86）和大曼呂大葉茶（87）的遺傳距離為0.3808，相似度0.6833。從整個(gè)遺傳聚類圖來看，結(jié)果與多態(tài)性信息含量等參數(shù)值分析結(jié)果一致，表現(xiàn)出豐富的遺傳多樣性。endprint

3 討論與結(jié)論

云南茶樹種質(zhì)資源極為豐富，一些珍稀資源具有重要的研究?jī)r(jià)值和利用潛力。多態(tài)性信息含量（PIC）值作為衡量資源遺傳多樣性的重要指標(biāo)，PIC<0.25時(shí)位點(diǎn)表現(xiàn)為低度多態(tài)性，0.250.5時(shí)為高度多態(tài)性。本研究通過利用28對(duì)SSR引物對(duì)云南不同地區(qū)94份大葉茶資源進(jìn)行遺傳多樣性分析，多態(tài)性信息含量（PIC）值在0.476～0.753之間，平均值為0.643。PIC>0.5的有27對(duì)，占96.4%，27對(duì)引物表現(xiàn)高度多態(tài)性，說明94份供試茶樹資源具有豐富的遺傳多樣性。這與劉本英等[11]分析云南地區(qū)其它材料的結(jié)果一致。本研究通過選擇之前尚未進(jìn)行過遺傳多樣性分析的種質(zhì)材料進(jìn)行分析，并且分析結(jié)果明顯高于其它地區(qū)的相關(guān)研究結(jié)果。另外，從觀測(cè)等位基因數(shù)、Shannon 指數(shù)和多態(tài)性信息含量分析，所選的28對(duì)引物中較好的引物有2049、5115。但所選的引物都不是最有效的引物，還不能充分表現(xiàn)茶樹資源供試材料的多態(tài)性。等位基因數(shù)變幅不大，而Shannon信息指數(shù)變幅在0.91～1.66之間，等位基因數(shù)與Shannon信息指數(shù)在一定程度上變化趨勢(shì)大體一致，但是Shannon信息指數(shù)能更好地反映群體的遺傳多樣性程度，可作為更好的評(píng)判參照標(biāo)準(zhǔn)。

通過聚類分析發(fā)現(xiàn)，94份供試材料可分為4個(gè)大類，多個(gè)亞群。各兩份供試茶樹資源間具有較大的遺傳距離和較低的遺傳相似度，遺傳距離最小的下街大葉茶（91）和景新小黃茶為（92）0.3391，相似度0.7124。整個(gè)聚類除個(gè)別按照地域特點(diǎn)或者種質(zhì)學(xué)聚集外，大部分材料都顯示無規(guī)律聚集。圖中按照地域特點(diǎn)聚集較明顯的分別有勐?？h布朗山的28號(hào)（吉良大葉）和29號(hào)（吉良綠梗綠芽茶）、新平的73號(hào)（新平茶）和74號(hào)（新平峨毛茶）、鳳慶的45號(hào)（馬街野生茶）和32號(hào)（津秀大葉）、景谷的72號(hào)（小景谷大葉）和33號(hào)（景谷紅芽直立茶）分別單獨(dú)聚在一個(gè)小類，且與其它材料距離較遠(yuǎn)，說明它們有可能有相同的遺傳基因，可作為育種工作的重要研究材料。按照種質(zhì)學(xué)聚集較明顯的來自麻栗坡的兩份汝城毛葉茶茶樹資源（麻栗坡白毛茶、壩子白毛茶）卻分散在不同的類群，遺傳距離較遠(yuǎn)。整個(gè)遺傳圖譜表現(xiàn)出豐富的遺傳多樣性，可能與不同地區(qū)不同種質(zhì)學(xué)等因素有極大關(guān)系，并且分析結(jié)果與季鵬章等[16-21]的研究結(jié)果一致。

云南作為茶樹的原產(chǎn)地，種質(zhì)資源豐富，遺傳背景復(fù)雜，但對(duì)其的SSR標(biāo)記工作進(jìn)行緩慢，未能建立起相關(guān)的茶樹基因組SSR標(biāo)記體系。這對(duì)構(gòu)建茶樹資源核心種質(zhì)庫、分子指紋圖譜等研究有一定的影響。對(duì)此，今后應(yīng)結(jié)合云南優(yōu)質(zhì)、高抗、功能性茶樹品種篩選這個(gè)育種目標(biāo)，加快云南茶樹資源的DNA分子技術(shù)研究，使其成為當(dāng)前的一個(gè)重要課題，這對(duì)云南乃至全國(guó)大葉茶優(yōu)異種質(zhì)資源的發(fā)掘、創(chuàng)新及運(yùn)用和加快育種目標(biāo)實(shí)現(xiàn)的步伐有重要作用。

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