霍會永 ，劉冰 ，曹凌 ，趙現(xiàn) ，曹妍 ，薛靖 ，王如科 ，李軍濤 △

阿爾茨海默?。ˋlzheimer’s disease，AD）是老年人群中常見的一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性病變，臨床上以記憶力減退，語言功能障礙和認知能力降低為主要表現(xiàn)，部分患者甚至出現(xiàn)行為和人格改變，嚴重影響了患者生活質量［1］。隨著我國逐漸步入老齡化社會，AD患者的發(fā)病人數(shù)也呈逐年增加之勢。有關AD的發(fā)病機制尚不十分清楚，其主要病理改變?yōu)榇竽X皮質和海馬區(qū)老年斑形成［2］。β-淀粉樣蛋白（βamyloid protein，Aβ）是具有強自聚性的難溶蛋白，是構成老年斑的主要成分，降低腦內Aβ的蓄積能夠有效延緩病程進展［3］。γ-分泌酶是調節(jié)Aβ生成的限速酶，對體內Aβ的平衡具有重要的調節(jié)作用［4］。近年來有研究發(fā)現(xiàn)，細胞外基質金屬蛋白酶誘導因子（extracellular matrix metalloproteinase inducer，CD147）可通過調節(jié)γ-分泌酶的生物活性，調節(jié)Aβ的生成，從而參與AD的發(fā)生、發(fā)展［5-6］。本文通過對AD模型大鼠腦室注射CD147 cDNA，以觀察其對模型大鼠學習記憶能力的干預，以及對大鼠腦組織Aβ和γ-分泌酶表達的影響，從而為AD的臨床治療提供思路。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與試劑 Sprague-Dawley二級健康雄性大鼠60只，月齡5～6個月，均購自中國科學院北京斯萊克實驗動物中心（SCXK京2011-0012）。大鼠適應性飼養(yǎng)2周后用于實驗。CD147 cDNA委托上海吉瑪制藥技術有限公司設計合成。TRIzol總RNA提取試劑購自美國Invitrogen公司。逆轉錄試劑盒、實時熒光定量PCR試劑盒均購自美國ABI Applied Biosystems公司。兔抗大鼠一抗（抗Aβ、抗γ-分泌酶），辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG二抗，DAB顯色試劑盒均購自美國Santa Cruz公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物分組、模型制備及給藥 采用隨機數(shù)字表法將60只大鼠分為假手術組、模型組及CD147組，每組20只。參照文獻［7］制備AD大鼠模型，取模型組和CD147組大鼠，10%水合氯醛（0.3 g/kg）腹腔注射麻醉，俯臥固定于鼠腦立體定位儀上。參照鼠腦立體定位儀圖譜，于前囟門后3.5 mm和中線右側2 mm處垂直進針，通過微量注射器于雙側海馬CA1區(qū)注入10μg的Aβ1～40，假手術組大鼠雙側海馬CA1區(qū)注入10μg生理鹽水，其余操作同模型組和CD147組。CD147組大鼠術后48 h，通過微量注射器于雙側腦室注射CD147 cDNA，模型組和假手術組大鼠于同一部位注射等量生理鹽水。術畢，牙科泥封住顱骨孔，抗生素預防感染。

1.2.2 大鼠學習記憶能力測試 采用Morris水迷宮實驗進行學習記憶能力測試。水迷宮為一圓形水池，直徑1.8 m，高0.55 m。距池壁0.35 m處放一圓形平臺，直徑0.1 m，高0.29 m。所有大鼠訓練5 d，每天上午訓練2次，下午訓練2次，相鄰兩次訓練間隔1 min。訓練時將大鼠面向池壁放入水中，觀察其爬上圓形平臺所需時間（即逃避潛伏期）。如果2 min內仍未找到圓形平臺，則將其引導至圓形平臺，潛伏期記為2 min。訓練5 d后，撤除圓形平臺，在訓練時的同一入水點，大鼠面向池壁入水，觀察其在2 min內跨過原圓形平臺所在位置的次數(shù)。

1.2.3 Western blot檢測蛋白表達 Morris水迷宮實驗結束后，3組大鼠各取15只，腹腔麻醉后處死，取出包含海馬組織的腦組織，置入玻璃勻漿器碾碎，冰浴下加裂解液。裂解30 min，轉移至離心管，4℃下10 000 r/min離心5 min，取上清蛋白液。BCA法測定蛋白濃度，-20℃保存?zhèn)溆谩?00μg蛋白上樣，經(jīng)8%的SDS-PAGE電泳分離，轉至PVDF膜。TBST漂洗，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，兔抗大鼠一抗（抗Aβ、抗γ-分泌酶）工作液，4℃孵育過夜。TBST漂洗，加入辣根過氧化物酶標記的羊抗兔二抗工作液，37℃孵育1 h。TBST漂洗，暗室內ECL顯色、曝光。Image J軟件分析條帶光密度（OD）值，目的蛋白相對表達量=目的蛋白光密度值/內參βactin光密度值。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 19.0統(tǒng)計學軟件進行分析，符合正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組內比較采用LSD-t檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠逃避潛伏期時間比較 各組大鼠逃避潛伏期時間隨著訓練時間的增加均縮短。從第3天開始，模型組大鼠逃避潛伏期時間較假手術組延長，而CD147組較模型組減少，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見表1。

Tab.1 The comparison of escape latencies between three groups表1 各組大鼠逃避潛伏期時間比較（n=20，s，±s）

Tab.1 The comparison of escape latencies between three groups表1 各組大鼠逃避潛伏期時間比較（n=20，s，±s）

＊＊P＜0.01；a與假手術組比較，b與模型組比較，P＜0.05；表2、3 同

2.2 各組大鼠空間探尋能力比較 模型組大鼠經(jīng)過平臺次數(shù)和經(jīng)平臺停留時間較假手術組減少，而CD147組較模型組均增加，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見表2。

2.3 各組腦組織Aβ和γ-分泌酶表達比較 模型組大鼠腦組織Aβ和γ-分泌酶表達較假手術組增加（P＜0.05），而CD147組較模型組減少，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見表3、圖 1。

Tab.2 The comparison of spatial searching abilities between three groups表2 各組大鼠空間探尋能力比較（±s）

Tab.2 The comparison of spatial searching abilities between three groups表2 各組大鼠空間探尋能力比較（±s）

Tab.3 ComparisonofexpressionsofAβandγ-secretasein brain tissues of rats between three groups表3 各組大鼠腦組織Aβ和γ-分泌酶表達比較 （±s）

Tab.3 ComparisonofexpressionsofAβandγ-secretasein brain tissues of rats between three groups表3 各組大鼠腦組織Aβ和γ-分泌酶表達比較 （±s）

Fig.1 Comparison of expressions of Aβ and γ-secretase in brain tissues of rats between three groups圖1 各組大鼠腦組織Aβ和γ-分泌酶表達比較

3 討論

學習記憶能力下降是AD患者早期認知功能損害的主要臨床特征。本研究通過海馬區(qū)注射Aβ1～40，制備 AD 模型大鼠，Morris水迷宮實驗結果顯示，AD模型大鼠逃避潛伏期時間較假手術組顯著延長，經(jīng)過平臺次數(shù)和經(jīng)平臺停留時間較假手術組明顯減少，表明AD模型大鼠出現(xiàn)明顯的學習記憶能力減退。通過對AD模型大鼠雙側腦室注射CD147 cDNA，觀察其對AD模型大鼠學習記憶能力的影響，結果發(fā)現(xiàn)，CD147組大鼠逃避潛伏期時間較模型組大鼠顯著減少，經(jīng)過平臺次數(shù)和經(jīng)平臺停留時間較模型組大鼠顯著增加，表明外源性CD147 cDNA能夠顯著提高AD模型大鼠記憶學習能力，減輕Aβ1～40所致的學習記憶障礙。

有關AD的病因迄今尚不明確，一般認為AD是由于遺傳、免疫、環(huán)境等多種因素所致的復雜性病變。研究指出，Aβ在大腦皮質和海馬區(qū)沉積是引起AD發(fā)病的關鍵因素［8］。Aβ由39～43個氨基酸殘基形成，其C-末端存在12個疏水氨基酸殘基，N-末端存在28個氨基酸殘基位于細胞膜外，所以具有很強的自聚性，易在腦組織形成難溶性的淀粉樣纖維沉積物［9］。Aruoma 等［10］研究顯示，腦組織 Aβ 沉積可引起淀粉樣血管炎，直接引起腦組織血供、氧供障礙。譚展望等［11］認為Aβ可促進Bax表達而抑制Bcl-2表達，從而誘導神經(jīng)元細胞凋亡。Arora等［12］研究顯示，Aβ可損害膽堿能神經(jīng)，而后者與人類學習和記憶功能緊密相關。本研究結果顯示，模型組大鼠腦組織Aβ表達較假手術組顯著增加，這也證實了Aβ可能參與了AD的發(fā)生、發(fā)展；而CD147組大鼠腦組織Aβ表達較AD模型大鼠顯著降低，說明外源性CD147 cDNA可顯著減少腦組織Aβ表達，減輕Aβ沉積所引起的大鼠記憶學習障礙。

γ-分泌酶主要參與體內多個重要跨膜蛋白的切割，可切割C99而生成Aβ，是調節(jié)Aβ生成的限速酶［13］。所以γ-分泌酶的生物活性對Aβ的生成和AD的發(fā)病均至關重要。CD147是一種跨膜糖蛋白，在多種組織和細胞中均有表達，與腫瘤的發(fā)生、視網(wǎng)膜功能和多種神經(jīng)退行性疾病等密切相關。有研究認為CD147參與了對γ-分泌酶生物活性的調控。Zhou等［14］干擾 HeLa細胞 CD147表達，發(fā)現(xiàn)細胞γ-分泌酶表達顯著增加，而Aβ的生成亦明顯增加。張錦巍等［15］過表達小鼠胚胎成纖維細胞CD147，發(fā)現(xiàn)細胞γ-分泌酶表達下降，同時Aβ的生成明顯減少。智孔亮等［16］通過CD147 cDNA轉染人神經(jīng)母細胞瘤細胞，結果發(fā)現(xiàn)γ-分泌酶和Aβ的表達均明顯減少。本研究結果顯示，CD147組大鼠腦組織γ-分泌酶表達較AD模型大鼠顯著降低，這也證實了在AD模型大鼠腦組織中存在同樣的表達調控，即CD147對γ-分泌酶的活性起著負調節(jié)作用。

綜上所述，外源性CD147能夠顯著改善AD模型大鼠學習記憶能力，其具體機制可能與調節(jié)γ-分泌酶活性和下調Aβ的表達有關。

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