白玲榮，楊佐青，陶金忠

（寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院，銀川 750021）

灘羊是我國唯一生產(chǎn)名貴二毛裘皮的特有綿羊品種，以生產(chǎn)美觀、輕便、保暖、耐用的裘皮而著稱。因其特殊的地理生態(tài)環(huán)境的長期自然選擇和人工選育，造就了寧夏灘羊集產(chǎn)肉、產(chǎn)毛、產(chǎn)皮為一體的名貴羊種，寧夏（鹽池）是我國灘羊的主產(chǎn)區(qū)，有“中國灘羊之鄉(xiāng)”的稱謂。在灘羊二毛期時（1月齡），其裘皮的特性更為突出，此時毛股長而彎曲，毛穗自然下垂；毛纖維細長均勻，光澤悅目，花案清晰，為寧夏五寶之一的“白寶”［1-2］。灘羊羊毛按其毛股花穗型的不同，將其分為不同的類型，其中最理想的為串字花、小串字花和軟大花等［3-6］。這些類型的羊毛在其花形結(jié)構(gòu)和毛型比例上都存在較大的差異，并且這些表型差異隨著二毛期灘羊日齡的增加逐漸減弱甚至消失［7］。因此，對于羊毛表型差異及其變化過程中差異蛋白研究具有非常重要的意義［8］。查閱國內(nèi)外相關(guān)資料，對于羊毛差異蛋白研究的文獻相對較少，主要集中于對羊毛“發(fā)源地”——皮膚的研究。松杰等［9］建立了內(nèi)蒙古絨山羊皮膚蛋白質(zhì)雙向電泳圖譜條件；楊潔等［10］對細毛羊皮膚組織中毛囊蛋白質(zhì)雙向電泳圖譜條件進行了摸索；付雪峰等［11］利用雙向電泳及質(zhì)譜檢測技術(shù)對不同羊毛纖維直徑細毛羊皮膚組織差異表達蛋白質(zhì)進行了研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)94個差異表達蛋白；楊劍波等［12］成功地構(gòu)建了中國美利奴羊超細型和哈薩克羊皮膚組織間抑制性消減cDNA文庫，初步篩選出一批可能影響羊毛性狀的差異表達ESTs；高麗霞等［13］利用雙向電泳技術(shù)對內(nèi)蒙古絨山羊全年12個月的皮膚毛囊蛋白質(zhì)進行了研究，建立了毛囊發(fā)育周期蛋白質(zhì)圖譜，對圖譜進行了差異蛋白比對，并對差異蛋白進行了質(zhì)譜檢測，發(fā)現(xiàn)12種差異角蛋白；Flanagan等［14］用蛋白質(zhì)雙向電泳圖譜技術(shù)對羊毛差異表達蛋白進行了分析研究；Plowman等［15］應(yīng)用凝膠和非凝膠技術(shù)對羊毛蛋白質(zhì)組學(xué)進行了探討，并對美利奴羊、洛姆尼羊和考利代羊的羊毛蛋白進行了研究。本實驗旨在建立灘羊羊毛蛋白質(zhì)組的雙向電泳圖譜體系，為灘羊二毛彎曲的形成機理奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品采集 灘羊羊毛樣品采自于寧夏鹽池灘羊選育場，剪取灘羊體側(cè)肩胛骨后緣處完整羊毛樣品［16］。

1.1.2 試劑 固相膠條、IPG buffer和礦物油購自GE公司；碘乙酰胺（IAA）、二硫蘇糖醇（DTT）、硫脲、尿素、CHAPS、Tirs-HCl、30%聚丙烯酰胺、過硫酸銨、TEMED和甘油均購自索萊寶公司。

1.1.3 儀器 等電聚焦儀，多通道垂直電泳，惠普透射掃描儀，低溫離心機，NW10UVE超純水系統(tǒng)。

1.2 方法

1.2.1 羊毛洗滌 將采集的羊毛先用Teric GN9于60℃洗滌2 min，再于40℃洗滌2 min，然后用40℃去離子水洗滌2 min，最后用60℃去離子水洗滌2 min，放置室溫過夜干燥。將干燥的羊毛用二氯甲烷洗滌2次，每次用時5 min；再用乙醇洗滌2次，每次用時5 min；最后用超純水洗滌 2 次，每次用時 5 min，室溫干燥［17-19］。

1.2.2 樣品制備

1.2.2.1 尿素裂解法 將洗滌完畢的羊毛置于研缽中，加入液氮充分反復(fù)研磨至粉末狀。稱取10 mg羊毛樣品粉末溶于1 mL裂解液（7 mol/L尿素、2 mol/L硫脲、4%CHAPS、65 mmol/L DTT、0.5%IPG buffer、1 mmol/L EDTA、40 mmol/L Tris）中，震蕩溶解 2 min，分裝并根據(jù) Bradford法［20-21］定量上樣，其余放置于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2.2 TCA/丙酮沉淀法 將洗滌完畢的羊毛置于研缽中，加入液氮反復(fù)研磨成粉狀。稱取10 mg樣品粉末加入1mLTCA丙酮溶液中，放置4℃冰箱過夜。將樣品置于4℃低溫離心機中12 000×g離心30 min，棄上清，加入100%丙酮（β-巰基乙醇）震蕩洗滌5 min，于低溫離心機12 000×g離心20 min。再重復(fù)一遍上述的洗滌過程；然后用90%丙酮（β-巰基乙醇）再次震蕩洗滌5 min，于低溫離心機12 000×g離心20 min，棄上清，再次重復(fù)一遍90%的丙酮洗滌過程。最后棄上清并抽真空晾干。加入1 mL裂解液（7 mol/L尿素、2 mol/L硫脲、4%的CHAPS、65 mmol/L 的 DTT、0.5%IPG buffer、1 mmol/L 的 EDTA、40 mmol/L Tris），充分裂解后，根據(jù)Bradford法定量的結(jié)果分裝，其余放置于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 被動上樣 將GE預(yù)制的18 cm膠條（pH值為4～7，pH 值為 3～10）在室溫下平衡 15 min，進行蛋白質(zhì)上樣（上樣量分別為 200 μg，400 μg，600 μg，800 μg），根據(jù)蛋白上樣體積加入一定量的水化液（8 M尿素，2%CHAPS，1%DTT，0.5%IPG buffer），使混勻上樣總體積為400 μL進行水化上樣。將混勻的蛋白樣品加入到IPG-box水化盤中，膠面向下輕輕覆蓋混合液，避免氣泡的產(chǎn)生，蓋緊IPG-box，放置15℃下被動水化18 h。

1.2.4 第一向等電聚焦 將水化完成的膠條放入等電聚焦儀中，然后將濾紙片放置在電極和膠條間，放置電極并加入適量礦物油防止溶液的揮發(fā)。設(shè)置等電聚焦程序：300 v 30 min線性，500 v 1 h快速，8 000 v 3 h線性，8 000 v 80 000 Vhr快速，500 v 12 h快速至結(jié)束；300 v 30 min線性，500 v 1 h快速，8 000 v 3 h線性，9 000 v 90 000 Vhr快速，500 v 12 h快速至結(jié)束。

1.2.5 第二向SDS-PAGE垂直電泳 將聚焦完成后的IPG膠條用5 mL的平衡液Ⅰ（6 M尿素、2%SDS、1.5 M pH值8.8 Tris-HCl、20%甘油和1%DTT），至于搖床平衡15 min，平衡后使用電泳緩沖液潤洗，再將膠條置于干凈水化盤，再加入平衡緩沖液Ⅱ（6 M尿素、2%SDS、1.5 M pH值8.8 Tris-HCl、20%甘油和4%IAA），放置于搖床平衡15 min。配制12%和10%的丙烯酰胺凝膠液并將其注入玻璃板夾層中，頂端留有1 cm左右的空間，用乙醇封面，以保持膠面平整。聚合時間1 h，待凝膠與上方液體分層時，表明凝膠已基本聚合。倒去SDS-PAGE凝膠頂端的乙醇，用超重水沖洗膠面。將平衡好的膠條與聚丙烯酰胺凝膠膠面完全接觸，加入低熔點瓊脂糖封膠液室溫放置5 min，待徹底凝固后將其轉(zhuǎn)移至垂直電泳槽內(nèi)。向電泳槽中加入1×電泳緩沖液進行第二向電泳，待溴酚藍指示劑達到底部邊緣時停止電泳。取出凝膠，切角做記號。

1.2.6 凝膠染色及圖像分析 每次凝膠用新配的考馬斯亮藍染色12 h后，用去離子水脫色48 h至背景干凈，然后再用Images-Scanner掃描儀掃描，再用PD Quest 8.0軟件分析雙向電泳圖譜的蛋白點數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 蛋白提取方法對羊毛雙向電泳的影響

羊毛蛋白質(zhì)制備作為其雙向電泳圖譜建立的關(guān)鍵步驟，直接影響后續(xù)條件的建立。本次實驗以TCA/丙酮沉淀法和尿素裂解法兩種方法進行蛋白提取。從TCA/丙酮沉淀法（圖1A）雙向電泳圖譜中可以得到相比較于尿素裂解法（圖1B）較多的蛋白點，在高豐度蛋白區(qū)可以較為明顯地看出，尿素裂解法溶解羊毛蛋白不夠充分，由于羊毛蛋白質(zhì)主要是由角蛋白等結(jié)構(gòu)蛋白組成，TCA/丙酮沉淀法較好地溶解了部分疏水性蛋白，提高了蛋白豐度和蛋白種類。選擇TCA/丙酮沉淀法作為灘羊羊毛蛋白質(zhì)的提取方法比較好。

圖1 不同蛋白提取方法灘羊羊毛雙向電泳圖譜

2.2 上樣量對羊毛雙向電泳的影響

雙向電泳的蛋白上樣量對雙向電泳圖譜蛋白點的檢測是十分關(guān)鍵的，為了研究適合于灘羊羊毛蛋白質(zhì)雙向電泳的上樣量，本實驗選擇了200、400、600和800 μg四種蛋白上樣量。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)上樣量為200 μg（圖2C）時，只能得到高豐度蛋白，幾乎看不到低豐度蛋白；當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)上樣量為400 μg（圖2D）時，得到十分模糊的低豐度蛋白，不利于后期蛋白分析；當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)上樣量為600 μg（圖2E）時，高低豐度蛋白都有較清楚的分辨率；當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)上樣量為800 μg（圖2F）時，高豐度蛋白由于蛋白濃度過高，影響蛋白質(zhì)的聚焦。所以相比較其他上樣量，選擇以600 μg作為灘羊羊毛雙向電泳圖譜的最適上樣量。

2.3 不同pH范圍IPG膠條對羊毛雙向電泳的影響

本實驗選擇同為18 cm pH值范圍為3～10和4～7的2種IPG膠條作為灘羊羊毛蛋白質(zhì)雙向電泳圖譜條件的研究，從電泳圖譜中可清楚地看到，不同pH值范圍的IPG膠條對羊毛蛋白點的分布有較為明顯的影響，在pH值為4～7（圖3H）的圖譜中高豐度蛋白與低豐度蛋白都有較為清楚的分布；而pH值為3～10（圖3G）的圖譜中可直觀地看到其高豐度蛋白點出現(xiàn)堆積現(xiàn)象。因此，選擇pH值4～7作為灘羊羊毛雙向電泳的IPG膠條。

圖2 不同上樣量灘羊羊毛雙向電泳圖譜

圖3 不同pH值范圍的IPG膠條灘羊羊毛雙向電泳圖譜

3 討論

蛋白質(zhì)雙向電泳技術(shù)是研究蛋白質(zhì)組學(xué)的經(jīng)典方法，對蛋白質(zhì)分離可達到理想效果，在各組織蛋白組分離和差異蛋白研究方面起重要的技術(shù)支撐［22］。在進行蛋白質(zhì)雙向電泳過程中涉及到許多步驟和因素，都對蛋白質(zhì)雙向電泳圖譜結(jié)果有較大的影響，樣品的蛋白質(zhì)提取是進行雙向電泳的關(guān)鍵步驟，蛋白提取方法的選擇是否合適，直接影響雙向電泳圖譜的分辨率和重復(fù)性及其后續(xù)差異蛋白點的鑒定。由于羊毛組織蛋白主要以角蛋白和羊毛結(jié)構(gòu)蛋白組成其特殊性，本實驗對TCA/丙酮沉淀法［23-25］和尿素裂解法提取灘羊羊毛蛋白質(zhì)的效果進行了研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，TCA/丙酮沉淀法檢出的蛋白點數(shù)相比尿素裂解法有所增加，高豐度蛋白區(qū)蛋白點較為清晰，其原因可能是TCA/丙酮沉淀法反復(fù)沉淀洗滌羊毛蛋白，能較好地溶解某些疏水性蛋白，提高了蛋白豐度和蛋白種類，配合裂解液中高濃度的尿素和硫脲以及還原劑DTT、去污劑CHAPS等成分可增強羊毛蛋白的溶解，獲得較為理想的凝膠結(jié)果圖譜，得到清晰的蛋白點［26-27］。因此，選擇TCA/丙酮沉淀法作為灘羊羊毛蛋白質(zhì)的提取方法較為合適。

蛋白質(zhì)上樣量直接影響蛋白雙向電泳圖譜上蛋白點的分離效果，上樣量過低則導(dǎo)致低豐度蛋白不能被分離出來，上樣量過高則導(dǎo)致高豐度蛋白掩蓋部分分子量和等電點相近的低豐度蛋白，同時還會導(dǎo)致橫向拖帶［28］。本實驗選擇 200、400、600、800 μg 四種不同上樣量進行了灘羊羊毛蛋白圖譜上樣量的研究。當(dāng)上樣量為200 μg和400 μg時，只能得到模糊高低豐度蛋白，很明顯不能滿足蛋白上樣量的要求，不利于后期蛋白分析；當(dāng)上樣量為800 μg時，高豐度蛋白由于蛋白濃度過高，電泳圖譜蛋白出現(xiàn)聚焦現(xiàn)象，蛋白沒有得到有效的分析。相比較其他上樣量，600 μg時高低豐度蛋白都有較清楚的分辨率，羊毛蛋白得到較為理想的分離效果。因此，選擇以600 μg作為灘羊羊毛雙向電泳圖譜的最適上樣量。

雙向電泳IPG膠條的選擇主要根據(jù)羊毛蛋白的組成情況，查閱相關(guān)文獻，選擇18 cm的pH值為4～7和pH值為3～10的2種膠條。寬pH值范圍的膠條用來分析總蛋白，窄pH值范圍的膠條可以大大提高分辨率和靈敏度，用于分析特定的蛋白［29］。從得到的蛋白圖譜可以明顯地看出，pH值為4～7的蛋白點得到了有效的分離。鑒于后期對灘羊羊毛差異蛋白點的研究需要，所以選擇pH值相對較窄的、具有很好分辨率的pH值為4～7作為灘羊羊毛雙向電泳的膠條。

4 結(jié)論

對灘羊羊毛進行洗滌，液氮研磨處理，利用TCA/丙酮沉淀法提取蛋白，選擇18 cm的pH值為4～7的IPG膠條，上樣量600 μg，聚焦時間90 000 Vhr或更高，12%SDS-PAGE凝膠，建立灘羊羊毛雙向電泳圖譜體系，為灘羊不同時期羊毛和同一時期不同花穗型羊毛，以及灘羊羊毛與其他品種羊毛之間的差異蛋白質(zhì)組學(xué)研究奠定了基礎(chǔ)。

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