劉海軍，黃承俊

（1.天津市畜牧獸醫(yī)研究所，天津 300384；2.遼寧省畜牧業(yè)經濟管理站,沈陽 110032）

自從牛體外胚胎生產體系成功建立以來，人們試圖從不同的角度對這一體系進行改進，例如改變培養(yǎng)系統［1］，添加脂質代謝調節(jié)因子［2-3］和 cAMP 調節(jié)因子［4］等，但和體內胚胎相比牛體外胚胎的質量仍然較差［5-6］，不僅囊胚細胞數較少而且移植妊娠率也不高。這使得人們認識到提高牛胚胎質量的必要性，因此胚胎質量的檢驗逐漸成為評估體外培養(yǎng)體系好壞的重要指標之一。與傳統單一染色方法相比，雙重染色方法能清晰地將囊胚內細胞團（ICM）和滋養(yǎng)層細胞（TE）區(qū)分開來，在評估上具有更高的準確性?；贗CM與TE細胞免疫差異性的囊胚雙重染色［7］，已被人們成功地運用于小鼠、牛、綿羊的囊胚上，在質量的評估上取得了很好的效果［8-9］。鑒于免疫法較高的成本與較長的處理時間，Thouas等［10］利用TritonX-100實現了囊胚雙重染色的簡化，大大縮短了染色時間。然而這種基于TritonX-100對ICM與TE細胞膜通透性改變差異的染色，受胚胎質量及處理程序的影響很大，往往同一處理程序在不同的實驗有著巨大的差異，因而人們時常對TritonX-100的處理過程加以改進以適應實驗的需求［11］。

1 材料與方法

實驗中所用的化學試劑除特別說明外，均購自Sigma公司。

1.1 卵母細胞的采集

牛卵巢取自河北省大廠屠宰場。屠宰后卵巢置于37℃加有雙抗的生理鹽水中，2～3 h運回實驗室，除盡周圍脂肪組織，然后用加有雙抗的生理鹽水沖洗5～6次。抽吸法吸取直徑2～8 mm的卵泡，根據不同的實驗需求挑選裸卵、半裸卵及具有3層及其以上卵丘的卵丘-卵母細胞復合體（cumulus oocyte complexes，COCs）用于實驗。

采卵液：TCM-199（Gibco）+5%胎牛血清（FBS，Gibco）+30 μg/mL 肝素鈉 +4.766 g/L Hepes。

1.2 體外成熟培養(yǎng)

將收集的卵母細胞用成熟液洗3遍，然后每40～60個移入平衡至少2 h的1 mL成熟液中（四孔板），于5%CO2、95%空氣、38.5℃、飽和濕度的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)23～24 h。若卵丘細胞共培養(yǎng)則用微滴法（100 μL），以排出第一極體為卵母細胞成熟的標志。

成熟液：TCM-199+10%FBS+10 μg/mL FSH（寧波三生）+20 μg/mL LH（寧波三生）+1 μg/mL E2。

1.3 體外受精

受精液為IVF-100（Research Institute for the Functional Peptides，Yamagata，Japan），用直接離心法對精子洗滌。即用6 mL洗精液稀釋解凍的精液并于2 000 r/min下離心7 min，棄去上清液，重復一次后用受精液稀釋精子，密度為 1×106～6×106個/mL，然后放入 CO2培養(yǎng)箱中備用。IVF-100受精時間為6 h。

1.4 胚胎的體外培養(yǎng)

將經體外受精的假定受精卵用胚胎培養(yǎng)液洗3遍，并用1 mL移液管部分或全部去除周圍的卵丘細胞。以10枚假定受精卵/100 μL微滴將假定受精卵隨機平等地移入平衡至少2h的微滴中進行體外培養(yǎng)。從體外受精開始算起，第48小時對各組卵裂率進行觀察與記錄，第7～9天對各組囊胚率進行觀察與記錄，中途不換液。

1.5 囊胚細胞數染色及雙重染色

囊胚細胞數染色：將培養(yǎng)至7～9 d的牛囊胚去除卵丘細胞后放入含 10 μg/mL Hoechst33342（PBS）的染色液中染色 5 min，然后在 10%甘油（PBS）中浸泡 10～20 s，吸取少量的甘油和胚胎一起壓片并置于倒置熒光顯微鏡（型號：TE300，Nikon）紫外光下觀察照相。囊胚差異染色：將培養(yǎng)至7～9 d的牛囊胚按照不同的方法染色，壓片后置于倒置熒光顯微鏡紫外光下觀察照相。囊胚內細胞團（ICM）細胞核呈藍色，滋養(yǎng)層（TE）細胞細胞核呈紅色，各組染色囊胚數至少3枚。

1.6 囊胚差異染色試驗設計

方案一：對李瑞岐等［12］方法加以改進。由于長時間用0.5%鏈蛋白酶處理會導致囊胚的裂解，因而調整為55～60 s。用 PBS 洗 2～3 遍后于 10 μg/mL Hoechst33342中染色 5～10 min，然后移入 0.05%TritonX-100（PBS）中處理 60、50、30 和 18 s，于 PBS 中洗 2～3 遍后移入10 μg/mL PI、50 μg/mL PI中染色，每次根據上次染色結果進行調整，染色時間分 20 s、30 s、40 s、1 min、5 min、10 min。用PBS洗2～3遍后進行壓片照相。

方案二：對李榮等［13］方法加以改進。用0.5%鏈蛋白酶處理囊胚1 min后，于PBS中洗2～3遍，在0.5%TritonX-100中處理 20 s，于 PBS中洗 2～3遍后移入50 μg/mL PI、100 μg/mL PI中處理 30 s，用 PBS 洗 2～3遍后轉入 10 μg/mL Hoechst33342中染色 5 min和 15 min，用PBS洗2～3遍后壓片照相。

方案三：對Walker等［14］方法加以改進。用0.5%鏈蛋白酶處理囊胚1 min后于PBS中洗2～3遍，100 μg/mL PI（0.5%TritonX-100/PBS）中染色 30 s，于 PBS 中洗 2～3遍后移入50 μg/mL Hoechst33342中染色15 min，用PBS洗2～3遍后壓片觀察；然后調整方法為用0.5%鏈蛋白酶處理囊胚1 min后于PBS中洗2～3遍，在10、20、50 μg/mL Hoechst33342 中染色 2～5 min，在 PBS 中洗 2～3遍后移入 100 μg/mL PI（0.5%TritonX-100/PBS）中染色30 s、20 s，用 PBS洗 2～3 遍后進行壓片照相。

方案四：對Thouas等［10］方法加以改進。用0.5%鏈蛋白酶處理囊胚 50～55 s后于 PBS中洗 2～3遍，在100 μg/mL PI（1%TritonX-100/PBS） 中染色 18～20 s，于PBS中洗2～3遍后移入45 μg/mL Hoechst33342中染色30～50 s，用 PBS洗 2～3 遍后壓片照相。

1.7 統計分析

實驗重復3次以上。用SPSS 11.0統計軟件進行數據的整理與分析。囊胚細胞總數用卡方（χ2）進行顯著性檢驗，P＜0.05為差異顯著。

2 結果與分析

2.1 方案一牛囊胚雙重染色結果

去透明帶的牛囊胚在10 μg/mL Hoechst33342中染色30 min后，很大概率在隨后的處理過程中發(fā)生碎裂，因而實驗中將Hoechst33342染色時間調整為5～10 min。按照李瑞岐等［12］的方法，對 Hoechst33342、TritonX-100、PI不同濃度及處理時間的牛囊胚雙重染色結果見表1。用 Hoechst33342 處理 30 min、TritonX-100 處理 60 s、PI處理10 min，進行染色時囊胚細胞幾乎全部染為紅色，染色結果見圖1C；調整TritonX-100處理時間為60 s、PI處理時間為1 min時囊胚細胞仍幾乎全部染為紅色，染色結果見圖1D；調整TritonX-100處理時間為30 s、PI處理時間為30 s時能將ICM細胞與TE細胞基本分別染上色，染色結果見圖1E；當繼續(xù)降低TritonX-100處理時間為18 s、PI處理時間為20 s時表現為PI著色淺的現象，而且囊胚細胞多數為藍色，染色效果見圖1F。因而當TritonX-100與PI處理時間都定為30s時，運用此方法基本上能夠達到牛囊胚雙重染色的效果，由于每次重復照片都比較模糊，因而無法對ICM與TE進行統計分析。

表1 方案一不同染色結果

圖1 方案一囊胚差異染色效果

2.2 方案二牛囊胚雙重染色結果

去透明帶的囊胚是否再次孵化對染色的效果影響不大，因而本實驗中將這一步驟去除。對Hoechst33342、TritonX-100、PI不同濃度及處理時間的牛囊胚雙重染色結果見表2。結果顯示，PI濃度為50 μg/mL 和 100 μg/mL 時，囊胚細胞均染為藍色，見圖 2G；PI濃 度 為 100 μg/mL、Hoechst33342 染 色 時間降到5 min時，也只有少部分細胞染為紅色，見圖2H。所有染色未能將ICM細胞與TE細胞分別著色。

表2 方案二不同染色結果

圖2 方案二囊胚差異染色效果

2.3 方案三牛囊胚雙重染色結果

對 Hoechst33342、TritonX-100、PI不同濃度及處理時間的牛囊胚雙重染色結果見表3。按照100 μg/mL PI中染色 30 s、50 μg/mL Hoechst33342 中染色 15 min 的方法進行染色，囊胚細胞基本上全部染為藍色，染色結果見圖3I；調整染色方法為5 μg/mL Hoechst33342中染色 20 min、5 μg/mL PI中染色 20 s，基本上將 ICM 與TE細胞分別染為藍色與紅色，但染色效果不穩(wěn)定，見圖 3J；將 Hoechst33342 濃度調整為 20 μg/mL，染色時間調為5 min，5μg/mL PI中染色20 s，將ICM與TE細胞分別染為藍色與紅色，染色效果見圖3K。對調整后的方案進行統計，結果見表4。囊胚細胞總數與Hoechst33342染色結果無顯著性差異（P＞0.05），ICM與囊胚細胞總數的比值為0.338 2，接近0.33。染色時間在5 min左右。說明此改進的方法基本上達到了牛囊胚快速雙重染色的目的。

表3 方案三不同染色結果

表4 方案三雙重染色效果

圖3 方案三囊胚差異染色效果

2.4 方案四牛囊胚雙重染色結果

對 Hoechst33342、TritonX-100、PI不同濃度及處理時間的牛囊胚雙重染色結果見表5。將Thouas等［10］方法中4℃過夜步驟改為室溫下45 μg/mL Hoechst33342中染色30～50 s，染色結果見圖4L，ICM細胞染為藍色，TE細胞染為紅色，界限較為明顯。對染色后數據進行統計，結果見表6。囊胚細胞總數有高于Hoechst33342染色的趨勢，但差異不顯著（P＞0.05）。ICM與囊胚細胞總數的比值0.335 6，接近0.33。染色時間在3 min左右。說明此改進方法基本上達到了牛囊胚快速雙重染色的目的。

表5 方案四不同染色結果

表6 方案四雙重染色效果

圖4 方案四囊胚差異染色效果

3 討論

本實驗結果顯示，在4個改進的方案中有3個方案基本上能夠將ICM與TE分別著色，但只有改進的方案三、方案四能夠達到快速雙重染色的目的，其中改進的方案四效果最好，也最為穩(wěn)定。運用低濃度的TritonX-100對囊胚進行短時處理，能夠在不破壞ICM細胞膜的情況下增加TE細胞的通透性，使得分子量較大的紅色熒光染料PI可通過TE細胞膜對其進行染色，從而達到囊胚雙重染色的效果。對于Hoechst33342著色的細胞，當細胞膜通透性增大時，PI很容易對其進行復染，并顯示為紅色；而對于PI著色的細胞，低濃度的Hoechst33342則需要較長時間進行復染，并且細胞顏色由紅色逐漸變化為藍色。這表明不管是先用Hoechst33342染色還是先用PI染色，膜通透性大的細胞都將顯示為紅色，最終兩者染色的效果都是一樣的，通過本實驗改進方案三和方案四中ICM/囊胚細胞總數的對比（33.82 VS 33.56）也證實了這一點。

隨著囊胚的不斷發(fā)育，細胞數量也在不斷增加，所需TritonX-100處理的時間也相應增加［15］。在方案一中李瑞岐等［12］的方法是用于第8天牛擴囊或孵化囊胚，而本實驗中所染色的胚胎為標準囊胚，在細胞數上要少于擴囊與孵化囊胚很多，因而TritonX-100處理60～69 s已不再適用。通過實驗發(fā)現，在牛標準囊胚上運用李瑞岐等［12］囊胚雙重染色方法時，TritonX-100的處理時間在30 s是可行的。同時建議0.5%鏈蛋白酶處理時間調整為 1 min，Hoechst33342處理時間調整到 2～10 min，PI處理時間縮短到30 s左右。因為牛囊胚在0.5%鏈蛋白酶中處理1 min左右透明帶就基本上被去除了，如果處理時間過長不僅會影響到ICM細胞膜的通透性，還會使細胞間的連接變得太松散，在接下來的處理過程中會增強TritonX-100對ICM細胞膜通透性的改變，而且胚胎還容易散裂。

在改進的方案四中顯示，Hoechst33342室溫短時處理也能達到牛囊胚雙重染色的目的，而且這種方法大大縮短了染色時間，提高了評估囊胚質量的效率。李榮等［15］的染色方法和 Walker 等［14］的方法與 Thouas 等［10］的染色方法相似，都是通過先改變細胞膜的通透性對TE細胞進行染色，再對ICM細胞進行著色，然而本實驗并未在原有方法的基礎上成功對牛囊胚進行雙重染色，這有可能與胚胎階段及所重復的次數有關。然而對方法三改進時發(fā)現，先進行ICM細胞的染色，再對TE細胞著色也能夠達到牛囊胚雙重染色的目的，這反過來也說明了改進的方案一是可行的。囊胚簡易差異染色對胚胎時期的一致性要求很高，因而在染色過程中要特別注意?？傮w而言，改進的方案三、方案四效果最好、時間最短，達到了快速檢測的目的。運用改良的Walker等［14］的方法能夠將單個胚胎染色時間降到5 min，但效果不如改良的Thouas［10］等的方法好。運用改良的Thouas等［10］的方法能夠將單個胚胎染色時間降到3 min。

4 小結

改進的方案四染色最為穩(wěn)定，效果較好，整個染色時間由原來的12 h（過夜）降到不到3 min，極大地提高了染色效率，可以作為一種快速、簡潔、有效的牛囊胚質量的鑒別方法。

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