湯繼順 ，狄 冉 ，劉秋月 ，王翔宇 ，胡文萍 ，儲明星 （.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，農(nóng)業(yè)部動物遺傳育種與繁殖重點實驗室，北京 0093；2.安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，合肥 23003）

產(chǎn)羔數(shù)是影響綿羊生產(chǎn)效率的主要因素之一，但產(chǎn)羔數(shù)是一個低遺傳力的性狀，不僅受遺傳基因的控制，還受性別和年齡等的制約，難以用常規(guī)的育種技術(shù)來選擇。Gabina［1］報道，將繁殖性狀合并為一個選擇指數(shù)，根據(jù)母綿羊各自的生產(chǎn)性能對母羊進(jìn)行選擇時，產(chǎn)羔數(shù)是其中最重要的一個性狀，其對遺傳進(jìn)展的經(jīng)濟(jì)效益貢獻(xiàn)為74%～96%，找到與產(chǎn)羔數(shù)相關(guān)的主效基因或有效分子遺傳標(biāo)記是現(xiàn)代綿羊分子育種的關(guān)鍵。影響產(chǎn)羔性能的因素很多，主要有外界因素（飼料營養(yǎng)、配種方式和公羊效應(yīng)等）和遺傳因素等，其中遺傳因素是內(nèi)在因素，決定著排卵數(shù)的多少和受胎率的高低等，而受胎率也與精卵融合效率密切關(guān)聯(lián)。精卵融合的過程涉及到精子和卵子細(xì)胞膜表面的一系列分子參與其中［2-4］。研究發(fā)現(xiàn)，精子表面存在精卵結(jié)合蛋白Izumo1［5-6］，在哺乳動物卵子質(zhì)膜上除了必需受體蛋白葉酸受體4（Juno）與Izumo1相互作用外，白細(xì)胞分化抗原簇9（cluster of differentiation antigen 9，CD9）在哺乳動物的精卵質(zhì)膜融合過程中也起著關(guān)鍵作用［7-8］。CD9蛋白屬于跨膜4超家族（transmembrane 4 superfamily，TM4SF）成員，是一種跨膜糖蛋白，大多分布在細(xì)胞膜，少數(shù)分布在細(xì)胞的板狀偽足、絲狀偽足和細(xì)胞囊泡中［9］。近年來發(fā)現(xiàn)，精卵融合效率對哺乳動物的受胎率有著重要影響，因此CD9等基因得到重視并逐漸展開了深入研究［10-12］。

全基因組重測序是目前動植物疾病、生產(chǎn)以及經(jīng)濟(jì)性狀等功能基因挖掘最主要的方法之一［13-15］。對多個群體進(jìn)行選擇信號檢測常用的方法是群體分化指數(shù)（Fst）法，F(xiàn)st是檢測群體間遺傳分化的重要指標(biāo)之一，通過對全基因組范圍內(nèi)的單個位點Fst（0＜Fst＜1，1表示該區(qū)域種群完全分化）估值就能對每個位點分析其分化程度，最終實現(xiàn)選擇信號檢測［16］。因此，針對產(chǎn)羔數(shù)性狀不同的綿羊品種（多羔和單羔），利用本課題組前期重測序結(jié)果并使用Fst方法對多羔組和單羔組分化程度進(jìn)行分析并鑒定選擇信號，從而篩選出與綿羊產(chǎn)羔數(shù)相關(guān)的候選基因CD9基因g.208082881C＞A位點。

本研究以繁殖力存在差異的綿羊品種為試驗對象，結(jié)合多重PCR技術(shù)、Mass ARRAY IPLEX單堿基延伸技術(shù)和基質(zhì)輔助激光解吸附電離飛行時間質(zhì)譜分析質(zhì)譜技術(shù)（matrix-assisted laser desorption/ionization-time of flight，MALDI-TOF）進(jìn)行分型檢測［17-18］，快速檢測綿羊CD9基因g.208082881C＞A位點多態(tài)性并分析其與產(chǎn)羔數(shù)性狀的關(guān)系，以期為綿羊高繁殖力性狀的標(biāo)記輔助早期選擇提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

血液樣品來源：小尾寒羊、蘇尼特羊、灘羊、草原藏羊、薩福克羊和杜泊羊6個綿羊品種，總共760只，其中小尾寒羊為多羔品種，其他都是單羔品種。各試驗綿羊群體均健康狀況良好，飼養(yǎng)條件相對一致，同時記錄小尾寒羊頭3胎產(chǎn)羔記錄。每只綿羊頸靜脈采血10 mL，采用檸檬酸葡萄糖抗凝，-20℃保存。其中小尾寒羊血液樣本380份采自山東省鄆城縣，蘇尼特羊血液樣本100份采自天津市畜牧獸醫(yī)研究所種羊場，灘羊血液樣本80份采自寧夏鹽池縣，草原藏羊血液樣本131份采自西藏當(dāng)雄縣，薩福克羊血液樣本39份和杜泊羊血液樣品30份均采自北京市順義區(qū)北京奧鑫牧業(yè)有限公司。

1.2 主要儀器與試劑

基因分型鑒定委托北京君諾德生物技術(shù)有限公司完成。主要儀器和試劑：基因擴(kuò)增為ABI GeneAmp9700 384 Dual，質(zhì)譜點樣為MassARRA-Y Nanodispenser RS 1000，質(zhì)譜分析為MassARRAY Compact System，試劑為Complete Genotyping Reagent Kit for Mass ARRAYCompact 384。

1.3 方法

1.3.1 DNA提取和純度質(zhì)控 DNA提取根據(jù)天根生化科技（北京）有限公司血液基因組EasyPureTMBlood Genomic DNA Kit試劑盒說明步驟進(jìn)行，提取的DNA樣品濃度采用微量紫外分光光度計檢測（Nano Drop2000）DNA OD值，并通過1.5%瓊脂糖凝膠電泳對DNA質(zhì)量進(jìn)行檢測。分型樣品選擇：6個綿羊品種DNA，每個樣品需要量 20 μL，DNA 最終濃度 10～30 ng/μL。

1.3.2 引物設(shè)計及引物質(zhì)控 根據(jù)SNP位點序列信息，采用Sequenom公司的引物設(shè)計軟件Assay design 3.1設(shè)計PCR反應(yīng)和單堿基擴(kuò)增引物并合成（見表1）。通過MALDI-TOF進(jìn)行質(zhì)檢，將引物稀釋到質(zhì)譜反應(yīng)所需濃度。具體操作：吸取2 μL延伸引物加到40 μL ddH2O中，進(jìn)行質(zhì)譜檢測。配置PCR引物儲備液，終濃度100 μmol/L；配置單堿基引物儲備液，終濃度500 μmol/L。

表1 PCR反應(yīng)和單堿基擴(kuò)增引物

1.3.3 PCR反應(yīng) 5 μL的PCR反應(yīng)體系中含有ddH2O 1.8 μL，10×PCR Buffer 0.5 μL，MgCl2（25 mM）0.4 μL，dNTP（25 mM）0.1 μL，Hotstar Taq（5 U/μL）0.2 μL，PCR Primer mix 1 μL，待檢測 DNA 樣品 1 μL。

PCR 擴(kuò)增條件：95℃預(yù)變性 2 min；95℃變性 30 s，56℃退火 30 s，72℃延伸 1 min，共 45 個循環(huán)；最后 72℃延伸5 min，25℃保存。

1.3.4 PCR產(chǎn)物純化 利用SAP酶去除PCR產(chǎn)物中剩余的dNTP，以保證單堿基延伸的準(zhǔn)確性。

SAP酶消化反應(yīng)：配制SAP酶Mix，2 μL反應(yīng)體系中含有 ddH2O 1.53 μL，SAP Buffer 0.17 μL，SAP Enzyme 0.3 μL。在 PCR 儀中進(jìn)行 SAP 酶消化：37℃ 40 min，85℃5 min，25℃保存。

1.3.5 單堿基延伸 配制Mix，2 μL反應(yīng)體系中含有ddH2O0.619μL，iPLEXBuffer0.2μL，Terminatormix0.2μL，Extend primer mix 0.94 μL，iPLEX Enzyme 0.041 μL。

反應(yīng)體系：94℃預(yù)變性 30 s；94℃ 5 s，52℃ 5 s，80℃5 s，40 個循環(huán)；52℃ 5 s，80℃ 5 s，5 個循環(huán)；最后 72℃延伸 3 min，25℃保存。

1.3.6 樹脂純化 將Clean Resin樹脂平鋪到6 mg的樹脂板中，加16 μL ddH2O到延伸產(chǎn)物的對應(yīng)孔內(nèi)，將干燥后的樹脂倒入延伸產(chǎn)物板中，封膜，低速（2 000 r/min）垂直旋轉(zhuǎn)30 min，使樹脂與反應(yīng)物充分接觸，離心使樹脂沉入孔底部。將脫鹽處理后的樣品點在樣品靶上，自然結(jié)晶。

1.4 基因分型

樣品樹脂純化后，啟動Mass ARRAY Nano dispenser RS1000點樣儀，將樹脂純化后的延伸產(chǎn)物移至384孔SpectroCHIP（Sequenom）芯片上，并用基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜進(jìn)行分析，檢測結(jié)果用TYPER 4.0軟件完成分型，并輸出結(jié)果。

1.5 數(shù)據(jù)處理

使用Microsoft Excel 2016軟件統(tǒng)計綿羊CD9基因g.208082881C＞A位點的基因型頻率、等位基因頻率、多態(tài)信息含量（polymorphism information content，PIC）、雜合度（heterozygosity，He）和有效等位基因數(shù)（effective number of allele，Ne），并進(jìn)行 Hardy-Weinberg 平衡檢測。使用SPSS 22.0軟件程序中一般線性模型中單因素方差分析的最小顯著差異（least significant difference，LSD）法對小尾寒羊基因型與產(chǎn)羔表型數(shù)據(jù)進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 DNA提取純度質(zhì)控和引物質(zhì)控

由圖1A得知，采用濃度為1.5%瓊脂糖凝膠，電泳電壓5 v/cm，時間20 min，電泳檢測膠發(fā)現(xiàn)，DNA條帶單一、清晰、無雜質(zhì)，沒有彌散、拖尾現(xiàn)象。

圖1 DNA提取純度檢測和引物質(zhì)控

由圖1B得知，設(shè)計的延伸引物進(jìn)行質(zhì)譜檢測后，所得峰圖分子量與理論值一致，無雜峰。

2.2 CD9基因多態(tài)性分析

通過基因分型發(fā)現(xiàn)，CD9基因g.208082881C＞A位點在單、多羔綿羊品種中均存在兩種基因型，分別是AA和CA。具體信息見圖2和表2。

由表2可知，綿羊CD9基因g.208082881C＞A位點等位基因頻率在單、多羔綿羊品種間差異達(dá)到極顯著水平（P＜0.01），且無論在單羔還是多羔品種中，A基因均是優(yōu)勢等位基因。

2.3 CD9基因g.208082881C＞A位點在不同綿羊品種中的群體遺傳學(xué)分析

由表3可知，綿羊CD9基因g.208082881C＞A位點在小尾寒羊、蘇尼特羊、灘羊、草原藏羊、薩?？搜蚓d羊品種中均為中度多態(tài)（0.25＜PIC＜0.5），在杜泊羊中表現(xiàn)為低度多態(tài)（PIC＜0.25）。卡方適合性檢驗結(jié)果表明，CD9基因g.208082881C＞A位點在杜泊羊群體中處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)（P ＞0.05），而在其余綿羊品種中均處于Hardy-Weinberg不平衡狀態(tài)（P＜0.05）。

2.4 CD9基因g.208082881C＞A位點與小尾寒羊產(chǎn)羔數(shù)的關(guān)系

由表4可知，CD9基因g.208082881C＞A位點2種基因型與小尾寒羊頭3胎產(chǎn)羔數(shù)之間并無顯著關(guān)聯(lián)（P＞0.05），但從第2胎和第3胎產(chǎn)羔數(shù)分析，AA型產(chǎn)羔數(shù)高于CA型。

圖2 CD9基因g.208082881C＞A位點分型結(jié)果

表2 CD9基因g.208082881C＞A位點在單羔、多羔綿羊品種中的基因型頻率和等位基因頻率

表3 CD9基因g.208082881C＞A位點在不同綿羊品種中的群體遺傳學(xué)分析

表4 CD9基因g.208082881C＞A位點2種基因型小尾寒羊產(chǎn)羔數(shù)

3 討論

3.1 CD9基因功能及對哺乳動物精卵融合的影響

CD9是存在于包括卵母細(xì)胞等多種細(xì)胞的細(xì)胞膜中的一種糖蛋白，相對分子質(zhì)量為24 kD，編碼226個氨基酸的肽鏈，含典型TM4SF蛋白特征序列——CCG基序［19-20］。綿羊的CD9基因定位于第3號染色體上，包含7個外顯子。在哺乳動物精卵融合過程中CD9直接參與精子和卵子的膜融合過程，并在其中起到關(guān)鍵性的作用［9，21-22］。Bianchi等［23］利用小鼠研究發(fā)現(xiàn)，CD9可能調(diào)控Juno結(jié)構(gòu)，從而能促進(jìn)Juno與Izumo1結(jié)合。此外，CD9還參與細(xì)胞支持、黏附、運(yùn)動、增殖以及腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移等［24-26］。

CD9基因在造血細(xì)胞、骨髓細(xì)胞、腦細(xì)胞、肌肉細(xì)胞、生殖器官和卵母細(xì)胞表面都有分布，并可與多種分子等形成蛋白質(zhì)復(fù)合體參與功能表達(dá)［27-28］。周思暢等［25］研究發(fā)現(xiàn)，小鼠未成熟的卵母細(xì)胞膜上有強(qiáng)的CD9基因表達(dá)，在完全成熟的卵母細(xì)胞膜上CD9基因表達(dá)最強(qiáng)。隨著綿羊卵泡的形成，在初級卵泡期就能檢測到CD9熒光信號，成熟的卵母細(xì)胞CD9mRNA表達(dá)量顯著增加［11］。此外，Li等［29］研究表明，豬卵母細(xì)胞成熟期CD9顯著增多，從而提示其與卵細(xì)胞受精能力有關(guān)。

目前，哺乳動物CD9的研究熱點主要集中在受精過程中胞外受體識別、胞內(nèi)信號傳導(dǎo)通路以及與其他細(xì)胞因子的關(guān)系等方面。體外實驗證實，CD9基因敲除（CD9-/-）實驗進(jìn)一步確認(rèn)了CD9蛋白在精卵融合過程中的關(guān)鍵地位。2011年Fanaei等發(fā)現(xiàn)，雌性小鼠（CD9-/-）的卵子不能與精子融合而導(dǎo)致受精失敗［30］。采用免疫共沉淀證明，CD9蛋白在卵質(zhì)膜上與整合素α6β1形成物理聯(lián)結(jié)，可引起整合素介導(dǎo)的膜脂筏（lipid raft）微域結(jié)構(gòu)信號傳導(dǎo)反應(yīng)，如細(xì)胞內(nèi)pH值、細(xì)胞質(zhì)鈣水平、磷脂代謝、氨基酸（酪氨酸、絲氨酸和蘇氨酸）磷酸化的改變以及基因表達(dá)，從而促進(jìn)精卵融合［31］。

3.2 CD9基因g.208082881C＞A位點多態(tài)性與產(chǎn)羔數(shù)的關(guān)系

在群體遺傳結(jié)構(gòu)分析中多態(tài)信息含量（PIC）是衡量基因變異位點程度高低的指標(biāo)。PIC＞0.50表示該位點高度多態(tài)性；PIC在0.25～0.50之間為中度多態(tài)性；PIC＜0.25為低度多態(tài)性［32］。有效等位基因數(shù)（Ne）反映等位基因之間的相互影響，Ne越接近等位基因的絕對數(shù)，表明人工選擇壓力就越大。雜合度（He）是反映某位點上遺傳變異量大小的指標(biāo)。若PIC高，有效等位基因數(shù)目Ne多，He大，表明該群體在該位點的遺傳變異程度高［33］。

本研究選擇的CD9基因g.208082881C＞A位點通過群體遺傳學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，在小尾寒羊、蘇尼特羊、灘羊、草原藏羊和薩?？搜蚓d羊品種中，PIC在0.25～0.50之間，為中度多態(tài)，表明該位點在這些綿羊群體中存在較強(qiáng)的選擇潛力。在杜泊羊品種中處于低度多態(tài)（0.21），表明該位點在杜泊羊中的遺傳多樣性則相對貧乏。小尾寒羊、蘇尼特羊、灘羊、薩?？搜蚝筒菰匮虻腍e和Ne分別在0.38～0.49和1.60～1.95間，說明這幾個綿羊品種遺傳變異程度高。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，CD9基因g.208082881C＞A位點在小尾寒羊、蘇尼特羊、灘羊、草原藏羊和薩?？搜蚓d羊品種中均處于Hardy-Weinberg不平衡狀態(tài)，可能是因為自然選擇或人工選擇對該位點分布影響較大，或與試驗選擇的羊品種數(shù)量較少有關(guān)。通過基因分型發(fā)現(xiàn)，該位點在單羔、多羔綿羊品種中都只存在AA和CA型。與產(chǎn)羔數(shù)關(guān)聯(lián)分析結(jié)果顯示，AA和CA型與小尾寒羊的頭3胎的產(chǎn)羔數(shù)并無顯著關(guān)聯(lián)（P＞0.05），但從第2胎開始AA型產(chǎn)羔數(shù)高于CA型，推測該位點突變在一定程度上提高了小尾寒羊的產(chǎn)羔能力。

4 結(jié)論

本研究表明，綿羊CD9基因g.208082881C＞A位點在小尾寒羊、蘇尼特羊、灘羊、草原藏羊和薩?？搜蚓d羊品種中存在較強(qiáng)的選擇潛力。AA和CA型小尾寒羊頭3胎產(chǎn)羔數(shù)并無顯著差異（P＞0.05），但從第2胎開始AA型產(chǎn)羔數(shù)高于CA型。

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