汪晶晶, 馬月輝, 關(guān)偉軍

1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所, 北京 100193; 2.哈爾濱體育學(xué)院, 哈爾濱 150008

隨著世界人口老齡化趨勢的增長以及體育運動的普及與發(fā)展，肌腱損傷已成為臨床常見疾病。目前，臨床上對肌腱損傷的治療方法包括藥物治療[1,2]、直接縫合[3,4]、自體[5]或異體移植[6]、針刺、理療[7,8]和體外沖擊波治療[9,10]等。但是對于缺損嚴重的肌腱損傷，直接縫合困難，自體或異體移植可能帶來疾病傳播、肌腱再次斷裂、供處殘疾、移植物排斥及倫理問題，因此，干細胞治療及肌腱組織工程成為治療肌腱缺損的新方向。相比于骨髓、胚胎、臍帶等組織來源的干細胞，脂肪來源的干細胞(adipose-derived stem cells, ADSCs)具有微創(chuàng)性、可重復(fù)獲取、易于向多譜系分化等優(yōu)勢，已成為再生醫(yī)學(xué)和組織修復(fù)工程的研究熱點，具有廣闊的臨床應(yīng)用前景。

目前，國內(nèi)針對ADSCs應(yīng)用于肌腱損傷修復(fù)的研究報道較少，本文對近年來國內(nèi)外脂肪來源干細胞的發(fā)現(xiàn)與分離、分化能力以及在肌腱損傷修復(fù)方面的應(yīng)用進行了綜述，以期為ADSCs應(yīng)用于肌腱損傷修復(fù)的相關(guān)研究提供參考。

1 ADSCs的發(fā)現(xiàn)與分離

早在1974年，Poznanski 等[11]就報道了脂肪基質(zhì)細胞(adipose-derived stromal cells)的分離方法和生物學(xué)特性，2001年，Zuk等[12]從人脂肪抽吸細胞中獲取了一種多能干細胞(processed lipoaspirate，PLA)，首次證明PLA具有向成骨細胞、脂肪細胞、軟骨細胞和肌細胞多方向分化的潛能。2002年，Zuk等[13]通過免疫熒光、流式細胞術(shù)等方法進一步發(fā)現(xiàn)這些PLA群體細胞與人骨髓間充質(zhì)干細胞(BMSCs)表達相似的標志物，將它們定義為脂肪來源的干細胞(ADSCs)。目前，脂肪干細胞已在人、雞、豬、馬、鼠等[14～17]物種中成功分離，不同部位分離出來的脂肪干細胞的特性也有所不同。比如，分離自心臟周圍的脂肪干細胞比分離自腹股溝處的脂肪干細胞更容易發(fā)生肌源性分化[18]；取自胸腔的脂肪干細胞較皮下和網(wǎng)膜組織來源的脂肪干細胞群體倍增時間長，體外培養(yǎng)到第二代時顯著表達CD34的細胞更多；皮下和心包來源的脂肪干細胞表現(xiàn)出更好的向脂肪細胞分化的能力；網(wǎng)膜來源的脂肪干細胞表現(xiàn)出更強的成骨細胞分化潛能[19]。有研究者分別從肌腱組織、骨髓、脂肪組織、臍帶組織以及臍帶血中獲取MSC，對比分析了它們的mRNA表達，發(fā)現(xiàn)ADSCs中collagen 1A2、collagen 3A1和 decorin的表達水平最高，collagen 1A2/collagen 3A1比值也顯著高于其他組織來源的MSC(包括原位肌腱組織來源的MSC)，而BMSCs中collagen 1A2/collagen 3A1比值最低。這些結(jié)果提示，在肌腱愈合過程中，ADSCs相比于其他組織來源的MSC更有利于細胞外基質(zhì)(extracellular matrix, ECM)的重建[20]。

另外，利用不同方法獲取的脂肪干細胞其生物學(xué)特性也有差別。有研究者采用手術(shù)切除、動力吸脂和激光吸脂三種方法獲取脂肪干細胞，體外培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)，經(jīng)手術(shù)切除和動力吸脂術(shù)獲取的脂肪干細胞的克隆形成能力顯著高于激光吸脂術(shù)獲取的脂肪干細胞；經(jīng)手術(shù)獲取的脂肪組織群體倍增時間明顯較采用吸脂術(shù)獲取的脂肪干細胞長[21]。但由于供體之間存在差異，針對同一個體而言，利用不同技術(shù)方法獲取的脂肪干細胞生長動力學(xué)是否存在差別還需要進一步研究[22]。因此，在將脂肪干細胞應(yīng)用于再生修復(fù)和臨床治療時應(yīng)充分考慮部位選擇、供體差異等因素，以便有更高效的治療效果。

2 ADSCs的分化能力

2.1 BMPs對 ADSCs向肌腱譜系分化的影響

目前，已有很多研究證實脂肪干細胞可向成骨細胞[23]、脂肪細胞[24]、軟骨細胞[25]、心肌細胞[26]、神經(jīng)細胞[27]、肝細胞[28]、胰島素分泌細胞[29]等多胚層分化。體外促進ADSCs向腱細胞分化的因素有很多，其中BMP家族的調(diào)控發(fā)揮著重要作用。Park等[30]發(fā)現(xiàn)GDF-5(BMP-14)可以促進ADSCs的增殖，提高ECM(COLLI、decorin、ACAN)和腱細胞標志物(SCX、Tnmd、tenascin-C)的表達；Sheen等[31]發(fā)現(xiàn)BMP-12可以激活A(yù)DSCs中的Smad1、Smad5、Smad8信號通路誘導(dǎo)脂肪干細胞向肌腱細胞分化，有效增強肌腱標志物SCX和TNMD的基因和蛋白表達水平，同時提高了ADSCs中軟骨基質(zhì)基因ACAN的表達，但比在肌腱成纖維細胞中檢測到的蛋白聚糖表達量低10倍。在另一項關(guān)于BMP-12對ADSCs體外向腱細胞分化的研究中，BMP-12上調(diào)了ADSCs中肌腱轉(zhuǎn)錄因子SCX與MKH基因的表達，但也同時上調(diào)了成骨轉(zhuǎn)錄因子RUNX2基因的表達；此外，BMP-12顯著降低了hADSCs抑制淋巴細胞增殖的能力，提高了hADSCs分泌VEGF、IL-6、MMP-1和MPP-8的水平，但對TGF-β、IL-10、EGF和MPP-13的分泌沒有影響；對hADSCs的增殖能力、遷移能力和氧應(yīng)激敏感性均沒有影響[32]。

盡管這些研究充分證明了BMPs對ADSCs體外分化成腱細胞具有促進作用，但目前并沒有研究表明某種單一的生長因子可以促進ADSCs專門向腱細胞的分化。因此，如何保證ADSCs高效分化成腱細胞的同時，避免向其他譜系(如成骨、成軟骨細胞)的分化是肌腱組織工程研究需要解決的重要問題之一。

2.2 ECM對ADSCs向肌腱譜系分化的影響

肌腱擁有豐富的ECM成分，許多肌腱ECM蛋白在肌腱分化和組建過程中發(fā)揮重要的作用，因而不少研究開始通過構(gòu)建ECM支架提高ADSCs的增殖和專門向腱細胞分化的能力。Yang等[33]鑒定了肌腱細胞外基質(zhì)尿素提取成分tECM的生物學(xué)組成，以及在單軸應(yīng)力拉伸下hADSCs在3D膠原支架上的成肌腱作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)獲取的tECM無細胞成分，富含豐富的肌腱ECM成分，接種在tECM支架的hADSCs增殖和分化趨勢顯著；同時，tECM顯著抑制了單軸拉力引發(fā)的hADSCs向成骨方向的分化。另外，tECM改善了支架的機械性能， hADSCs中MMPs活動和表達減少，提示tECM在細胞介導(dǎo)的支架重建中具有調(diào)節(jié)作用。tECM提高了hADSCs的增殖能力，促進其向肌腱譜系分化。將hADSCs接種于含有tECM的支架上模擬原位肌腱組織的構(gòu)造，CoLⅠ基質(zhì)合成顯著增加，組建有明顯改善。

在臨床治療中，移植入宿主體內(nèi)的支架需要大規(guī)模的細胞數(shù)量進行結(jié)構(gòu)重塑，為了進一步提高ADSCs在體外的增殖和分化的效率，有很多研究開始將生長因子與tECM聯(lián)合使用。Raghavan等[34]從青年牛阿基里斯跟腱的脫細胞肌腱ECM中提取了可溶性成分，添加到hADSCs培養(yǎng)基中，培養(yǎng)7 d后發(fā)現(xiàn)細胞密度和代謝活性較未添加組顯著提高；tECM與TGF-β3的聯(lián)合使用顯著提高了SCX和TNC基因的表達水平，促進了ADSCs向腱細胞的分化，且沒有發(fā)生明顯的成軟骨分化現(xiàn)象。

2.3 影響ADSCs向肌腱譜系分化的其他因素

除了生長因子和ECM的作用外，氧分壓和力學(xué)刺激也是影響ADSCs向腱細胞分化的關(guān)鍵因素。國內(nèi)有研究者將hADSCs分別在常氧(20%)和低氧(2%)條件下與腱細胞共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)后者的COLⅠ、COLⅢ、SCX和TNMD等肌腱標志物蛋白表達量更高；用低氧誘導(dǎo)因子抑制劑抑制HIF-α1的活動后，ADSCs向腱細胞的分化趨勢明顯減弱；而用FG-4592激活HIF-1α的活動后，低氧(2%)和常氧(20%)環(huán)境下ADSCs向腱細胞分化能力均顯著提升[35]。另外，Raabe等[36]將馬ADSCs接種于鼠尾膠原Ⅰ填充的3D支架，比較在周期性(拉伸2 h，停止6 h)單軸應(yīng)變拉伸刺激下，不同程度氧分壓(3%和21%)與GDF5、DGF6和GDF7因子對ADSCs向腱細胞分化的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在21%氧分壓、拉伸刺激和GDF5或GDF7的作用下分化效果最好，細胞表現(xiàn)為典型的長梭形腱細胞狀態(tài)，細胞核有所拉長；膠原束排布嚴格有序，與拉伸方向一致，整個凝膠支架明顯比拉伸刺激前更加堅硬。

最近，有研究利用免疫磁珠法(IMS)從人類ADSCs中分選出TNMD、CD29、STRO-1和SSEA-4表達的亞細胞群，通過添加不同的調(diào)控肌腱組織愈合的生長因子(bFGF、TGF-β1和PDGF-BB)培養(yǎng)28 d后，發(fā)現(xiàn)TNMD陽性表達的亞細胞群更容易向肌腱譜系分化[37]。另外，過表達Tnmd可顯著提升細胞增殖以及肌腱相關(guān)分子(Tnmd、Scx、collagen Ⅰ、Ⅲ、Ⅵ和decorin)的表達，抑制間充質(zhì)干細胞向脂肪細胞、軟骨細胞和骨細胞系的分化；在體移植鼠尾膠原凝膠于裸鼠皮下，Tnmd過表達的C3H10T1/2細胞形成了新生肌腱樣組織，組織學(xué)特征表現(xiàn)為波浪狀致密膠原纖維和平行樣細胞排布[38]。

3 ADSCs在肌腱損傷治療中的應(yīng)用

3.1 ADSCs直接移植于肌腱損傷部位

MSCs可能通過以下幾種途徑誘導(dǎo)組織愈合[39]：①MSCs通過細胞與細胞之間的直接接觸，釋放可溶性免疫抑制因子調(diào)控免疫應(yīng)答；②MSCs可以分泌廣譜的細胞因子、趨化因子和生長因子阻斷凋亡，促進相鄰細胞的增殖；③MSCs擁有分化成各種細胞系以及注射后直接遷移至損傷部位的能力。最近有研究將人脂肪干細胞直接移植于大鼠肌腱缺損部位，細胞示蹤顯示移植的ADSCs 可以至少存在4周，并且分泌人特異性Ⅰ型膠原和tenascin-C[40]，這支持了在參與肌腱重塑中，ADSCs可以分化為肌腱譜系并分泌相關(guān)蛋白的觀點。Lee等[41]首次將間充質(zhì)干細胞注射治療慢性肌腱病應(yīng)用于臨床，在對12名患有肱骨外上髁炎的患者注射同種異體來源的ADSCs后，通過52周隨訪觀察發(fā)現(xiàn)ADSCs治療組患者肘部疼痛癥狀、臨床表現(xiàn)和結(jié)構(gòu)缺損區(qū)域得到了明顯改善且沒有任何副作用。

滑膜內(nèi)肌腱愈合的一個主要挑戰(zhàn)是在提高肌腱力量的同時保證活動的順滑，如果細胞和生長因子沒有定位在修復(fù)部位會刺激粘附因子的產(chǎn)生。目前的研究發(fā)現(xiàn)了一種解決此問題的新方法[42]。為避免刺激粘附因子，將覆有薄層透明質(zhì)酸水凝膠的ASC細胞層包繞在損傷修復(fù)部位，7 d后評估治療效果時未發(fā)現(xiàn)超過3 mm的間隙，手術(shù)部位也沒有明顯的粘連?；虮磉_結(jié)果顯示ADSCs促進了抗炎M2巨噬細胞表型的再生，調(diào)節(jié)肌腱基質(zhì)的重塑，抑制修復(fù)處的細胞凋亡，在充分調(diào)節(jié)肌腱損傷早期炎癥環(huán)境的同時有效促進了組織修復(fù)。

3.2 ADSCs與腱細胞共培養(yǎng)

大多數(shù)研究在體評估強調(diào)了注射自體或同種異體ADSCs在提高肌腱機械強度、功能恢復(fù)、膠原纖維組建以及預(yù)防損傷和炎癥浸潤等方面的作用，但是ADSCs參與和調(diào)控肌腱愈合的分子機制依然不清楚。為了探討在ADSCs的影響下肌腱細胞的存活率和分子效應(yīng)，Veronesi等[43]建立了ADSCs與腱細胞的間接共培養(yǎng)系統(tǒng)，在兩種細胞互不接觸的標準培養(yǎng)條件下，與單獨培養(yǎng)腱細胞相比，添加ADSCs增加了腱細胞的存活率以及Decorin和Tenascin C的表達量。這兩種蛋白參與肌腱的彈性修復(fù)，其缺乏會降低組織的機械性能，擾亂膠原纖維的構(gòu)建[44]。相比單獨培養(yǎng)ADSCs，與腱細胞共培養(yǎng)后ADSCs的存活率降低了，這可能與其向腱細胞分化有關(guān)。在微損傷愈合過程中，即使生長因子的表達在腱細胞影響下有所升高，ADSCs的分化并未受到影響。這些結(jié)果提示在肌腱愈合過程中，注射的ADSCs可能不是或不僅僅是因為分化能力而發(fā)揮積極作用，也可能是通過旁分泌誘導(dǎo)原位腱細胞生成目標組織[45]。

除了遺傳、性別、健康水平以及骨骼成熟度，年齡相關(guān)的雌激素水平改變也會影響肌腱組織的特性和愈合，年長的絕經(jīng)患者更容易發(fā)生肌腱損傷和肌腱病[46]。在未損傷的條件下，取自老年去卵巢大鼠的自體ADSCs和取自幼年健康大鼠的ADSCs都能促進老年去卵巢大鼠腱細胞的增殖能力和膠原(Col1a1/Col3a1)比率；但是在微損傷條件下，將幼年大鼠的ADSCs與老年去卵巢大鼠的腱細胞共培養(yǎng)更有利于促進腱細胞增殖、膠原比率和愈合率的升高[47]。這提示在治療老年絕經(jīng)患者的肌腱病時，同種異體移植健康人群的ADSCs可能比自體移植患者的ADSCs更具優(yōu)勢。

3.3 ADSCs復(fù)合富血小板血漿(platelet rich plasma, PRP)

PRP是全血經(jīng)過梯度離心分離獲得的濃縮血小板血漿。一般而言，PRP的血小板含量至少要達到正常血的3～5倍。當PRP被激活后，血小板釋放出大量的生長因子，包括VEGF、IGF、PDGF、TGF-β和EGF等[48]，可協(xié)同損傷部位進行修復(fù)重建。在各種病理條件下的治療中，PRP可被直接注射入損傷部位[49]。國內(nèi)有研究顯示，在間接共培養(yǎng)環(huán)境誘導(dǎo)下，PRP的干預(yù)可影響ADSCs分泌胞外基質(zhì)，在體回植結(jié)果顯示PRP復(fù)合ADSCs有助于肌腱損傷的修復(fù)[50]。Uysal等[51]通過建立兔阿基里斯跟腱模型，將ADSCs與PRP聯(lián)合作用于斷裂的跟腱，4周后發(fā)現(xiàn)與單獨使用PRP相比，前者較后者的肌腱最大抗張力負荷明顯增加，Ⅰ型膠原、FGF、vEGF表達明顯升高，TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3表達降低。細胞示蹤發(fā)現(xiàn)ADSCs可以在活體內(nèi)分化成肌腱細胞，且這種分化11.53%可歸功于脂肪干細胞的直接作用。另外，有研究對非阿基里斯跟腱與跟骨結(jié)合部位(non-insertional)肌腱病的患者分別注射PRP和脂肪組織SVF，最后一次隨訪發(fā)現(xiàn)兩組患者VAS、AOFAS和VISA-A得分表現(xiàn)均有明顯改善，安全有效無副作用。但SVF注射組患者的改善效果更快，注射后15 d就有變化[52]，這提示對需要快速恢復(fù)體力活動水平的患者來說，注射ADSCs可能比只注射PRP更具優(yōu)勢。

3.4 ADSCs聯(lián)合水凝膠

與傳統(tǒng)的支架材料不同，水凝膠是一種能溶脹于水、但在水中不溶解的親水聚合物凝膠，介于固體和液體之間。通過共價鍵、氫鍵或范德華力等作用，相互交聯(lián)構(gòu)成三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，通常具有溫敏特性和(或)pH敏感性。在較低溫度下制備的液態(tài)水凝膠，可通過注射的方法將其植入病患部位，水凝膠到達病患部位后由于溫度升高(體溫)而轉(zhuǎn)換為固態(tài)。在原位成膠，形成具有一定機械強度和一定形狀并且可與體液進行交換的支架結(jié)構(gòu)[53]，這樣就避免了支架植入過程中對患者造成的創(chuàng)傷和痛苦，具有很高的應(yīng)用價值。

肌腱愈合取決于很多因素，其中包括細胞從腱旁組織到相鄰組織的遷移、細胞在損傷部位的增殖以及新生血管化。水凝膠可以作為運輸PRP中生長因子和細胞因子的生物學(xué)載體，也可為原位肌腱細胞的重建提供ECM。已有研究表明，Ⅰ型膠原是血漿的激活劑[54]，而水凝膠由大部分Ⅰ型膠原構(gòu)成，因此在注射前，PRP可以直接混合于水凝膠中而無需外源性激活。有研究將ADSCs接種于水凝膠進行培養(yǎng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)PRP和水凝膠聯(lián)合使用后顯著增強了ADSCs的增殖和遷移能力[55]。

理想的細胞支架應(yīng)具有一定的生物降解速率、良好的生物相容性和細胞親和性、有一定的力學(xué)性能、能滅菌消毒、具有特定三維多孔結(jié)構(gòu)。國內(nèi)有研究者制備了殼聚糖/β-甘油磷酸鈉/膠原(C/GP/CO)水凝膠支架，將hADSCs與該支架在低溫環(huán)境下均勻混合，于37℃成膠后體外培養(yǎng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)5 d后ADSCs活性很高，很少細胞死亡，且細胞很好地粘附在水凝膠材料內(nèi)，充分伸展，形態(tài)良好；將C/GP/CO水凝膠植入大鼠體內(nèi)4周無明顯急性炎癥反應(yīng)，周圍組織無感染及壞死，材料表現(xiàn)出良好的生物相容性；將體外成脂誘導(dǎo)的hADSCs與C/GP/CO水凝膠混合植入裸鼠體內(nèi)4周后發(fā)現(xiàn)，細胞能明顯向成脂方向分化，植入物內(nèi)形成大量脂滴，同時伴有血管自發(fā)生成[56]。

最近的一項研究表明，重組后的凍干水凝膠與新鮮制備的水凝膠相比，兩者對ADSCs的存活率沒有顯著差別，將接種了ADSCs的兩種水凝膠移植入大鼠背部后發(fā)現(xiàn)，前者對ADSCs的增殖能力、激活PRP能力均優(yōu)于后者，可作為臨床應(yīng)用的更優(yōu)選擇[57]。將新鮮制備的水凝膠即刻凍干有很多優(yōu)勢：①凍干可增加水凝膠的多孔性，膠原纖維的孔隙可以讓細胞增殖，在新生血管未建立起來時，多孔性更有利于氧氣和營養(yǎng)物質(zhì)的擴散，因而更有助于細胞增殖；②多孔性的增加可以暴露更多的Ⅰ型膠原，有助于PRP的激活；③凍干水凝膠在儲存30 d后仍具有增殖能力，其物理和生物學(xué)特性不發(fā)生改變，更方便于臨床應(yīng)用。

4 展望

急性或慢性肌腱損傷是導(dǎo)致運動員、體力勞動者以及老年群體殘疾的主要原因之一。自體移植或同種異體移植的治療策略不能提供長期的治療效果，愈合的肌腱不能完全恢復(fù)原始的力量和功能。因此，考慮到肌腱原位祖細胞有限的數(shù)量和自我再生能力，基于干細胞治療的發(fā)展，尋找肌腱組織工程種子細胞的可替代來源具有十分重要的意義。之前的研究已經(jīng)表明，注射自體或異體ADSCs可以提高肌腱的力學(xué)強度、愈合水平及功能恢復(fù)水平，促進膠原纖維的重新組建，防止病變和炎癥浸潤在體內(nèi)的惡化。然而，這些作用是由于ADSCs定植分化成肌腱組織，還是由于ADSCs促進鄰近原位細胞或因子發(fā)揮作用？其確切機制還不明確。由于腱細胞缺乏特異性的標志物，評價ADSCs向肌腱水平的分化大多采用幾種標志物(SCX、TNMD、COLⅠ等)相結(jié)合的方式，但僅僅從基因和蛋白的表達水平并不能充分證明ADSCs專門向腱細胞譜系發(fā)生了分化?？紤]到ADSCs向腱細胞分化過程中因子調(diào)控的復(fù)雜性，越來越多的研究開始利用腱細胞和ECM的相互作用與ADSCs共同應(yīng)用于肌腱損傷的治療，3D支架聯(lián)合ADSCs的培養(yǎng)當屬典型代表。從目前的研究來看，tECM和水凝膠聯(lián)合生長因子等手段對ADSCs向腱細胞分化的效果最好，其具有可注射水凝膠、操作簡單、塑型隨意、創(chuàng)傷小、可減少患者痛苦與風險等優(yōu)勢，將是今后組織工程支架發(fā)展的重要方向之一。另外，肌腱組織本身血供應(yīng)較少，氧含量低，當發(fā)生損傷與炎癥反應(yīng)時含氧量進一步下降，低氧分壓如何影響ADSCs參與肌腱損傷修復(fù)的機制有待更多研究。ADSCs中存在腱細胞標志物(TNMD、SSEA-4)相關(guān)的細胞亞群，其向肌腱譜系分化的能力也有所差異，通過分選或過表達等手段培養(yǎng)出最易于向肌腱譜系分化的ADSCs細胞群，并將其應(yīng)用于臨床研究，縮短肌腱損傷的修復(fù)時間、提高移植后的功能恢復(fù)效率和治療效果也是值得進一步探討的問題。

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