蔣艾廷， 李新玲,*， 姜淑娟， 妥彥峰， 錢 方， 馬鳳蓮， 韓京津， 牟光慶,*

(1.新疆天潤生物科技股份有限公司， 新疆 烏魯木齊 830088； 2.大連工業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院， 遼寧 大連 116034)

*李新玲，女，高級工程師，主要從事乳品方面的研究，通信作者；

*牟光慶，男，教授，博士，主要從事乳品方面的研究，通信作者。

益生菌是指在合適的劑量下能夠?qū)θ嘶騽游锂a(chǎn)生正面效益的活性微生物[1]，主要包括一些乳桿菌屬、雙歧桿菌屬和酵母[2-3]。酵母菌是與人們?nèi)粘Ｉ蠲芮邢嚓P(guān)的微生物之一，對人體的益生作用主要表現(xiàn)在免疫調(diào)節(jié)、吸收膽固醇、排毒和抑制病原菌繁殖等方面[4-6]，釀酒酵母因其獨(dú)特的微生物學(xué)特性和優(yōu)越的發(fā)酵性能，被廣泛地應(yīng)用于食品、飼料、醫(yī)藥、生物工程等領(lǐng)域[7-10]。

在發(fā)酵食品，如發(fā)酵乳制品、酒類以及面包的工業(yè)化生產(chǎn)過程中，釀酒酵母通常以直投式發(fā)酵劑的形式被添加進(jìn)基料中，以達(dá)到縮短發(fā)酵時(shí)間、減少生產(chǎn)成本、穩(wěn)定產(chǎn)品質(zhì)量的目的[11]。而發(fā)酵劑中微生物細(xì)胞的數(shù)量與活力是影響產(chǎn)品品質(zhì)的關(guān)鍵因素[12]，因此增殖培養(yǎng)成為制備高活性發(fā)酵劑的通用手段之一。目前國內(nèi)外研究人員[13-16]主要采用單因素結(jié)合響應(yīng)面的方法優(yōu)化微生物的增殖培養(yǎng)基，來獲得高濃度的細(xì)胞數(shù)量或代謝產(chǎn)物。發(fā)酵動力學(xué)主要是研究環(huán)境因素與微生物代謝活動之間的相互作用及隨時(shí)間變化的規(guī)律，客觀反映發(fā)酵過程的動態(tài)特征。羅建平等[17]研究了黑曲霉在優(yōu)化條件下發(fā)酵麥麩生產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的動力學(xué)模型，為β-葡萄糖苷酶的工業(yè)生產(chǎn)提供了參考。姜勇等[18]在優(yōu)化鼠李糖乳桿菌的發(fā)酵條件和培養(yǎng)基組成的基礎(chǔ)上建立了發(fā)酵動力學(xué)模型，發(fā)現(xiàn)高濃度的初始葡萄糖底物與代謝產(chǎn)物乳酸的積累會抑制發(fā)酵過程中細(xì)胞的生長。而有關(guān)釀酒酵母在增殖培養(yǎng)基中的生長規(guī)律、發(fā)酵動力學(xué)及模型鮮有報(bào)道，因此研究擬以一株優(yōu)良的乳源性釀酒酵母為實(shí)驗(yàn)菌株，通過正交與響應(yīng)面的方法優(yōu)化其增殖培養(yǎng)基配方與發(fā)酵條件，并在此基礎(chǔ)上研究和建立該菌的生長規(guī)律和葡萄糖消耗的動力學(xué)方程及模型，為實(shí)現(xiàn)釀酒酵母的高密度發(fā)酵及在奶啤生產(chǎn)中的應(yīng)用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)TR2由新疆天潤生物科技股份有限公司研發(fā)部選育，中科院微生物研究所鑒定；葡萄糖、蛋白胨、酵母膏、KH2PO4、檸檬酸均為國產(chǎn)分析純。

YPD液體培養(yǎng)基：葡萄糖20 g/L、蛋白胨20g/L、酵母膏10 g/L，115 ℃滅菌20 min。此培養(yǎng)基主要用于活化菌種。

YPD固體培養(yǎng)基：在YPD液體培養(yǎng)基的基礎(chǔ)之上加入質(zhì)量濃度0.02 g/mL的瓊脂，煮沸熔化滅菌而成。用于釀酒酵母的計(jì)數(shù)。

增殖培養(yǎng)基：按照單因素實(shí)驗(yàn)或響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)，在YPD液體培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上加入所需增殖因子配成。

1.2 儀器與設(shè)備

SW-CJ-2FD型超凈工作臺，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；S210-K 型pH計(jì)，梅特勒-托利多國際有限公司；Ci-L型顯微鏡，尼康儀器(上海)有限公司；Multiskan GO型酶標(biāo)儀，賽默飛世爾科技(中國)有限公司；ZHWY-200D型恒溫培養(yǎng)振蕩器，上海智城分析儀器制造有限公司；LRH-250F型生化培養(yǎng)箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；SX-500型自動高壓滅菌器，日本TOMY公司；5804R型高速離心機(jī)，德國Eppendorf公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1種子液的制備

用接種環(huán)挑取一環(huán)保藏于4 ℃冰箱的釀酒酵母，在YPD平板中劃線，放置于28 ℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)48 h；選取菌落形態(tài)飽滿的釀酒酵母接種于YPD液體培養(yǎng)基中，在溫度為28 ℃、轉(zhuǎn)速為150r/min的搖床中培養(yǎng)16～18 h以獲得種子液。

1.3.2單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

在YPD液體培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上配制成含不同質(zhì)量濃度的碳源、氮源與無機(jī)鹽的增殖培養(yǎng)基，其葡萄糖、菊糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖的添加量均分別為10、30、50、70、90 g/L；蛋白胨、硫酸銨、硝酸鉀、尿素的添加量均分別為5、10、20、30、40、50 g/L；硫酸鎂、氯化鉀、磷酸二氫鉀、氯化鈣的添加量均分別為0.5、1.0、3.0、5.0、7.0 g/mL，按體積分?jǐn)?shù)2%的接種量接入釀酒酵母種子液，靜止培養(yǎng)16 h后測定OD值。

1.3.3增殖培養(yǎng)基的優(yōu)化設(shè)計(jì)

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選取對釀酒酵母增殖影響顯著的碳源、氮源與無機(jī)鹽作為實(shí)驗(yàn)因素，采用Box-Behnken Design設(shè)計(jì)三因素三水平的實(shí)驗(yàn)，通過Design-Expert 8.05對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行響應(yīng)面分析，優(yōu)化培養(yǎng)基配方。

1.3.4發(fā)酵條件的優(yōu)化設(shè)計(jì)

在250 mL三角瓶中裝入60 mL增殖培養(yǎng)基，分別按1%、3%、5%、7%、9%的接種量接入培養(yǎng)基中，在溫度為28 ℃，轉(zhuǎn)速為150 r/min的搖床中培養(yǎng)16 h測定活菌數(shù)；在250 mL三角瓶中分別裝入40、60、80、100、120 mL的增殖培養(yǎng)基，在相同條件下培養(yǎng)16 h測定活菌數(shù)；在250 mL三角瓶中裝入60 mL增殖培養(yǎng)基，分別將初始pH值調(diào)節(jié)為4.0、4.5、5.0、5.5、6.0，在相同條件下培養(yǎng)16 h測定活菌數(shù)。根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選取裝液量、接種量以及培養(yǎng)基的初始pH值為主要因素，設(shè)計(jì)三因素三水平的正交試驗(yàn)。

1.3.5釀酒酵母生物量、OD值與葡萄糖濃度的測定

收集50 mL培養(yǎng)16 h后的菌懸液于離心管中，7 000 r/min離心10 min，在相同條件下用無菌水洗滌2次，采用干重法測定生物量[19]；使用光密度法測定菌懸液的OD600值，測定體積為100 μL；通過3,5-二硝基水楊酸(DNS)法測定離心后培養(yǎng)基中葡萄糖含量[20]。

1.3.6數(shù)據(jù)處理

采用Minitab 16軟件中的Fisher單因子多重比較對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，置信水平為95%，圖中不同字母表示同一因素不同水平之間差異顯著(p<0.05)；通過Matlab 2010b對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合；使用Origin 2016軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 釀酒酵母增殖培養(yǎng)基的優(yōu)化結(jié)果

2.1.1碳源對釀酒酵母生長的影響

碳源是指一切能滿足微生物生長繁殖所需碳元素的營養(yǎng)源，由于不同微生物所產(chǎn)生的酶系各不相同，因此對不同碳源的利用程度也存在差異[21]。釀酒酵母生長對葡萄糖、菊糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖的利用程度各不相同，隨著培養(yǎng)基中碳源質(zhì)量濃度的增加，釀酒酵母的OD值均呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢(見圖1)。這可能是由于碳源濃度過高導(dǎo)致培養(yǎng)基的滲透壓過高，不利于酵母生長[22]。當(dāng)以乳糖作為培養(yǎng)基的碳源時(shí)，與其他各組相比釀酒酵母的OD值最低，可能是釀酒酵母缺少與分解乳糖有關(guān)的酶類[23]。葡萄糖、蔗糖添加量為50 g/L，菊糖、麥芽糖添加量為30 g/L時(shí)，培養(yǎng)16 h后釀酒酵母的OD值最大，分別為0.742、0.633、0.456、0.506，其中50g/L的葡萄糖對釀酒酵母的增殖作用最為顯著(p<0.05)。當(dāng)葡萄糖添加量低于50 g/L或高于70 g/L、菊糖添加量低于30 g/L或高于50 g/L、蔗糖添加量低于50 g/L、麥芽糖添加量低于或高于30 g/L時(shí)，釀酒酵母的OD值均顯著地下降(p<0.05)。因此選擇50 g/L的葡萄糖進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

圖1 碳源種類及濃度對釀酒酵母生長的影響Fig.1 Effect of carbon sources and concentrations on growth of Saccharomyces cerevisiae

2.1.2氮源對釀酒酵母生長的影響

氮源的主要作用是為微生物細(xì)胞生長和代謝提供氮元素及能量，不同的氮源對微生物有不同的生理學(xué)效應(yīng)[24]。釀酒酵母對蛋白胨、硝酸鉀、硫酸銨、尿素的利用程度具有顯著差異，見圖2。當(dāng)以20 g/L蛋白胨、30 g/L硝酸鉀、5 g/L硫酸銨、5 g/L尿素作為培養(yǎng)基的氮源時(shí)，培養(yǎng)16 h后釀酒酵母的OD值最大，分別為0.762、0.583、0.620、0.474，其中20g/L的蛋白胨對釀酒酵母的增殖作用最為顯著(p<0.05)。當(dāng)培養(yǎng)基中蛋白胨濃度低于20 g/L、硝酸鉀濃度低于或高于30 g/L、硫酸銨濃度高于5 g/L、尿素濃度高于5 g/L時(shí)，釀酒酵母的OD值均顯著地下降(p<0.05)。因此選擇20 g/L的蛋白胨進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

圖2 氮源種類及濃度對釀酒酵母生長的影響Fig.2 Effect of nitrogen sources and concentration on growth of Saccharomyces cerevisiae

2.1.3無機(jī)鹽對釀酒酵母生長的影響

圖3 無機(jī)鹽種類及濃度對釀酒酵母生長的影響Fig.3 Effect of inorganic salt types and concentration on growth of Saccharomyces cerevisiae

無機(jī)鹽在微生物生長繁殖與合成目的產(chǎn)物的過程中起著十分重要的作用，如構(gòu)成細(xì)胞物質(zhì)、調(diào)解代謝產(chǎn)物及滲透壓等[25]。當(dāng)培養(yǎng)基中添加7.0 g/L硫酸鎂、1.0 g/L氯化鉀、3.0 g/L磷酸二氫鉀、7.0 g/L氯化鈣時(shí)，16 h后釀酒酵母的OD值最大，分別為0.702、0.700、0.781、0.725，其中3 g/L的磷酸二氫鉀對釀酒酵母的增殖作用最好(見圖3)。當(dāng)培養(yǎng)基中無機(jī)鹽濃度在0.5～7.0 g/L時(shí)，硫酸鎂、氯化鉀與氯化鈣對釀酒酵母的增殖作用不顯著(p≥0.05)，當(dāng)磷酸二氫鉀的濃度在1.0～7.0 g/L時(shí)，培養(yǎng)16 h后釀酒酵母的OD值無顯著差異(p≥0.05)，而當(dāng)磷酸二氫鉀的濃度在低于1 g/L時(shí)，培養(yǎng)16 h后釀酒酵母的OD值顯著地下降(p<0.05)。因此選擇3 g/L的磷酸二氫鉀進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

2.1.4響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化增殖培養(yǎng)基結(jié)果

將50 g/L的葡萄糖、20 g/L的蛋白胨、3.0 g/L的磷酸二氫鉀作為響應(yīng)面設(shè)計(jì)的中心點(diǎn)零(0)水平，其中葡萄糖、蛋白胨、磷酸二氫鉀的高(+)水平分別為70、30、5 g/L；低(-)水平分別為30、10、1 g/L。根據(jù)BBD原理設(shè)計(jì)以葡萄糖、蛋白胨、磷酸二氫鉀為因素，OD值為響應(yīng)值的分析實(shí)驗(yàn)，確定釀酒酵母的優(yōu)化培養(yǎng)基配方，響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表1，方差分析見表2。

對實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行回歸擬合分析，得到二次多元回歸模型：

Y=0.84+0.053A+0.044B-2.125×10-3C-
0.046AB-0.13A2-0.12B2-0.067C2。

(1)

表1 BBD設(shè)計(jì)及結(jié)果

表2 回歸模型方差分析

采用Design-Expert 8.05軟件對回歸模型進(jìn)行響應(yīng)面分析，可得到交互項(xiàng)顯著(p<0.05)的葡萄糖與蛋白胨對釀酒酵母OD值影響的響應(yīng)面二維等高線和三維立體圖(見圖4)，圖中橢圓排列越密集說明因素變化對結(jié)果影響越大。用此回歸模型預(yù)測葡萄糖、蛋白胨、磷酸二氫鉀的添加量分別為53.4、21.5 g/L和2.98 g/L時(shí)，釀酒酵母的吸光度最大為0.852。采用上述培養(yǎng)進(jìn)行驗(yàn)證，釀酒酵母的OD值為0.848與預(yù)測值相近，可見該模型能較好地預(yù)測實(shí)際培養(yǎng)基中釀酒酵母的生長情況。

圖4 葡萄糖與蛋白胨相互作用對釀酒酵母OD值的影響Fig.4 Effect of glucose and peptone on optical density of Saccharomyces cerevisiae

2.2 釀酒酵母培養(yǎng)條件的優(yōu)化結(jié)果

培養(yǎng)基的初始pH、溶氧與接種量對微生物生長都有重要的影響，如培養(yǎng)基的pH會影響菌體的生長、目的蛋白的表達(dá)和活性；溶氧會影響與微生物呼吸鏈有關(guān)的能量代謝；接種量會影響菌體的生長代謝[26-28]。因此選擇這3個(gè)因素進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果見表3。根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)，測定不同處理組的活菌數(shù)，結(jié)果如表4。各因素對于釀酒酵母活菌數(shù)的影響程度由大到小分別是 C、 B、A，較優(yōu)組合為 A2B3C2。由于此項(xiàng)組合在實(shí)驗(yàn)方案中不存在，因此將較優(yōu)組合與方案中活菌數(shù)最高的第9號正交試驗(yàn)進(jìn)行對比，驗(yàn)證結(jié)果。結(jié)果表明，當(dāng)裝液量為60 mL、接種量為5%、培養(yǎng)基初始pH為5.0時(shí)，釀酒酵母生長較好，其活菌數(shù)為6.64×108CFU/mL。

表3 較優(yōu)單因素實(shí)驗(yàn)條件

2.3 菌體生長動力學(xué)模型的建立

在分批發(fā)酵過程中菌體干質(zhì)量的增加能夠?qū)ψ陨砩L產(chǎn)生抑制作用，擁有S型曲線的Logistic模型能很好地反映出這一普遍規(guī)律。該模型可描述群體前期的生長與營養(yǎng)供給之間的非線性關(guān)系，在細(xì)菌發(fā)酵過程中得到廣泛應(yīng)用[29]。

(1)

表4 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

式(2)中：X為酵母生物量，g/L；t為發(fā)酵時(shí)間，h；μm為菌體最大比生長速率，h-1；Xm為最大生物量，g/L。當(dāng)t=0、X=X0時(shí)，對Logistic方程進(jìn)行積分變?yōu)椋?/p>

(3)

用Matlab軟件按式(3)對實(shí)驗(yàn)值進(jìn)行非線性擬合，計(jì)算得到動力學(xué)參數(shù)X0、Xm、μm分別為0.237、8.674、0.515，將其代入式(3)可得到菌體生長動力學(xué)方程：

(4)

由Logistic方程對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)擬合，結(jié)果見圖5。由圖5可知，該方程能夠很好地描述釀酒酵母分批發(fā)酵過程中菌體的生長情況，計(jì)算值與實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)吻合較好，相關(guān)系數(shù)R2=0.997 3。

圖5 菌體生長動力學(xué)模型擬合曲線Fig.5 Microbial growth kinetic model fitting curve

2.4 葡萄糖消耗動力學(xué)模型的建立

根據(jù)物料平衡，發(fā)酵過程中底物的消耗通常被用作新生菌體的合成、細(xì)胞基本生命活動的維持以及產(chǎn)物的合成[30]。因此，底物消耗速率可用與Luedeking-Piret相似的方程式來描述。

(5)

式(5)中：μ為菌體比生長速率，h-1；YG為菌體生長得率系數(shù)，g/g；YP為產(chǎn)物對基質(zhì)的得率系數(shù)，g/L；m為菌體對基質(zhì)的維持系數(shù)，g/(L·h)。

在菌體生長期階段，底物的消耗主要用于菌體生長和細(xì)胞維持上，因此方程(5)可轉(zhuǎn)化為：

(6)

當(dāng)t=t0時(shí)，X=X0，S=S0，將式(4)代入式(6)中積分，對分批發(fā)酵的數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合計(jì)算得到動力學(xué)參數(shù)YG=0.162 g/g，m=0.026 g/(L·h)，S0=49.57 g/L，將各參數(shù)值代入底物消耗動力學(xué)方程中整理得：

(7)

模型計(jì)算值與實(shí)驗(yàn)值的比較見圖6，結(jié)果表明該模型能很好地描述釀酒酵母在發(fā)酵過程葡萄糖濃度的變化，擬合的相關(guān)系數(shù)R2=0.978 4。

圖6 葡萄糖消耗動力學(xué)擬合曲線Fig.6 Glucose consumption kinetics fit curve

3 結(jié) 論

實(shí)驗(yàn)以釀酒酵母TR2為實(shí)驗(yàn)菌株在YPD液體培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上進(jìn)行增殖培養(yǎng)，通過單因素實(shí)驗(yàn)與響應(yīng)面試驗(yàn)分析確定了釀酒酵母TR2增殖的優(yōu)化培養(yǎng)基配方為葡萄糖53.4 g/L、蛋白胨21.5 g/L、酵母膏10 g/L、磷酸二氫鉀2.98 g/L；通過正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)確定了釀酒酵母TR2的優(yōu)化培養(yǎng)條件為初始pH值5.0、接種量5%、裝液量60 mL、搖床轉(zhuǎn)速150 r/min。在優(yōu)化條件下28 ℃培養(yǎng)16 h，釀酒酵母TR2細(xì)胞數(shù)量可達(dá)到6.64×108CFU/mL。同時(shí)以葡萄糖為限制性底物通過建立數(shù)學(xué)模型分析釀酒酵母生長與底物的消耗過程，結(jié)果表明實(shí)驗(yàn)值與模型擬合較好，R2分別為0.997 3與0.978 4，描述了釀酒酵母在生長代謝過程中生物量與葡萄糖消耗之間的聯(lián)系，為釀酒酵母TR2的發(fā)酵過程控制及在奶啤生產(chǎn)應(yīng)用環(huán)節(jié)設(shè)計(jì)提供理論參考。

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