田圓圓，劉絨梅，耿 琦，史健陽，張國(guó)建，孫 群

（四川大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 生物資源與生態(tài)環(huán)境教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 610064）

0 引 言

四川傳統(tǒng)腌臘肉制品因其獨(dú)特的風(fēng)味受到廣大消費(fèi)者的喜愛。四川傳統(tǒng)腌臘肉制品屬于自然發(fā)酵肉制品，依賴于原料肉和加工環(huán)境中的微生物群[1]；因此，其中存在豐富的具有地域特色的微生物菌種資源。

腌臘肉制品中存在廣泛的氧化反應(yīng)，包括脂肪氧化和蛋白氧化。適度的氧化對(duì)產(chǎn)品風(fēng)味和滋味的形成有重要貢獻(xiàn)，但過度的脂肪氧化和蛋白質(zhì)氧化會(huì)影響產(chǎn)品的質(zhì)量，給產(chǎn)品帶來持水性降低、質(zhì)構(gòu)變差、顏色變暗、風(fēng)味變差等問題[2-3]。因此，減緩腌臘肉制品的氧化反應(yīng)，對(duì)保證產(chǎn)品質(zhì)量和延長(zhǎng)貨架期具有重要意義。阻斷肉與肉制品中的自由基反應(yīng)是減緩氧化的最有效途徑之一?，F(xiàn)如今，大部分抗氧化劑來自化學(xué)合成和天然物質(zhì)的提取，但是化學(xué)合成的抗氧化劑可能會(huì)生成新的自由基造成產(chǎn)品氧化[4]，而天然抗氧化物質(zhì)又有提取純化過程較復(fù)雜的缺點(diǎn)。已有研究表明，某些乳酸菌具有抗氧化的能力，乳酸菌具有生長(zhǎng)周期短、安全和價(jià)格低廉的優(yōu)勢(shì)[5]。

乳酸菌是發(fā)酵肉制品中的主導(dǎo)微生物，對(duì)發(fā)酵肉制品的質(zhì)量和安全起著至關(guān)重要的作用[6]，乳酸菌在發(fā)酵肉制品中的作用得到了廣泛的研究。用于發(fā)酵肉制品的乳酸菌的主要發(fā)酵特征需要滿足肉類發(fā)酵劑要求，即具有蛋白酶和脂肪酶活性，不產(chǎn)NH3、生物胺、H2S和CO2，能夠耐受6%NaCl和150mg/kg NaNO2，以及能夠在10～30℃生長(zhǎng)等[7]。已有的研究表明某些乳酸菌具有抗氧化能力，通常具有抗氧化能力的乳酸菌具有清除羥自由基和二苯苦味肼基（DPPH自由基）能力，以及還原能力和抗脂質(zhì)過氧化能力。如從中國(guó)傳統(tǒng)發(fā)酵食品中分離的Lactobacillus plantarum對(duì)羥自由基和二苯苦味肼基的清除率分別達(dá)到44.31%和53.05%[8]，從哈爾濱紅腸中分離的Pediococcus pentosaceus能夠清除羥自由基和DPPH自由基，具有還原能力和抗脂質(zhì)過氧化能力，并且能夠顯著降低發(fā)酵香腸的脂肪氧化和蛋白質(zhì)氧化程度[4]。同樣L.fermentum具有清除羥自由基和DPPH自由基的能力[9]。

本研究從采集于四川多個(gè)地區(qū)的7種農(nóng)家自制傳統(tǒng)腌臘肉制品中篩選乳酸菌，通過16S rDNA測(cè)序?qū)Y選菌株進(jìn)行鑒定，并檢測(cè)篩選菌株的主要發(fā)酵特征，對(duì)主要發(fā)酵特征滿足肉類發(fā)酵要求的菌株，進(jìn)一步檢測(cè)其清除羥自由基、DPPH自由基的能力，還原能力和抗脂質(zhì)過氧化能力，以評(píng)價(jià)其抗氧化能力。從而篩選出有望應(yīng)用于發(fā)酵肉制品并減緩產(chǎn)品氧化的潛力菌株。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

一共7個(gè)樣品采集于四川省多個(gè)地區(qū)農(nóng)戶，包括四川省眉山市、都江堰市、成都市、資陽市和宜賓市。樣品采集后于4℃保存，2d內(nèi)進(jìn)行篩菌實(shí)驗(yàn)。

引物27F、1492R合成于Invitrogen（上海）貿(mào)易有限公司；細(xì)菌DNA提取試劑盒，北京天根公司；亞硝酸鈉、精氨酸、半胱氨酸、醋酸鉛、溴甲酚紫、石蕊、中性紅、乙酸鈉、蛋白胨、吐溫80、葡萄糖、酵母浸粉、氯化鈉等生化試劑，均購自成都金蜀都化驗(yàn)設(shè)備有限公司。鄰二氮菲、DPPH、亞油酸、抗壞血酸，購于成都云德科技有限公司。

MRS培養(yǎng)基按文獻(xiàn)[4]配制：10 g蛋白胨、10 g牛肉膏、5 g酵母浸粉、20 g葡萄糖、5 g乙酸鈉、2 g K2HPO4、2 g 檸 檬 酸 銨 、0.5 g MgSO4·7H2O、0.25 g MnSO4·4H2O、1 mL 吐溫 80、20 g瓊脂，補(bǔ)水至 1 L，121℃滅菌15min。

篩選菌株主要發(fā)酵特征檢測(cè)培養(yǎng)基按照文獻(xiàn)[10-11]配制：

蛋白酶活性檢測(cè)培養(yǎng)基：10g脫脂奶粉，100 mL蒸餾水，4mL濃度為25g/L的石蕊，分裝試管，高度為 4～5cm，113℃滅菌15min。

脂肪酶活性檢測(cè)培養(yǎng)基：MRS固體培養(yǎng)基中加入15%的豬油和中性紅指示劑，121℃滅菌20min。

精氨酸產(chǎn)NH3培養(yǎng)基：10g蛋白胨、20g精氨酸、5 g酵母浸粉、0.5 g葡萄糖、5 g乙酸鈉、2 g K2HPO4、2 g 檸檬酸鈉、0.5 g MgSO4·7H2O、0.25 g MnSO4·4H2O、1mL吐溫80、20g瓊脂，補(bǔ)水至1L，121℃滅菌15min。

產(chǎn)生物胺檢測(cè)培養(yǎng)基：5 g蛋白胨，3 g酵母膏，1 g葡萄糖，1 mL濃度為1.6%的溴甲酚紫-乙醇溶液，1L蒸餾水，加熱溶解，加入5gL-氨基酸或者10g DL-氨基酸，調(diào)pH至6.8。對(duì)照培養(yǎng)基不加氨基酸。分裝小試管，上面滴加一層液體石蠟，115℃滅菌10min。

產(chǎn)H2S培養(yǎng)基（醋酸鉛紙條法）：10 g蛋白胨，10g牛肉膏，5g氯化鈉，0.5g半胱氨酸，1L蒸餾水，調(diào) pH至7.0～7.4，112℃滅菌 20min。

葡萄糖產(chǎn)CO2培養(yǎng)基：10g蛋白胨，5 g氯化鈉，1L蒸餾水，加熱溶解，待冷卻后將pH調(diào)至7.4。加入1～2 mL濃度為1.6%的溴甲酚紫乙醇溶液，再加入葡萄糖使葡萄糖終濃度為20%，分裝試管，將杜氏小管倒置放入試管中，121℃滅菌30min。

耐鹽試驗(yàn)培養(yǎng)基：在MRS液體培養(yǎng)基中加入NaCl，使得NaCl的終濃度為6%。

耐亞硝酸鹽試驗(yàn)培養(yǎng)基：在MRS液體培養(yǎng)基中加入NaNO2，使得NaNO2的終濃度為150mg/L。

1.2 主要儀器與設(shè)備

S 1000 PCR儀，Wide Mini-Sub Cell GT型水平電泳槽，PowerPac Basic型電泳儀電源，Universal Hood II型凝膠成像系統(tǒng)，美國(guó)Bio-rad公司；Micro 21 R型高速冷凍離心機(jī)，美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司；AFZ-1002-U型超純水儀，美國(guó)Aquapro公司；UV-2450紫外分光光度計(jì)，日本Shimadzu公司。

1.3 乳酸菌的分離與鑒定

在無菌條件下，稱取5 g樣品，剪碎，放入裝有50 mL無菌生理鹽水的三角瓶中，室溫震蕩30 min。靜置數(shù)分鐘，取1 mL上清液依次進(jìn)行10倍梯度稀釋涂布，37℃培養(yǎng)48h。根據(jù)培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)和初步鏡檢觀察，挑選不同的特征菌落，經(jīng)多次劃線分離純化。純化之后的菌株增殖培養(yǎng)之后，提取菌株DNA，并進(jìn)行擴(kuò)增，測(cè)序。測(cè)序結(jié)果輸入到NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行序列比對(duì)。

1.4 篩選菌株在不同溫度下生長(zhǎng)情況的檢測(cè)

將篩選菌株接種于MRS液體培養(yǎng)基中，分別于5，10，15，20，25，30℃下培養(yǎng) 24h，測(cè)定 600nm 處OD值。

1.5 篩選菌株主要發(fā)酵特征的檢測(cè)

將篩選菌株接種到相應(yīng)的發(fā)酵特征檢測(cè)培養(yǎng)基，培養(yǎng)檢測(cè)。

1.6 篩選菌株的培養(yǎng)及無細(xì)胞提取液的制備

篩選菌株采用MRS液體培養(yǎng)基，37℃靜置培養(yǎng)24h，所有的菌株經(jīng)過3次傳代。培養(yǎng)液離心（10000g，10min，4℃），收集菌體。0.02mol/L磷酸鈉緩沖液洗滌菌體3次，菌體重懸于滅菌的0.02 mol/L磷酸鈉緩沖液，菌體濃度調(diào)至107CFU/mL，得到細(xì)胞懸浮液。冰浴超聲破碎細(xì)胞懸浮液，離心（10000g，10min，4℃），收集上清液，即為無細(xì)胞提取液。

1.7 篩選菌株清除羥自由基和DPPH自由基能力的測(cè)定

篩選菌株對(duì)羥自由基的清除能力的測(cè)定方法參照文獻(xiàn)[11]。依次取1mL鄰二氮菲（0.75mmol/L），2mL磷酸鹽緩沖溶液（0.2 mol/L，pH 7.4）和 1 mL樣品（細(xì)胞懸浮液或者無細(xì)胞提取液）混勻。再加入1mL H2O2（0.01%），37℃水浴反應(yīng) 90min。 加入細(xì)胞懸浮液的一組，離心，取上清液。分別測(cè)定上清液在536nm處的吸收值。

式中：AS——樣品的吸收值；

A0——沒加樣品的對(duì)照組的吸收值；

A——沒加樣品和H2O2的空白吸收值。

篩選菌株對(duì)DPPH自由基清除能力的測(cè)定方法參照He[12]與Wang[9]的方法稍加改進(jìn)。取1mL樣品（細(xì)胞懸浮液或者無細(xì)胞提取液）和2 mL DPPH（0.2mmol/L，溶于95%乙醇），混勻。室溫暗反應(yīng)30min。加入細(xì)胞懸浮液的一組，離心，取上清液。分別測(cè)定上清液在517nm處的吸收值。

式中：AS——實(shí)驗(yàn)組的吸收值；

AB——加入95%乙醇和樣品的空白吸收值；AC——加磷酸鹽緩沖溶液和DPPH溶液的對(duì)照組的吸收值。

1.8 篩選菌株還原能力和抗脂質(zhì)過氧化能力的測(cè)定

篩選菌株還原能力的測(cè)定參考文獻(xiàn)[13]的方法，并略有改進(jìn)。依次取0.5mL樣品（細(xì)胞懸浮液或者無細(xì)胞提取液），0.5mL磷酸鹽緩沖溶液（0.2 mol/L，pH 6.6）和 0.5 mL 鐵氰化鉀溶液（1%），混勻，50℃水浴反應(yīng)20min。加入0.5mL三氯乙酸溶液（10%），離心（3 000g，5min），取 500μL 上清液和 200 μL 三氯化鐵溶液混勻，靜置10min。測(cè)定在700nm處的吸收值。吸收值越大，還原活性就越大。

菌株抗脂質(zhì)過氧化能力的測(cè)定參照Lee等[14]的方法。取0.5 mL磷酸鹽緩沖溶液 （0.02 mol/L，pH 7.4），1 mL 亞油酸乳化液，0.2 mL FeSO4溶液（0.01%），0.02 mL抗壞血酸（0.01%）和 0.4 mL樣品（細(xì)胞懸浮液或者無細(xì)胞提取液）混勻，37℃反應(yīng)12h。吸取1mL反應(yīng)液，0.1mL三氯乙酸溶液（4%），1 mL硫代巴比妥酸溶液（0.8%）和0.1 mL 2，6-二叔丁基-4-甲基苯酚溶液（0.4%）混勻。100℃下反應(yīng)30min，冷卻。加入1mL正丁醇抽提，離心（1800g，10min）吸取上清液，測(cè)532nm處吸收值（AS）。 以磷酸鹽緩沖液代替樣品為對(duì)照（AB）。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳酸菌的分離鑒定

從四川傳統(tǒng)腌臘肉制品中共分離純化出乳酸菌逾100株，通過比較菌落形態(tài)及鏡檢觀察，共挑選40株乳酸菌進(jìn)行分子鑒定，鑒定結(jié)果如表1所示。各菌株與NCBI BLAST數(shù)據(jù)庫檢索得到的最相似模式菌株同源性均大于或等于99%。初步鑒定出有7種不同的乳酸菌。所占比例最多的是Weissella hellenica，其次是Leuconostoc mesenteroides。分離到的乳酸菌，在已有的研究報(bào)道中，除W.confusa被報(bào)道為致病菌外[15]，其余均在肉類發(fā)酵劑使用，因此舍去W.confusa，然后挑選出初步判斷為不一樣的8株菌株進(jìn)行進(jìn)一步研究。對(duì)這8株菌進(jìn)行編號(hào)為L(zhǎng)1：W.hellenica strain；L2：L.plantarum； L3：W.hellenica；L4：L.mesenteroides； L5：L.curvatus；L6：L.plantarum；L7：W.cibaria；L8：W.viridescens。

2.2 篩選菌株的主要發(fā)酵特征

用作肉類發(fā)酵劑的菌株需要滿足肉類發(fā)酵劑的要求，即具有蛋白酶和脂肪酶活性，不產(chǎn)NH3、不產(chǎn)生物胺、不產(chǎn)H2S、不產(chǎn)CO2、能夠耐受6%NaCl和150mg/kg NaNO2等[9]。篩選菌株的主要發(fā)酵特征見表 2，篩選菌株中 L2、L3、L4、L5、L6、L8 具有分解蛋白的能力。所有篩選菌株均不具有分解脂質(zhì)、產(chǎn)NH3、產(chǎn)生物胺、產(chǎn)H2S和產(chǎn)CO2的能力。所有篩選菌株均能夠耐受6%NaCl和150mg/kg NaNO2，其中L6對(duì)NaCl的耐受性最差，耐受性僅為23.22%，L7和L8對(duì)NaNO2的耐受性相對(duì)較差，NaNO2耐受性分別為72.29%和72.55%。

表1 從四川傳統(tǒng)腌臘肉制品中分離的乳酸菌的種類及所占比例

2.3 篩選菌株在不同溫度下生長(zhǎng)情況

制備發(fā)酵肉制品原料時(shí)的溫度范圍為4～7℃，發(fā)酵過程的溫度范圍為18～24℃，干燥成熟過程的溫度范圍為12～15℃。用作肉類發(fā)酵劑的菌株要求能夠在5～30℃存活或生長(zhǎng)[6]。篩選菌株在不同溫度的生長(zhǎng)情況如圖1所示，篩選到的菌株在5℃都幾乎不生長(zhǎng)，L1和L7適應(yīng)的溫度范圍較窄，在5～20℃都不生長(zhǎng)，而篩選到的其他菌株適應(yīng)的溫度范圍較寬，在15～30℃均能生長(zhǎng)，在30℃生長(zhǎng)最好，其中L2和L4在低溫下生長(zhǎng)能力較強(qiáng)，這與肉類發(fā)酵劑的要求相符。因此舍去L1和L7，對(duì)其余篩選菌株進(jìn)一步研究。

圖1 篩選菌株在不同溫度下生長(zhǎng)情況

表2 篩選菌株的主要發(fā)酵特征1）-2）

2.4 篩選菌株清除羥自由基和DPPH自由基能力

檢測(cè)對(duì)DPPH自由基和羥自由基的清除能力是評(píng)價(jià)抗氧化能力的常用有效方法。為了初步判斷具有抗氧化能力的物質(zhì)在胞內(nèi)還是胞外，同時(shí)檢測(cè)了細(xì)胞懸浮液和無細(xì)胞提取液的清除能力。由圖2可以看出，所有篩選菌株的無細(xì)胞提取液和細(xì)胞懸浮液均具有清除DPPH自由基和羥自由基的能力，L6的細(xì)胞懸浮液清除能力最強(qiáng)，清除率分別至24.16%和52.48%。所有篩選菌株的細(xì)胞懸浮液對(duì)DPPH自由基的清除能力均強(qiáng)于其無細(xì)胞提取液的清除能力。L2、L3、L8的無細(xì)胞提取液和細(xì)胞懸浮液對(duì)羥自由基的清除率均高于20%。雖然用于實(shí)驗(yàn)的菌體濃度（107cells/mL）比文獻(xiàn)[16]的菌體濃度（1010cells/mL）低，但對(duì)自由基的清除率卻高于其實(shí)驗(yàn)結(jié)果。已有研究表明，細(xì)胞懸浮液具有的抗氧化能力與菌體表面的蛋白和多糖有關(guān)[6]，無細(xì)胞提取液具有的抗氧化能力與細(xì)胞內(nèi)的抗氧化酶有關(guān)，例如谷胱甘肽過氧化物酶，過氧化氫酶，超氧化物歧化酶等[17]。

圖2 篩選菌株DPPH自由基和羥自由基清除能力

2.5 篩選菌株還原能力和抗脂質(zhì)過氧化能力

圖3 篩選菌株還原能力

圖4 篩選菌株抑制脂質(zhì)過氧化能力

對(duì)還原能力和抗脂質(zhì)過氧化能力的檢測(cè)同樣是評(píng)價(jià)抗氧化能力的常用指標(biāo)之一。已有研究報(bào)道中將在700nm處的吸收值達(dá)到0.040視為具有較高的還原能力[4]，圖3表明篩選的菌株均具有較高還原能力，尤其是L5和L6。細(xì)胞懸浮液具有還原能力與細(xì)胞表面的多糖和蛋白有關(guān)，而無細(xì)胞提取液具有還原能力與細(xì)胞內(nèi)的抗氧化物質(zhì)有關(guān)，如NADH、NADPH、谷胱甘肽、尿酸等[18]。圖4表明，除L6的無細(xì)胞提取液和L8的細(xì)胞懸浮液不具有抗脂質(zhì)過氧化能力，其余篩選菌株的無細(xì)胞提取液和細(xì)胞懸浮液菌體均具有抗脂質(zhì)過氧化能力，抗脂質(zhì)過氧化率均高于20%，L5抗脂質(zhì)過氧化率最高，至63.36%。篩選菌株具有抗脂質(zhì)過氧化能力可能是因?yàn)樗鼈兡軌蚯宄蹶庪x子[19]。

3 結(jié)束語

本研究從四川傳統(tǒng)腌臘肉制品中篩選出8株乳酸菌，綜合來看，篩選菌株中L4，即L.mesenteroides，不僅主要發(fā)酵特征滿足肉類發(fā)酵劑的要求，對(duì)NaCl和NaNO2耐受性較強(qiáng)，適應(yīng)的溫度范圍寬，在低溫下生長(zhǎng)能力較強(qiáng)，還具有較強(qiáng)的抗氧化能力。結(jié)合L4在篩選菌株中所占比例較大這一實(shí)驗(yàn)結(jié)果，猜測(cè)L4對(duì)四川傳統(tǒng)腌臘肉制品的品質(zhì)具有重要貢獻(xiàn)。因此從四川農(nóng)家自制傳統(tǒng)腌臘肉制品篩選出的具有抗氧化能力的L.mesenteroides值得進(jìn)一步研究，有望開發(fā)成具有抗氧化能力的肉類發(fā)酵劑，用于發(fā)酵肉制品生產(chǎn)，減緩產(chǎn)品氧化、保證產(chǎn)品質(zhì)量和延長(zhǎng)產(chǎn)品貨架期。

[1]JANSSENS M，MYTER N，DE V L，et al.Community dynamics ofcoagulase-negative staphylococciduring spontaneous artisan-type meat fermentations differ between smoking and moulding treatments[J].International Journal of Food Microbiology，2013，166（1）：168-175.

[2]FALOWO A B，F(xiàn)AYEMI P O，MUCHENJE V.Natural antioxidants against lipid-protein oxidative deterioration in meat and meat products：A review[J].Food Research International，2014，64（22）：171-181.

[3]UTRERA M，ARMENTEROS M，VENTANAS S，et al.Pre-freezing raw hams affects quality traits in cooked hams：Potential influence of protein oxidation[J].Meat Science，2012，92（4）：596-603.

[4]CHEN Q，KONG B，SUN Q，et al.Antioxidant potential of a unique LAB culture isolated from Harbin dry sausage：In vitro and in a sausage model[J].Meat Science，2015，110：180-188.

[5]張?zhí)觳瑢幭脖?乳酸菌對(duì)自由基清除能力的研究[J].中國(guó)乳品工業(yè)，2007，35（4）：10-12.

[6]LIU S，HAN Y，ZHOU Z.Lactic acid bacteria in traditional fermented Chinese foods[J].Food Research International，2011，44（3）：643-651.

[7]AMMOR M S，MAYO B.Selection criteria for lactic acid bacteria to be used as functional starter cultures in dry sausage production： An update[J].Meat Science，2007，76（1）：138.

[8]LI S，ZHAO Y，ZHANG L，et al.Antioxidant activity ofLactobacillus plantarumstrains isolated from traditional Chinese fermented foods[J].Food Chemistry，2012，135（3）：1914-1919.

[9]WANG A N，YI X W，YU H F，et al.Free radical scavenging activity ofLactobacillus fermentumin vitro and its antioxidative effect on growing-finishing pigs.[J].Journal of Applied Microbiology，2009，107（4）：1140-1148.

[10]陳紅征，楊潔.發(fā)酵馬肉中乳酸菌的分離篩選與鑒定[J].食品科技，2010（1）：30-33.

[11]帥瑾.傳統(tǒng)自然發(fā)酵四川香腸中乳酸菌的分離、鑒定及其應(yīng)用[D].雅安：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)，2013.

[12]HE Z，WANG X，LI G，et al.Antioxidant activity of prebiotic ginseng polysaccharides combined with potential probioticLactobacillus plantarumC88[J].International Journal of Food Science&Technology，2015，50（7）：1673-1682.

[13]王曦，羅霞，許曉燕，等.不同乳酸菌菌株抗氧化能力的比較研究[J].食品科學(xué)，2010，31（9）：197-201.

[14]LEE J，HWANG K T，CHUNG M Y，et al.Resistance ofLactobacillus caseiKCTC 3260 to reactive oxygen species （ROS）： role for a metal ion chelating effect[J].Journal of Food Science，2010，70（8）：388-391.

[15]VELA A I，PORRERO C，GOYACHE J，et al.Weissella confusainfection in primate （Cercopithecus mona）[J].E-merging Infectious Diseases，2003，9（10）：1307-1309.

[16]王燚.抗氧化肉品發(fā)酵劑的篩選及其在羊肉香腸中的應(yīng)用[D].雅安：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)，2008.

[17]ZHANG Y，LI Y.Engineering the antioxidative properties of lactic acid bacteria for improving its robustness[J].Current Opinion in Biotechnology，2013，24（2）：142.

[18]LIN M Y，YEN C L.Antioxidative ability of lactic acid bacteria[J].Journal of Agricultural&Food Chemistry，1999，47（4）：1460.

[19]AHOTUPA M，SAXELIN M，KORPELA R.Antioxidative properties ofLactobacillusGG[J].Nutrition Today，1996，31（6）：51.