★ 肖愛(ài)嬌 歐陽(yáng)昕 陳明人

(江西中醫(yī)藥大學(xué) 南昌 330004)

腦卒中后抑郁癥(post-stroke depression, PSD)是腦血管病的常見(jiàn)并發(fā)癥，是指腦卒中后出現(xiàn)以快感缺失為核心癥狀的不同程度的抑郁狀態(tài)，屬于繼發(fā)性抑郁癥的一種[1]。據(jù)報(bào)道，PSD總發(fā)生率在40%～50%[2]。PSD不僅對(duì)患者神經(jīng)功能的恢復(fù)產(chǎn)生負(fù)面影響，而且加重患者認(rèn)知損害。然而目前大多研究關(guān)注成年后發(fā)生的PSD，而對(duì)于新生兒缺氧缺血性腦病(hypoxic-ischemic encephalopathy, HIE)后繼發(fā)的PSD研究報(bào)道較少。實(shí)際上，新生兒HIE后抑郁癥(即PSD)，除產(chǎn)生上述危害外，還可能影響兒童的生長(zhǎng)發(fā)育，導(dǎo)致生活質(zhì)量明顯下降，給個(gè)人和家庭帶來(lái)無(wú)盡的煩惱，也給國(guó)家和社會(huì)帶來(lái)不容忽視的危害。據(jù)報(bào)道，祖國(guó)醫(yī)學(xué)的艾灸療法治療PSD具有一定的效果[3]。那么，新生小鼠PSD，其體質(zhì)量和行為學(xué)有哪些變化？艾灸對(duì)新生小鼠PSD是否具有改善作用？為此，本研究在前期HIE研究[4-6]的基礎(chǔ)上，制備PSD小鼠模型，觀察艾灸“百會(huì)”穴對(duì)PSD小鼠體質(zhì)量、行為學(xué)測(cè)試結(jié)果的影響，為下一步的研究奠定基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物與分組 29只7d ICR新生小鼠，雌雄不限，購(gòu)自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。首先將29只7d新生小鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組(6只)和缺氧缺血性腦病(HIE)模型組(23只)；至術(shù)后3w時(shí)，再將存活的16只HIE模型小鼠隨機(jī)分為PSD模型組(9只)和艾灸組(7只)。PSD模型組：生后7d時(shí)，制備新生小鼠HIE模型；于術(shù)后3w時(shí)，給予HIE模型小鼠21d慢性不可預(yù)見(jiàn)性溫和應(yīng)激(chronic unexpected mild stimulus,CUMS)。艾灸組(C)：同PSD模型組，并于每日應(yīng)激后艾灸“百會(huì)”穴，1次/d，35min/次，共21d。假手術(shù)組，只作頸部手術(shù)，分離但不閉合頸總動(dòng)脈，不缺氧，不給予CUMS。

1.1.2 主要儀器 頭戴式手術(shù)顯微鏡(DL-SSJ，中國(guó)DL公司)，恒溫監(jiān)控器(K023049，美國(guó)Harvard儀器公司)、數(shù)顯恒溫水浴鍋(HH-4，國(guó)華電器有限公司)，動(dòng)物行為跟蹤系統(tǒng)(EthoVision XT，荷蘭Noldus公司)。

1.2 方法

1.2.1 PSD模型制備 分兩步進(jìn)行。

首先，制備HIE新生小鼠模型，參照文獻(xiàn)[4-6]進(jìn)行。7d新生小鼠在異氟烷吸入麻醉狀態(tài)下行頸部正中切口，分離、閉合左側(cè)頸總動(dòng)脈，縫合傷口；術(shù)后動(dòng)物在室溫中恢復(fù)和母乳喂養(yǎng)2h后，進(jìn)行缺氧處理，即將動(dòng)物置于37℃密閉艙，通入氮?dú)?N2)，調(diào)節(jié)氧氣濃度為8%，100 min后將動(dòng)物取出。

其次，制備PSD小鼠模型。自術(shù)后3w始，給予HIE模型小鼠21d CUMS。CUMS具體操作按Willner等[7]的方法并稍加改進(jìn)，將動(dòng)物每周隨機(jī)給予冰水游泳(4℃，3min)、束縛(1h)、搖晃(30min)、夾尾(1 min)、禁水(24h)、禁食(24h)，晝夜顛倒，以制備PSD小鼠模型。

1.2.2 艾灸取穴與方法 將艾灸組小鼠頭部的毛發(fā)剪去，露出“百會(huì)”[8]，作為艾灸穴位。

艾灸方法：用直徑0.4cm，長(zhǎng)10cm的艾條(江西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院制)，距穴位2cm左右溫和灸小鼠，1次/ d，35min/次，共21d。

1.2.3 小鼠體質(zhì)量稱量 于應(yīng)激前1d、應(yīng)激1w和3w時(shí)使用分析天平進(jìn)行體質(zhì)量稱量。

1.2.4 小鼠行為學(xué)觀察 ①Open-Field測(cè)試：于應(yīng)激前1d、應(yīng)激1w和3w時(shí)，用自制的敞箱進(jìn)行測(cè)試。以小鼠穿越的格子數(shù)作為水平活動(dòng)得分(crossing)，動(dòng)物穿越1格為1分，如動(dòng)物沿線行走，每10cm為1分。以直立次數(shù)為垂直活動(dòng)得分(rearing)，雙前肢離地為1分。每只動(dòng)物測(cè)試1次，3min/次。Open-Field測(cè)試中的水平活動(dòng)得分反映小鼠的活動(dòng)度，垂直活動(dòng)得分反映小鼠對(duì)周圍事物的興趣高低。

②蔗糖水?dāng)z入量測(cè)試：于應(yīng)激前1d、應(yīng)激1w和3w時(shí)進(jìn)行測(cè)試。每只動(dòng)物同時(shí)放入飲用水和1%的蔗糖水，1h后稱量各只小鼠的飲用水量及蔗糖水消耗量，計(jì)算糖水消耗百分比。糖水消耗試驗(yàn)反映小鼠對(duì)獎(jiǎng)賞的快感反應(yīng)。

③空間學(xué)習(xí)記憶力測(cè)試：于艾灸治療結(jié)束后，采用Morris水迷宮測(cè)試小鼠的逃避潛伏期，2次/d，連續(xù)5d。測(cè)試方法：將測(cè)試時(shí)間設(shè)置為60s，操作者分別從兩個(gè)入水點(diǎn)將小鼠面向池壁放入水中，觀察并記錄小鼠在60s內(nèi)找到并爬上平臺(tái)所需的時(shí)間，即逃避潛伏期。小鼠如果在60s內(nèi)仍未找到平臺(tái)，則將其牽引至平臺(tái)停留10s，引導(dǎo)其學(xué)習(xí)記憶，潛伏期記為60s。逃避潛伏期越短，學(xué)習(xí)記憶力越好。

2 結(jié)果

2.1 艾灸對(duì)PSD模型小鼠體質(zhì)量的影響 從表1可以看到，于應(yīng)激前1d，假手術(shù)組小鼠的體質(zhì)量均高于模型組、艾灸組小鼠(P<0.05)，而模型組、艾灸組兩組之間體質(zhì)量無(wú)明顯差別(P>0.05)；應(yīng)激1w時(shí)，3組小鼠體質(zhì)量增長(zhǎng)速度不一致，假手術(shù)組小鼠呈現(xiàn)較快增長(zhǎng),與模型組、艾灸組之間均具有明顯差別(P<0.05)，而模型組、艾灸組小鼠體質(zhì)量增長(zhǎng)緩慢，尤以模型組增長(zhǎng)更慢,后兩者之間差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；應(yīng)激3w時(shí)，假手術(shù)組小鼠體質(zhì)量與模型組、艾灸組相比均具有明顯差別(P<0.05),但艾灸組小鼠體質(zhì)量增長(zhǎng)速度快于模型組，與模型組相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)果見(jiàn)表1。

2.2 艾灸對(duì)PSD模型小鼠行為學(xué)測(cè)試結(jié)果的影響

2.2.1 艾灸對(duì)PSD模型小鼠Open-Field測(cè)試結(jié)果的影響 從表2可以看出，應(yīng)激前1d，假手術(shù)組、模型組和艾灸組小鼠Open-Field測(cè)試結(jié)果之間無(wú)顯著差異。應(yīng)激1w、3w時(shí)，模型組小鼠水平活動(dòng)和直立活動(dòng)得分均減少，尤其是直立活動(dòng)得分明顯減少，于應(yīng)激3w時(shí)與假手術(shù)組相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P﹤0.05)；而艾灸組無(wú)論是水平活動(dòng)得分和直立活動(dòng)得分均高于模型組小鼠，于應(yīng)激3w時(shí)，其水平活動(dòng)得分與模型組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。結(jié)果見(jiàn)表2。

表1 艾灸對(duì)PSD模型小鼠體質(zhì)量的影響比較 /g

注：*P<0.05 與假手術(shù)組相比；△P<0.05 與模型組相比。

表2 艾灸對(duì)PSD模型小鼠Open-Field測(cè)試結(jié)果的影響

注：與假手術(shù)組相比,*P<0.05;與模型組相比,△P<0.05。

2.2.2 艾灸對(duì)PSD模型小鼠蔗糖水消耗量的影響 從表3中可知，應(yīng)激前1d，各組小鼠糖水消耗百分比比較接近。自應(yīng)激開始后，假手術(shù)組小鼠糖水消耗百分比保持較高比例；而模型組糖水消耗百分比隨著刺激時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸降低，于應(yīng)激3w時(shí)與假手術(shù)組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)；艾灸組在應(yīng)激1w時(shí)對(duì)糖水的攝入量呈下降趨勢(shì)，而在治療一段時(shí)間后，攝入量緩慢上升，于應(yīng)激3w時(shí)與假手術(shù)組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 艾灸對(duì)PSD模型小鼠蔗糖水消耗百分比的影響比較 %

注：與假手術(shù)組相比,*P<0.05。

2.2.3 艾灸對(duì)PSD模型小鼠逃避潛伏期的影響 從表4中可知，第1d、2d測(cè)試，各組小鼠平均逃避潛伏期均比較接近。自第3d至第5d，假手術(shù)組小鼠平均逃避潛伏期呈下降趨勢(shì)；模型組小鼠的逃避潛伏期基本上均長(zhǎng)于假手術(shù)組小鼠，至第5d，與假手術(shù)組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)；與模型組相比，艾灸組小鼠的逃避潛伏期迅速下降，至第5d時(shí)，與模型組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P﹤0.05)。結(jié)果見(jiàn)表4。

3 討論

PSD是腦卒中常見(jiàn)的并發(fā)癥之一, 據(jù)報(bào)道，PSD總發(fā)生率在40%～50%[2]。PSD主要表現(xiàn)為興趣減退、易疲勞、思維遲緩、食欲減退、悲觀絕望, 甚至出現(xiàn)自殺企圖和行為等, 直接影響患者的生活質(zhì)量和功能康復(fù)。然而大多數(shù)研究關(guān)注成年后發(fā)生的PSD，而對(duì)于新生兒HIE后繼發(fā)的PSD研究報(bào)道較少。HIE是新生兒時(shí)期較為常見(jiàn)的疾病之一，是指各種圍生期窒息引起的部分或完全缺氧、腦血流減少或暫停而導(dǎo)致胎兒或新生兒腦損傷[9]，預(yù)后差，具有較高致死率和致殘率[10-11]。據(jù)資料統(tǒng)計(jì)，新生兒HIE發(fā)生率為2～3‰(足月產(chǎn))[12-13]，死亡率約為20%～50%[14]，幸存患者常伴有生長(zhǎng)發(fā)育遲緩、永久性神經(jīng)功能障礙以及心理障礙(如抑郁)等?？梢?jiàn)，新生兒HIE后出現(xiàn)PSD，除產(chǎn)生上述危害外，還可影響兒童的生長(zhǎng)發(fā)育。

表4 艾灸對(duì)PSD模型小鼠逃避潛伏期的影響比較 s

注：**P<0.01 與假手術(shù)組相比；△P<0.05 與模型組相比。

許多疾病的研究都得益于成功的動(dòng)物模型。目前，成年鼠PSD模型制備多采用腦卒中伴抑郁的復(fù)合模型[1]，即采用線栓法制備局灶性腦缺血?jiǎng)游锬Ｐ?，再加上CUMS制備PSD模型[15-17]，或者采用開顱去除大鼠腦皮層血管致腦缺血模型，再加上CUMS制備PSD模型[18]。但有關(guān)新生鼠HIE后出現(xiàn)PSD的研究報(bào)道很少。本文參照文獻(xiàn)[15-18]，采用新生小鼠HIE伴抑郁的復(fù)合模型，即制備新生小鼠HIE模型，再加CUMS制備PSD模型。HIE模型參照文獻(xiàn)[4-6]進(jìn)行，而抑郁模型參照文獻(xiàn)[7]進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)結(jié)果觀察到：應(yīng)激前1d、應(yīng)激1w和應(yīng)激3w PSD模型小鼠出現(xiàn)體質(zhì)量減輕，與假手術(shù)組相比均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。推測(cè)應(yīng)激前1d PSD模型組體質(zhì)量減輕可能是由于單純腦卒中導(dǎo)致飲食下降引起，而應(yīng)激1w和應(yīng)激3w體質(zhì)量的降低，則可能與腦卒中后引起的抑郁導(dǎo)致。通常情況下，敞箱試驗(yàn)的水平活動(dòng)得分反映動(dòng)物的活動(dòng)水平，垂直活動(dòng)得分反映動(dòng)物對(duì)新鮮事物的好奇程度，即興趣的高低；糖水消耗試驗(yàn)降低反映動(dòng)物快感缺乏；尋找平臺(tái)潛伏期延長(zhǎng)反映動(dòng)物空間學(xué)習(xí)記憶力下降。本研究實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：隨著應(yīng)激時(shí)間的延長(zhǎng)，PSD模型小鼠水平活動(dòng)和垂直活動(dòng)得分逐漸減少、糖水消耗量逐漸降低、尋找平臺(tái)潛伏期延長(zhǎng)；至應(yīng)激3w時(shí)，模型組小鼠的直立活動(dòng)得分明顯減少(P<0.05)、糖水消耗量降低(P<0.05)、空間學(xué)習(xí)記憶力下降(P<0.05)，與假手術(shù)組相比均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。由此認(rèn)為，在HIE造模的基礎(chǔ)上給予CUMS，動(dòng)物出現(xiàn)生長(zhǎng)緩慢，自發(fā)活動(dòng)和探究活動(dòng)減少、快感缺失、空間學(xué)習(xí)記憶力降低，提示小鼠PSD模型制備成功。

研究報(bào)道，艾灸療法治療成年鼠PSD具有較好的療效[3]。本課題組前期研究也觀察到，艾灸具有改善大鼠抑郁癥的效果[19-20]。那么，艾灸對(duì)HIE后出現(xiàn)的PSD是否具有改善作用呢？本研究觀察了艾灸“百會(huì)”穴35min對(duì)PSD模型小鼠的防治效果。結(jié)果顯示：給予艾灸治療后，艾灸組小鼠體質(zhì)量有所增加，于應(yīng)激3w時(shí)與模型組相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。此外，隨著應(yīng)激時(shí)間的延長(zhǎng)，艾灸小鼠水平活動(dòng)和垂直活動(dòng)得分逐漸增多、糖水消耗量逐漸增加、尋找平臺(tái)潛伏期縮短；至應(yīng)激3w時(shí)，模型組小鼠的水平活動(dòng)得分明顯增多(P<0.05)、糖水消耗量增加、空間學(xué)習(xí)記憶力提高(P<0.05)。表明艾灸對(duì)HIE導(dǎo)致的PSD同樣具有改善作用。

綜上所述，我們認(rèn)為新生小鼠在HIE造模的基礎(chǔ)上給予CUMS可成功制備PSD模型。而艾灸可能通過(guò)艾灸穴位，調(diào)動(dòng)機(jī)體內(nèi)源性的抗病機(jī)制，達(dá)到改善PSD的效果。然而關(guān)于艾灸防治PSD的具體作用機(jī)制還有待于將來(lái)進(jìn)一步的研究。

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