馮曉東，史景，灣明月，劉承梅

河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院康復(fù)中心，河南鄭州市450000

認(rèn)知障礙在腦卒中患者中發(fā)病率達(dá)56.6%[1]，嚴(yán)重影響腦卒中患者的整體功能恢復(fù)和身心健康[2]。針刺百會(huì)、神庭穴可以改善腦卒中患者的學(xué)習(xí)記憶能力[3]，其具體作用機(jī)制并未完全闡明。

自噬(autophagy)是真核細(xì)胞通過代謝和分解其自身蛋白質(zhì)或衰老細(xì)胞器，并進(jìn)一步消化和再利用的生物過程[4]。在缺血缺氧等應(yīng)激狀態(tài)下，神經(jīng)細(xì)胞死亡率高，自噬激活明顯提高細(xì)胞存活率，認(rèn)為應(yīng)激狀態(tài)下自噬對(duì)神經(jīng)細(xì)胞產(chǎn)生保護(hù)作用[5-7]。Beclin-1作為自噬標(biāo)記物，是衡量自噬發(fā)生程度的方法之一[8]。本研究制備大腦中動(dòng)脈閉塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)腦缺血再灌注大鼠模型，觀察電針神庭、百會(huì)穴對(duì)MCAO大鼠學(xué)習(xí)記憶能力、腦梗死體積以及Beclin-1表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康雄性清潔級(jí)Sprague-Dawley大鼠45只，體質(zhì)量(260±20)g，由鄭州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào)41003100004006。飼養(yǎng)在河南省中醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室的獨(dú)立通風(fēng)籠具中，每籠5只，予自由飲食、飲水，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。實(shí)驗(yàn)過程嚴(yán)格按照國際動(dòng)物保護(hù)和使用指南的規(guī)定進(jìn)行。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑和儀器

水合氯醛(30037516)：鎮(zhèn)江德為化學(xué)品有限公司。2%2,3,5-氯化三苯基四氮唑(2,3,5-triphenyltetrazolium chloride,TTC)染色液(G3005-100)、BCA蛋白濃度測定試劑盒(PC0020-500)、10×麗春紅染液(P0012-10)：北京索萊寶科技有限公司。FITC山羊抗兔IgG(h+1,SA00003-2)：武漢三鷹生物技術(shù)有限公司。GAPDH抗體(GTX100118-S)、Beclin-1抗體(GTX55535)：美國GENETEX公司。

Morris水迷宮(XR-XM101)：上海欣軟信息科技有限公司。G6805電針儀：上海華誼醫(yī)用儀器有限公司。華佗牌30號(hào)0.5寸毫針：蘇州醫(yī)療用品廠。

1.3 分組和造模

大鼠以隨機(jī)數(shù)字表法分成假手術(shù)組、模型組、電針組，各15只。術(shù)前動(dòng)物禁食24 h。稱重后，腹腔注射10%水合氯醛3 ml/kg麻醉，參造Longa法[9]建立左側(cè)MCAO模型。分離并暴露左頸總動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈和頸內(nèi)動(dòng)脈，依次結(jié)扎頸總動(dòng)脈近心端、頸外動(dòng)脈遠(yuǎn)心端，并于頸總動(dòng)脈分叉處近心端預(yù)留結(jié)扎線。微動(dòng)脈夾夾閉遠(yuǎn)端頸內(nèi)動(dòng)脈，距頸總動(dòng)脈分叉處1 mm處用顯微剪刀剪一切口，將已備好的線栓插入頸內(nèi)動(dòng)脈，插入長度約18～22 mm，至大腦前動(dòng)脈近端，完全阻斷大腦中動(dòng)脈血供。縛緊預(yù)先放置于頸總動(dòng)脈的結(jié)扎線。常規(guī)縫合消毒，4-0縫合線縫合傷口?？p合時(shí)皮膚外留線栓1 cm。2 h后，輕柔回抽線栓至頸總動(dòng)脈分叉處。

術(shù)中保持室溫25℃左右，白熾燈照射動(dòng)物以保持肛溫[9]。實(shí)驗(yàn)過程中密切觀察大鼠變化，注意動(dòng)物保溫。

假手術(shù)組只分離血管，不結(jié)扎和插入栓線。

動(dòng)物完全蘇醒后，Longa法行神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分。0分，無神經(jīng)缺失的癥狀；1分，不能完全伸展對(duì)側(cè)前爪；2分，向外(右)側(cè)轉(zhuǎn)圈；3分，向?qū)?cè)傾倒；4分，神經(jīng)缺失嚴(yán)重，意識(shí)喪失，不能自發(fā)行走[9]。0分、4分大鼠予以排除。合格大鼠放回籠中正常飼養(yǎng)。

1.4 方法

術(shù)后2 h，電針組參考《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》取大鼠神庭和百會(huì)穴，用華佗牌30號(hào)0.5寸毫針，神庭穴向上斜刺，深2 mm；百會(huì)穴向前斜刺，深2 mm。接G6805-2A電針儀，電壓峰值6 V，以鼠耳輕輕抖動(dòng)為度，疏密波，頻率1～20 Hz。每次30 min，每天1次，共7 d[10]。假手術(shù)組和模型組造模后回籠飼養(yǎng)，予同等條件抓取。

1.5 觀察指標(biāo)

1.5.1 神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分

術(shù)后每天同一時(shí)間采用Longa評(píng)分進(jìn)行評(píng)定，記錄術(shù)后1 d、3 d、5 d、7 d的評(píng)分進(jìn)行比較。

1.5.2 Morris水迷宮檢測

術(shù)后4 d起連續(xù)訓(xùn)練4 d。水迷宮直徑160 cm，深55 cm，水深30 cm，水溫22～26℃；池壁上4個(gè)等距離點(diǎn)分水池為4個(gè)象限，任選一象限中央放置平臺(tái)，平臺(tái)直徑12 cm，高28 cm，沒于水面下2 cm。池壁外標(biāo)4個(gè)入水點(diǎn)，水池周圍參照物保持不變。

1.5.2.1 定位航行實(shí)驗(yàn)

連續(xù)訓(xùn)練4 d，每天訓(xùn)練4次，分別從4個(gè)象限入水點(diǎn)將大鼠放入水中。如果大鼠在90 s內(nèi)爬上平臺(tái)，并停留3 s以上，則認(rèn)為大鼠找到平臺(tái)，此為逃避潛伏期。如果90 s內(nèi)大鼠未能找到平臺(tái)，則拖拽其尾部，將其引導(dǎo)到平臺(tái)，熟悉10 s，潛伏期計(jì)為90 s。每次訓(xùn)練間隔5 min。取4個(gè)方向潛伏期的平均數(shù)作為該日成績。

1.5.2.2 空間探索實(shí)驗(yàn)

測試第5天上午，撤去平臺(tái)，取任意入水點(diǎn)將大鼠放入水中，觀察并記錄90 s內(nèi)大鼠穿過原平臺(tái)區(qū)域的次數(shù)[10]。

1.5.3 TTC染色

治療7 d結(jié)束后，各組取5只動(dòng)物斷頭處死，生理鹽水灌注，取腦，腦組織迅速置于-20℃冰箱冷凍20 min，至腦組織變硬。從大腦半球額極到枕極做連續(xù)冠狀位切片，厚約2 mm，共6片。腦片放入2%TTC溶液中，37℃恒溫箱15～30 min，并不時(shí)翻動(dòng)腦片，使腦片均勻接觸染色液。整個(gè)過程注意避光。Image-Pro Plus 6.0軟件測量腦梗死面積和大腦面積，計(jì)算腦梗死體積百分比

1.5.4 Western blotting

治療7 d結(jié)束后，各組取5只動(dòng)物斷頭處死取腦。取大鼠大腦海馬組織，置液氮罐中速凍，再置-80℃冰箱保存。取大鼠腦組織200 mg，加裂解緩沖液2 ml，15,000 r/min 4℃離心15 min后取上清。BCA法測蛋白濃度，用凝膠加樣緩沖液將各管蛋白濃度調(diào)為一致。取樣品20 ml煮沸5 min，120 V、50 mA電泳1.5 h；將凝膠取出，80 V、100 mA轉(zhuǎn)印2 h至PVDF膜。取出，麗春紅預(yù)染，證實(shí)蛋白質(zhì)確實(shí)轉(zhuǎn)移到膜上。5%脫脂奶粉封閉2 h，TBS洗2次，每次5 min。分別加入兔Beclin-1單克隆抗體和內(nèi)參抗體GAPDH孵育(均1∶4000)，4℃過夜。TBST洗2次，每次5 min。加入堿性磷酸酶標(biāo)記山羊抗兔IgG(1∶3000)，室溫2 min。TBST洗2次，每次5 min。將濾膜放入配好的顯色液，ECL法發(fā)光，于化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)中成像，Image Lab軟件檢測條帶灰度值，取Beclin-1與GAPDH相對(duì)灰度進(jìn)行半定量分析。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。計(jì)量資料以(xˉ±s)表示。Longa評(píng)分不符合正態(tài)分布，在模型組與電針組間進(jìn)行秩和檢驗(yàn)。其他多組計(jì)量資料符合正態(tài)分布，進(jìn)行單因素方差分析(One-way ANOVA)，兩兩比較，若方差齊者用LSD法，方差不齊則用Games-Howell法。顯著性水平α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分

造模大鼠30只全部成功。造模后1 d模型組死亡1只。與模型組比較，電針組Longa評(píng)分術(shù)后1 d無顯著性差異，3 d、5 d、7 d低于模型組(P＜0.05)。見表1。

表1 各組Longa評(píng)分比較

2.2 Morris水迷宮檢測

定向航行實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，隨著時(shí)間推移，各組逃避潛伏期逐漸縮短，電針組少于模型組(P＜0.05)?？臻g探索實(shí)驗(yàn)，電針組穿越平臺(tái)次數(shù)多于模型組(P＜0.05)。見表2、表3。

表2 各組逃避潛伏期比較(s)

表3 各組穿越平臺(tái)次數(shù)比較

2.3 腦梗死體積

與模型組比較，電針組腦梗死體積占全腦百分比(6.59±0.94)%，顯著小于模型組(28.04±4.89)%(F=7.651,P＜0.001)。

2.4 Western blotting

與假手術(shù)組比較，模型組Beclin-1表達(dá)增加(P＜0.05)，電針組Beclin-1表達(dá)比模型組增加(P＜0.05)。見表4。

表4 各組Beclin-1表達(dá)(%)

3 討論

本研究顯示，電針可改善MCAO大鼠學(xué)習(xí)記憶能力，改善腦缺血再灌注后病理損傷，同時(shí)伴有Beclin-1表達(dá)升高。

Beclin-1位于17q21，有12個(gè)外顯子，編碼蛋白相對(duì)分子質(zhì)量60,000，由450個(gè)氨基酸序列構(gòu)成[11]。Beclin-1也稱BECN1，是酵母ATG6的同系物，是自噬體形成過程中必需分子，在自噬過程中Beclin-1的表達(dá)上升[12-13]。作為自噬的直接執(zhí)行者，Beclin-1蛋白除了接受自噬信號(hào)，還可接受其他信號(hào)，對(duì)自噬進(jìn)行調(diào)節(jié)。Beclin-1已經(jīng)成為衡量自噬發(fā)生程度的檢測方法之一[14]。

自噬是細(xì)胞受刺激后，通過溶酶體途徑降解細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)的統(tǒng)稱，是細(xì)胞自我消化的過程。自噬也是近年來逐漸被認(rèn)識(shí)的細(xì)胞除壞死和凋亡外第3種死亡方式[15-16]。作為一種程序化的細(xì)胞內(nèi)降解機(jī)制，自噬的生理和病理作用非常廣泛，涉及癌癥、神經(jīng)退行性病變、代謝性疾病、衰老以及免疫系統(tǒng)疾病[17-19]。Beclin-1能介導(dǎo)自噬蛋白定位于吞噬泡，調(diào)控哺乳動(dòng)物自噬體的形成與成熟[20]。在生理?xiàng)l件下，自噬處于低水平，主要清除細(xì)胞內(nèi)被降解的蛋白；在缺血再灌注等因素刺激下，細(xì)胞啟動(dòng)自噬機(jī)制清除損傷線粒體，同時(shí)提高細(xì)胞對(duì)低氧的耐受力，對(duì)細(xì)胞起一定保護(hù)作用[21]。腦缺血后，大量活性氧、自由基釋放引起氧化應(yīng)激，上調(diào)微管相關(guān)蛋白1輕鏈3、Beclin-1表達(dá)，從而誘導(dǎo)細(xì)胞自噬[22]。較早的研究顯示，腦缺血缺氧后，自噬可降解損傷的細(xì)胞器以避免凋亡，繼而產(chǎn)生能量以避免離子失衡和細(xì)胞壞死[8]。但之后的一些研究表明，自噬在缺血性腦損傷過程中會(huì)產(chǎn)生復(fù)雜的影響，甚至產(chǎn)生負(fù)面作用，即自噬在缺血性腦損傷中有可能發(fā)揮雙刃劍作用[23]。在輕度饑餓、缺氧等情況下，自噬不僅通過降解蛋白提供能量，且通過降解損傷蛋白合成新的蛋白，從而保護(hù)機(jī)體細(xì)胞[24]。若重度饑餓、缺氧，或延長細(xì)胞損傷時(shí)間，激活凋亡相關(guān)調(diào)控蛋白產(chǎn)生凋亡后，自噬也過度激活；過度激活的自噬又進(jìn)一步促進(jìn)凋亡發(fā)生，從而對(duì)機(jī)體產(chǎn)生損傷作用[25]。

中醫(yī)認(rèn)為，督脈是人體諸陽之匯，有“總督諸陽”和“陽脈之海”之說。“病變?cè)谀X，首取督脈”，為治療腦部疾病首選。神庭、百會(huì)是督脈穴位，與腦密切聯(lián)系，是調(diào)節(jié)大腦功能的要穴。電針神庭、百會(huì)改善腦卒中后認(rèn)知功能的作用在前期臨床及基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)中均已證實(shí)[3,10,26]。在研究顯示，電針上調(diào)Beclin-1表達(dá)，從而誘發(fā)自噬，伴隨認(rèn)知功能和病理損傷的改善，提示Beclin-1得到適度表達(dá)，起到神經(jīng)保護(hù)作用。

綜上所述，電針神庭、百會(huì)穴可治療MACO大鼠學(xué)習(xí)記憶障礙，這種治療作用可能與上調(diào)自噬相關(guān)基因Beclin-1從而啟動(dòng)自噬系統(tǒng)網(wǎng)絡(luò)有關(guān)。要精確調(diào)控自噬，為臨床治療提供新的治療靶點(diǎn)，需要更清楚地了解自噬調(diào)控通路的每一個(gè)環(huán)節(jié)。這仍有待進(jìn)一步深入。本研究只檢測了與自噬相關(guān)的一種基因，存在一定局限性，有待今后研究繼續(xù)改善。

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