黃蕊，楊翠翠，李林，張?zhí)m

首都醫(yī)科大學宣武醫(yī)院藥物研究室，北京市神經(jīng)藥物工程研究中心，神經(jīng)變性病教育部重點實驗室，北京市100053

阿爾茨海默病(Alzheimer's disease,AD)是一種以認知功能障礙為主要臨床表現(xiàn)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，現(xiàn)已成為嚴重威脅老年人健康的四大疾病之一。其主要特征是β淀粉樣蛋白(beta amyloid,Aβ)沉積和神經(jīng)元纖維纏結(neurofibrillary tangles,NFTs)[1]。目前AD的發(fā)病機制尚未完全明確，包括氧化、壓力和炎癥等多個致病因素[2-3]，但越來越多的證據(jù)表明，神經(jīng)炎癥是AD發(fā)病的一個重要因素。在AD發(fā)病過程中，炎癥反應是神經(jīng)元丟失的重要原因之一[4-6]。由于過量Aβ聚集和纖維化，小膠質細胞和星形膠質細胞被激活，炎癥因子大量釋放，誘發(fā)過度炎癥反應，導致突觸和神經(jīng)元大量損傷和丟失[7]。

二苯乙烯苷(2,3,5,4'-tetrahydroxy-stilbene-2-O-β-D-glycoside,TSG)是中藥何首烏的主要有效成分和標志成分，具有抗衰老、神經(jīng)保護、降血脂以及抗動脈硬化等作用[8]。多奈哌齊是第二代高選擇性乙酰膽堿酯酶抑制劑，主要用于治療輕度和中度AD。課題組前期研究顯示，TSG能夠改善不同月齡APP轉基因小鼠的學習記憶障礙[9]，并能改善β淀粉樣肽致癡呆模型小鼠的學習記憶，增強膽堿能神經(jīng)功能[10]。本實驗用APPswe/PS1dE9雙轉基因小鼠為動物模型，以多奈哌齊作為陽性對照藥，探討TSG對Aβ沉積以及膠質細胞過度活化的影響，從而進一步證實TSG對AD的潛在治療作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF級APP/PS1雙轉基因陽性小鼠64只及野生型(wild type,WT)小鼠32只，體質量30～35 g，購自南京大學模式動物所，許可證號SCXK(蘇)2015-0001。小鼠分籠飼養(yǎng)于首都醫(yī)科大學宣武醫(yī)院實驗動物室屏障環(huán)境，12 h光照，自由進食和進水，室溫20～25℃，濕度50%～70%。

1.2 主要藥品、試劑及儀器

TSG：本實驗室從何首烏中提取，純度85%，實驗中采用干粉劑，溶解于蒸餾水，制成藥液。多奈哌齊(國藥準字H20050978，批號1502016)：衛(wèi)材(中國)藥業(yè)有限公司。剛果紅染液(貨號MST-8013)：上海邁新生物技術有限公司。膠質纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)(貨號ZA-0529)、一抗山羊血清(貨號ZLI-9021)、一抗稀釋液(貨號ZLI-9030)、生物素標記的山羊抗兔IgG(貨號ZB-2010)、辣根酶標記鏈酶卵白素(貨號ZB-2404)、DAB顯色試劑盒(貨號ZLI-9018)：北京中杉金橋生物技術有限公司。Aβ一抗(貨號2454)：美國CELL SIGNALINGTECHNOLOGY公司。離子鈣結合蛋白1(ionized calcium binding adapter molecule 1,Iba1)一抗(貨號 019-19741)：日本W(wǎng)AKO公司。

BH-2光學顯微鏡：日本OLYMPUS公司。BS210S電子天平：北京賽多利斯天平有限公司。A78910100冰凍切片機：美國THERMO公司。新物體識別設備：本室自制。

1.3 動物分組及給藥

64只5月齡APP/PS1小鼠，按隨機數(shù)字表分為4組，每組16只。每天模型組予蒸餾水10 ml/kg灌胃；TSG低劑量組予TSG 0.05 g/kg灌胃；TSG高劑量組予TSG 0.1 g/kg灌胃；多奈哌齊組予多奈哌齊0.001 g/kg灌胃。

32只5月齡WT小鼠，按隨機數(shù)字表分為兩組，每組16只。每天正常對照組予蒸餾水10 ml/kg灌胃；TSG高劑量WT組予TSG 0.1 g/kg灌胃。

各組給藥時長均為7個月，至小鼠12月齡。

1.4 新物體識別實驗

給藥結束后，各組行新物體識別實驗。實驗第1天，將小鼠放于475×350×200 mm塑料空盒中自由探索10 min。第2天，在盒子里放置兩個相同物體，秒表記錄小鼠10 min內對這兩個物體的探索時間，小鼠鼻子靠近物體1 cm距離內視為對物體進行探索。第3天，將其中一個物體換成新物體，秒表記錄小鼠在10 min內對新舊物體的探索時間。計算識別指數(shù)(discrimination index,DI)。

1.5 取材及檢測

新物體識別實驗后，小鼠以10%水合氯醛4 ml/kg腹腔注射麻醉，開胸，剪開心包膜，暴露心臟和主動脈弓。用7號鈍頭針頭插入左心室至主動脈弓，剪開右心耳，灌注0.9%氯化鈉注射液100 ml，待右心耳流出液無色透明時，用4%多聚甲醛(pH=7.4)100 ml灌注固定至小鼠四肢僵直。灌注2 h后開顱取腦，固定于后固定液中；1周后冰凍切片，冠狀位，片厚30 μm，連續(xù)切片。腦片置PBST緩沖液中，4℃儲存。

1.5.1 剛果紅染色

每組3只，每只取3張皮質及海馬腦組織切片，撈至載玻片上，晾干，滴加飽和剛果紅染液染色10 min，滴加分化液約20 s，鏡下控制，水洗5 min；蘇木精淺染約10 s。梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。應用Image J軟件計數(shù)，以模型組斑塊數(shù)為1進行標準化(各組數(shù)據(jù)/模型組均值)。

1.5.2 免疫組化染色

每組3只，每只取3張腦片，撈至載玻片上，晾干。枸櫞酸緩沖液沸水煮10 min，PBS沖洗3次，每次5 min，3%H2O2室溫孵育10 min；PBS沖洗3次，每次5 min，10%山羊血清(PBST稀釋)室溫孵育30 min。棄去血清，滴加一抗及稀釋液，Aβ稀釋度為1∶200，Iba1稀釋度為1∶500，GFAP稀釋度為1∶200，4℃過夜。次日37℃復溫30 min，PBS沖洗3次，每次5 min，滴加生物素標記山羊抗兔IgG(PBST稀釋，1∶100)，37℃孵育2 h；PBS沖洗3次，每次5 min；滴加辣根過氧化物酶標記的鏈酶卵白素(PBST稀釋，1∶100)，37℃孵育1 h，PBS沖洗3次，每次5 min；DAB顯色液顯色，鏡下控制，并用自來水終止顯色。梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。Aβ、Iba1和GFAP染色陽性面積用Image-pro Plus 6.0軟件進行統(tǒng)計，以模型組面積為1，進行標準化(各組數(shù)據(jù)/模型組均值)。

1.6 統(tǒng)計學分析

數(shù)據(jù)采用SPSS 20.0軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料用(xˉ±σXˉ)表示，多組間樣本比較應用單因素方差分析(One-way ANOVA)。顯著性水平α=0.05。

2 結果

2.1 新物體識別實驗

與正常對照組相比，模型組DI降低(P＜0.05)；與模型組相比，各治療組DI均明顯升高(P＜0.01)。見表1。

表1 各組新物體識別實驗DI比較

2.2 剛果紅染色

與正常對照組相比，模型組皮層及海馬均散在分布大量磚紅色斑塊(P＜0.001)，與AD疾病細胞外斑塊沉積病理改變一致。與模型組相比，各治療組腦內斑塊沉積均有不同程度減少(P＜0.05)。見圖1～圖4。

2.3 Aβ40/42

與正常對照組相比，模型組皮層及海馬出現(xiàn)大量褐色團塊狀Aβ40/42沉積(P＜0.001)。與模型組相比，各治療組小鼠皮層及海馬Aβ40/42沉積均有不同程度減少(P＜0.05)。見圖5～圖8。

2.4 Iba-1和GFAP

正常對照組與TSG高劑量WT組海馬小膠質細胞和星形膠質細胞形態(tài)正常且分布均勻，模型組海馬染色呈現(xiàn)團塊狀分布(活化的小膠質細胞和星形膠質細胞)，Iba-1和GFAP陽性面積顯著增加(P＜0.001)。與模型組相比，各治療組海馬部位Iba-1和GFAP陽性面積均有所減少(P＜0.05)。見圖9～圖12。

圖1 各組皮層淀粉樣斑塊沉積情況比較

圖2 各組海馬淀粉樣斑塊沉積情況比較

圖3 各組皮層淀粉樣斑塊沉積(剛果紅染色,20×)

圖4 各組海馬淀粉樣斑塊沉積(剛果紅染色,20×)

圖5 各組皮層Aβ40/42沉積情況比較

圖6 各組海馬Aβ40/42沉積情況比較

圖7 各組皮層Aβ40/42沉積(免疫組化染色,20×)

圖8 各組海馬Aβ40/42沉積(免疫組化染色,20×)

圖9 各組海馬Iba-1表達情況比較

圖10 各組海馬GFAP表達情況比較

圖11 各組海馬Iba-1表達(免疫組化染色,40×)

圖12 各組海馬GFAP表達(免疫組化染色,40×)

3 討論

AD的病理生理機制非常復雜，AD腦內病變是一個慢性炎癥的觀點已被普遍接受。AD腦內慢性炎癥反應涉及大量細胞和分子，包括與Aβ沉積和老年斑形成有關的小膠質細胞激活、反應性星形膠質細胞增生，以及炎性細胞因子的表達增加，同時激活細胞內信號轉導途徑[11-13]。小膠質細胞和星形膠質細胞是膠質細胞的主要類型，反應性膠質細胞與AD中斑塊密切相關[14]。

剛果紅染色能顯示腦內淀粉樣斑塊沉積，是診斷淀粉樣變性最簡便易行的方法[15]，也常應用于淀粉樣蛋白示蹤劑研究[16-17]。本研究顯示，12月齡APP/PS1小鼠腦內已經(jīng)出現(xiàn)大量老年斑；給予TSG后，老年斑數(shù)量有所減少；Aβ40/42也顯示同樣趨勢。這印證了Aβ40/42是老年斑的主要成分[18]。Aβ經(jīng)淀粉樣前體蛋白水解產(chǎn)生，并可以被胰島素降解酶、中性內肽酶等水解酶水解清除[19-20]。

在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，小膠質細胞約占成年腦細胞的5%～10%[21]。正常生理狀態(tài)下，小膠質細胞處于抑制免疫應答反應的狀態(tài)；Aβ可作為始動因素激活小膠質細胞產(chǎn)生炎癥反應，過度增殖和活化的小膠質細胞合成和釋放大量炎癥因子和過氧化物，加重炎癥反應強度，最終導致細胞死亡[22-23]。

Iba1是小膠質細胞特異性表達，約17 kDa的鈣結合蛋白，在活化的小膠質細胞中表達升高。本研究中12月齡模型小鼠腦內Iba1標記的小膠質細胞過度活化呈團塊狀，與文獻中描述一致[24]，而治療組腦內小膠質細胞活化程度明顯降低。

星形膠質細胞參與神經(jīng)保護和神經(jīng)組織損傷后修復過程，約占神經(jīng)系統(tǒng)細胞總數(shù)35%[25]。與小膠質細胞一樣，星形膠質細胞暴露于Aβ后釋放炎癥因子，加劇神經(jīng)炎癥反應。GFAP是星形膠質細胞的主要成分，可標記正常和活化的星形膠質細胞。本研究中12月齡模型小鼠腦內星形膠質細胞過度活化，治療組星形膠質細胞活化程度明顯降低。TSG對小膠質細胞和星形膠質細胞過度活化的抑制，說明TSG的顯著抗炎作用。

綜上所述，目前認為Aβ引起的神經(jīng)炎性損傷是AD的重要發(fā)病機制之一，小膠質細胞和星形膠質細胞作為主要的免疫細胞參與炎癥反應過程。通過7個月給予TSG，12月齡AD模型小鼠學習記憶能力改善，腦內老年斑以及組成老年斑的主要成分Aβ40/42減少，同時小膠質細胞和星形膠質細胞活化被抑制，推測TSG可能通過抑制APP/PS1雙轉基因小鼠腦內Aβ的形成，減少斑塊沉積，進而抑制小膠質細胞活化和反應性星形膠質細胞增生，降低炎癥反應，同時改善學習記憶。

本文通過免疫組化染色，直觀呈現(xiàn)各組小鼠腦內Aβ40/42沉積、小膠質細胞以及星形膠質細胞的形態(tài)，將為進一步研究TSG的抗炎作用機制提供有意義的實驗依據(jù)。TSG對于Aβ的減低是通過降低Aβ的生成還是增加Aβ的清除，TSG是否通過降低炎癥因子發(fā)揮其抗炎作用，以上機制目前尚不明確，還需進一步深入研究。

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