趙曉寧，王煥香，羅飛，商華，李磊，朱光華，尹甜，傅曉方，邢姍姍，邊可欣，高大威*

（1. 燕山大學(xué)環(huán)境與化學(xué)工程學(xué)院，河北秦皇島 066000；2. 中國長城葡萄酒有限公司，河北懷來 075499）

葡萄酒是以葡萄為原料經(jīng)微生物發(fā)酵的產(chǎn)物，葡萄酒釀造已經(jīng)有五、六千年的歷史，早在人們認(rèn)識微生物之前，已經(jīng)不自覺的利用微生物進(jìn)行葡萄酒的釀造[1]。隨著顯微鏡的發(fā)明及應(yīng)用，人們對微生物的認(rèn)識越來越深刻。1968年Amerine等[2]發(fā)現(xiàn)成熟的葡萄漿果表面存在許多不同屬的酵母菌，這些酵母菌都有一定的發(fā)酵能力。隨后的葡萄酒研究領(lǐng)域中，酵母菌成為研究熱點(diǎn)之一。酵母品種種類及性能直接決定所釀果酒品質(zhì)的優(yōu)劣[3-4]，因此揭示釀酒葡萄中酵母菌的組成對提高葡萄酒的質(zhì)量及進(jìn)一步弄清酵母菌對葡萄酒品質(zhì)的影響有重要意義。

葡萄酒的釀造過程是利用酵母菌將葡萄內(nèi)的大部分糖轉(zhuǎn)化為酒精和CO2，同時(shí)生成甘油、高級醇、酯類、醛類等代謝產(chǎn)物，直接影響葡萄酒的色澤、香氣及口感，也決定了葡萄酒的質(zhì)量和風(fēng)格。葡萄品種和質(zhì)量一旦確定，要獲得能夠充分反映葡萄品種特色和優(yōu)良品質(zhì)的葡萄酒所選酵母至關(guān)重要，可以說酵母菌是葡萄酒品質(zhì)的靈魂[5-6]。由于受環(huán)境因素的影響，某些酵母菌屬、種在形態(tài)學(xué)及生理生化特性方面的差異極不顯著，采用傳統(tǒng)方法對它們進(jìn)行分類相當(dāng)困難，而通過分子手段對酵母菌進(jìn)行鑒定的準(zhǔn)確性很高[7-9]。本研究對河北昌黎和沙城兩地所產(chǎn)的釀酒葡萄中的酵母菌株進(jìn)行分離，根據(jù)其在WL培養(yǎng)基上的菌落顏色及形態(tài)進(jìn)行初步分類，并進(jìn)行生理生化鑒定，最后運(yùn)用RAPD聚類分析對這些菌株進(jìn)行分類以探討河北地區(qū)葡萄酒相關(guān)酵母菌的種類多樣性，為該地釀酒酵母的應(yīng)用提供基礎(chǔ)資料。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 原料

本研究于2010年9～10月從河北昌黎和沙城兩地的主要釀酒葡萄產(chǎn)區(qū)采集不同品種成熟的葡萄果粒，葡萄品種包括‘赤霞珠’‘玫瑰香’‘龍眼’‘霞多麗’‘蛇龍珠’作為菌株分離源，從葡萄表面分離純化共得到73株酵母菌，隨機(jī)抽取出其中的30株進(jìn)行后續(xù)研究。

1.1.2 主要試劑和儀器

dNTP mix（10 mmol/L，北京艾德萊生物科技有限公司）；隨機(jī)引物（20 μmol/L，北京恒博和泰生物科技有限公司）；MgCl2（25 mmol/L）、Taq酶（5 U/μL）、10×Reaction Buffer購于上海Promega公司；溫度梯度PCR儀購于德國Whatman Biometra公司，穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀購于北京六一儀器廠；凝膠成像系統(tǒng)購于美國Gene Company Limited公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

（1）YPD 固體培養(yǎng)基。葡萄糖20 g，酵母膏 10 g，蛋白胨 20 g，瓊脂 20 g，溶于1 L蒸餾水中，115 ℃滅菌30 min。

（2）酵母菌保藏培養(yǎng)基。YPD液體培養(yǎng)基，分離出的菌種保藏在YPD液體培養(yǎng)中，于-80 ℃凍存。

（3）WL營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基。酵母浸粉4.0 g，蛋白胨5.0 g，葡萄糖50.0 g，瓊脂20.0 g，磷酸二氫鉀0.55 g，氯化鉀0.425 g，氯化鈣0.125 g，硫酸鎂0.125 g，氯化鐵0.0025 g，硫酸錳0.0025 g，溴甲酚綠0.022 g，溶于1 L蒸餾水中，115 ℃滅菌30 min。pH6.5。

1.2 葡萄果粒表皮酵母菌多樣性分析方法

1.2.1 生理生化鑒定

本研究參照《酵母菌的特征與分類鑒定手冊》，部分鑒定方法略有改進(jìn)。

（1）發(fā)酵糖類試驗(yàn)。鑒定所用發(fā)酵糖類包括葡萄糖、D-果糖、麥芽糖、乳糖和蔗糖。將上述糖分別加入到含有杜氏發(fā)酵管的生理生化培養(yǎng)基中，使之含量達(dá)到50 mmol/L，經(jīng)過濾除菌。將活化后的酵母菌分別接入到上述培養(yǎng)基中，培養(yǎng)一周后觀察，以杜氏小管中有氣泡計(jì)為陽性，無氣泡為陰性，同時(shí)記錄發(fā)酵液表面菌醭生成情況。

（2）硝酸鹽還原試驗(yàn)。將生長旺盛的酵母菌菌株接種在硝酸鹽培養(yǎng)基中，25 ℃下培養(yǎng)7 d，將甲、乙兩混合液按1∶1混合（甲液：對氨基苯磺酸0.8 g＋5 mol/L醋酸l00 mL；乙液：α-奈胺0.5 g＋5 mol/L醋酸l00 mL），每5 mL培養(yǎng)液加入混合液0.1 mL后，觀察結(jié)果呈現(xiàn)紅色為陽性，若無紅色出現(xiàn)，應(yīng)進(jìn)一步檢查。向上述試管中加少許鋅粉，若出現(xiàn)紅色，表示硝酸鹽仍存在，為陰性反應(yīng)；若不產(chǎn)生紅色，表示硝酸鹽已被還原為氨和氮，仍為陽性反應(yīng)。

（3）生成類淀粉化合物試驗(yàn)。將培養(yǎng)基倒平板，接種已活化好的酵母，于28 ℃培養(yǎng)1～2周后，在平板長菌處周圍滴加盧格氏碘液，觀察酵母菌落周圍是否呈現(xiàn)藍(lán)色。

（4）同化肌醇試驗(yàn)。采用固體培養(yǎng)法，將酵母菌接種到含有肌醇的碳源同化基礎(chǔ)培養(yǎng)基上，置于28 ℃溫度下培養(yǎng)7 d，每天觀察一次生長情況。

（5）尿素分解試驗(yàn)。將供試酵母菌接種于尿素酶試驗(yàn)基礎(chǔ)培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)5 d，其間每天觀察一次，出現(xiàn)深紅色者為陽性反應(yīng)。

表1 WL培養(yǎng)基上酵母菌形態(tài)特征Table 1 Yeasts morphology characteristics in WL medium

（6）放線菌酮素抗性試驗(yàn)。在12 mm口徑試管中每管加入3.6 mL蒸餾水，115 ℃滅菌30 min，加入0.4 mL放線菌素酮母液。接種、培養(yǎng)、結(jié)果記錄和判定方法皆與肌醇同化試驗(yàn)相同。

1.2.2 形態(tài)學(xué)鑒定

稱取葡萄果皮1.0 g，加入50 mL滅菌的液體YPD培養(yǎng)基（加30 mg/L亞硫酸鈉）中，25 ℃搖床培養(yǎng)48 h。將富集液用生理鹽水進(jìn)行不同梯度稀釋后涂布平板，25 ℃培養(yǎng)48 h，轉(zhuǎn)接并經(jīng)多次劃線純化，獲得純化菌株。取分離得到的酵母菌株劃線接種于WL培養(yǎng)基[10]，28 ℃培養(yǎng)5 d，觀察菌落的顏色，形態(tài)，表面是否光滑，邊緣是否整齊等特征。同時(shí)，在顯微鏡下觀察酵母的細(xì)胞形態(tài)以此對分離到的酵母菌株進(jìn)行初步的形態(tài)分類。

1.2.3 酵母菌RAPD聚類分析

RAPD反應(yīng)選用隨機(jī)引物5'-AGGGAACGAG-3'進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)體系的總體積為25 μL，包括1 μL基因組DNA，2.5 μL 10×PCR緩沖液，2 μL 25 mmol/L MgCl2，0.5 μL 10 mmol/L dNTPs，0.5 μL 5 U Taq DNA聚合酶，2 μL 20 μmol/L隨機(jī)引物和16.5 μL ddH2O。每個(gè)反應(yīng)為35個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包括94 ℃ 30 s，36 ℃ 30 s，72 ℃1 min。循環(huán)前在94 ℃預(yù)變性3 min，循環(huán)結(jié)束后在72 ℃延伸10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在1%瓊脂糖中電泳，EB染色后經(jīng)凝膠成像系統(tǒng)檢測并拍照。利用RAPD-PCR-RFLP program進(jìn)行酵母菌的聚類分析。將所得電泳圖譜輸入DSP軟件中，按步操作，得出菌株間的遺傳相似系數(shù)。

表2 30株酵母菌糖發(fā)酵試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results of 30 yeast strains sugar fermentation test

2 結(jié)果與分析

2.1 利用WL培養(yǎng)基對酵母菌初步形態(tài)分類

從沙城的玫瑰香葡萄表面分離所得酵母編號為B1～B3，霞多麗葡萄表面分離所得酵母編號為C1～C3，龍眼葡萄表面所得酵母編號為D1～D4，蛇龍珠葡萄表面所得酵母編號為E1～E4；從昌黎十里鋪的赤霞珠葡萄表面分離所得酵母編號為赤1、赤2、赤4、赤5、赤8、赤11、赤12、赤14、赤16，玫瑰香葡萄表面所得酵母編號為玫1、玫2、玫3，龍眼葡萄表面所得酵母編號為龍1～龍4。用WL營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基， 根據(jù)菌落的顏色和形態(tài)將其聚類，共分為5種形態(tài)類型[11]，如表1。

由此可見，菌落顏色有灰綠色帶藍(lán)色、深綠色、奶油色帶綠色、奶油色等，菌落質(zhì)地粘稠，菌落有的平伏，有的中間隆起，表面有的光滑反光，有的光滑黯淡，菌落邊緣形態(tài)各異。

2.2 生理生化鑒定

2.2.1 發(fā)酵糖類試驗(yàn)結(jié)果

不同的含糖培養(yǎng)基對所分離的菌株進(jìn)行糖發(fā)酵試驗(yàn)結(jié)果見表2。碳源是微生物生長必需的含碳營養(yǎng)物，約占酵母菌體干重的50%，因此碳源是僅次于水分的菌株生長需求量的一大類營養(yǎng)物質(zhì)。碳源是組成其結(jié)構(gòu)的物質(zhì)，同時(shí)對異氧微生物來說，碳源為其生命活動(dòng)提供所需要的能量[12]。碳源的種類不同，對酵母菌的生長也有不同的影響，酵母菌對各種碳源的利用因種類不同而存在差異，本試驗(yàn)中所用碳源分別為葡萄糖、D-果糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖。由表2可知，編號為B1、E1、龍1、龍2、龍4、玫3的酵母菌株可發(fā)酵3種以上糖類；酵母菌株C1、D1、赤8、赤12、赤16不能發(fā)酵這5種糖[13]。

2.2.2 其他生理生化試驗(yàn)結(jié)果

由表3可知，所有供試菌株均不能產(chǎn)生類淀粉化合物，也不能分解尿素；只有酵母菌D2、E2、玫1、玫3可以還原硝酸鹽；編號為B1、D4、龍4、玫1、玫3的酵母菌可以同化肌醇；赤4、赤11、龍2、龍3和龍4具有抗放線菌酮的特性。

表3 30株酵母菌菌株生理生化特征Table 3 Physiological and biochemical characteristics of 30 yeast strains

2.3 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳檢測

采用SDS裂解法從供試酵母菌株中提取基因組DNA，經(jīng)核酸蛋白測定儀檢測純度和含量，OD260/OD280的值均接近1.8，所以其純度均能滿足PCR擴(kuò)增反應(yīng)要求。將引物擴(kuò)增后用于1%瓊脂糖凝膠電泳。對圖1的電泳結(jié)果分析，30株酵母菌進(jìn)行RAPD擴(kuò)增及電泳后，有20株酵母菌擴(kuò)增出了相應(yīng)DNA條帶，擴(kuò)增條帶數(shù)目在1～7條，其分子量在250～3000 bp。由圖譜可以看出，大多數(shù)酵母菌的擴(kuò)增條帶數(shù)均在3條以上，說明此引物對菌株的多態(tài)性較好，重復(fù)2次結(jié)果一致，從而進(jìn)一步說明此引物可以對大多數(shù)酵母菌進(jìn)行鑒別與分類。

2.4 酵母菌株的聚類分析

以遺傳相似性為基礎(chǔ)，應(yīng)用RAPD-PCR-RFLP program軟件，和UPGMA（Unweighted Pair Group Method Using Average Linkage）算法將20株酵母菌進(jìn)行聚類分析并建立遺傳進(jìn)化樹狀圖，如圖2。從聚類結(jié)果可以看出，20株酵母菌被分成2組，第一組由19株酵母菌組成，遺傳相似系數(shù)從53.43%至100.00%，其中E3和E4、玫3和龍1、赤1和D3、赤8和赤16、B1和B2、D2和D4的遺傳相似系數(shù)分別達(dá)到100.00%；第二組只有玫1。與第一組比較，遺傳相似系數(shù)為10.79%。遺傳相似系數(shù)達(dá)到100.00%的菌株具有極高的同源性，可以認(rèn)定為同一種菌。因此，經(jīng)過聚類后，成功地去除6株菌，剩余14株菌。再利用菌株的形態(tài)學(xué)特征、生理生化特點(diǎn)及其遺傳相似性進(jìn)行種屬的分析。據(jù)生理生化特征，查閱《酵母菌的特征與分類鑒定手冊》，進(jìn)一步確定各菌株所在屬是否符合此分類，并最終將菌株鑒定到種（表4）。

圖1 酵母菌株的PCR電泳圖Figure 1 PCR electrophoresis of yeast strains

圖2 20株酵母菌的RAPD聚類分析Figure 2 RAPD cluster analysis of 20 yeast strains

表4 不同產(chǎn)地不同葡萄品種所附酵母菌種屬Table 4 Different grape varieties attached yeast genera in different regions

3 討論與結(jié)論

從河北沙城、昌黎釀酒葡萄產(chǎn)地采集不同品種樣品，從葡萄表面共分離得到73株酵母菌，本次試驗(yàn)隨機(jī)抽取了其中的30株進(jìn)行相關(guān)研究。結(jié)果表明，所分離的菌株屬于7個(gè)不同的屬：酵母屬（Saccharomyces）、有孢漢遜酵母屬（Hanseniaspora）、畢赤氏酵母屬（Pichia）、酒香酵母屬（Brettanomyces）、克勒克酵母屬（Kloeckera）、假絲酵母屬（Candida）、隱球酵母屬（Cryptococcus）。各個(gè)菌株的形態(tài)學(xué)和生化特性都符合相應(yīng)的種屬，共分布于14個(gè)種。這一結(jié)果表明，釀酒葡萄果粒表皮上含有豐富的酵母菌資源，并可解釋因葡萄酒多年釀造，一些菌株在此環(huán)境中含量較高，并在葡萄表明形成優(yōu)勢生長的結(jié)果。與昌黎相比，沙城地區(qū)的晝夜溫差較大，總體氣溫偏低，所以初步推測兩地葡萄表面所附酵母菌種類差異可能與此有關(guān)。從鑒定結(jié)果可見，昌黎地區(qū)鑒定得到的種屬數(shù)要多于沙城地區(qū)，這可能由于昌黎的地理和氣候條件較為適宜酵母菌的生存，適合各類酵母菌的生長?？梢?，兩地相同葡萄表面酵母菌種存在很大差異。本研究對于葡萄果皮上所存在釀酒酵母種類、數(shù)量以及不同品種葡萄所附著的釀酒酵母的種類均具有重要的參考價(jià)值，為篩選適合該產(chǎn)區(qū)葡萄酒生產(chǎn)的優(yōu)良酵母菌種奠定了基礎(chǔ)。

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