相 麗，榮國(guó)華，戴紅英，張菲菲，田 靜，張桂萍

(1.青島大學(xué)附屬醫(yī)院婦科，山東 青島 266000；2.青島市市立醫(yī)院(集團(tuán))乳腺外科，山東 青島 266077)

卵巢上皮性癌為女性生殖系統(tǒng)中致死率最高的疾病，其大部分組織學(xué)類型為高級(jí)別漿液性癌，發(fā)病時(shí)多為晚期，進(jìn)展迅速，常伴盆腹腔轉(zhuǎn)移和不良預(yù)后。因此，針對(duì)卵巢高級(jí)別漿液性癌的研究具有切實(shí)的臨床意義。近年來(lái)，卵巢癌的起源研究取得了很大的進(jìn)展。傳統(tǒng)的卵巢表面上皮起源學(xué)說(shuō)受到挑戰(zhàn)，新的輸卵管起源學(xué)說(shuō)獲得越來(lái)越多的證據(jù)支持，最新的世界衛(wèi)生組織(WHO)分期和美國(guó)婦科腫瘤協(xié)會(huì)的卵巢癌預(yù)防方案中均納入了卵巢高級(jí)別漿液性癌的輸卵管起源理論。在本實(shí)驗(yàn)中，將采集卵巢高級(jí)別漿液性癌、輸卵管上皮和卵巢上皮的組織標(biāo)本，分析比較其組織學(xué)表型和基因表達(dá)譜的相似性和差異性，為卵巢高級(jí)別漿液性癌的輸卵管起源學(xué)說(shuō)提供證據(jù)支持；進(jìn)而將通過(guò)光纖微珠芯片分析，篩選出可行的目的基因，并檢測(cè)其在卵巢高級(jí)別漿液性癌和輸卵管中的差異表達(dá)，揭示其與卵巢高級(jí)別漿液性癌“輸卵管起源”發(fā)病機(jī)制的相關(guān)性。

1材料與方法

1.1材料來(lái)源

研究對(duì)象收集2015年3月至2016年10月于青島大學(xué)附屬醫(yī)院婦科行手術(shù)切除的卵巢高級(jí)別漿液性癌新鮮組織標(biāo)本及因子宮良性病變行全子宮+雙附件切除術(shù)的輸卵管、卵巢新鮮組織標(biāo)本各36例用以進(jìn)行組織學(xué)表達(dá)及基因譜分析研究。卵巢癌患者年齡39～67歲，中位年齡49.3歲；良性病變患者年齡47～65歲，中位年齡52歲。所有患者術(shù)前均已簽署知情同意書。

主要試劑基因表達(dá)譜分析平臺(tái)購(gòu)自美國(guó)Illumina公司，實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)(real time polymerase chain reaction，RT-PCR)試劑盒購(gòu)自德國(guó)Qiagen公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及隨機(jī)引物購(gòu)自美國(guó)Promega公司，腫瘤關(guān)聯(lián)鈣信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)因子2(tumor-associated calcium signal transducer 2，TACSTD2)抗體購(gòu)自美國(guó)R&D公司，配對(duì)盒基因8(Paired Box Gene 8，PAX8)抗體購(gòu)自美國(guó)Proteintech公司,二氨基聯(lián)苯胺(3,3′-diaminobenzidine，DAB)顯色試劑盒購(gòu)自中杉金橋公司。

1.2方法

1.2.1免疫組化

免疫組化及結(jié)果判定常規(guī)石蠟包埋組織切片，厚度約5μm。常規(guī)脫蠟、脫苯、抗原修復(fù)后，滴加一抗(PAX8，1：100),山羊血清封閉,滴加二抗,滴加高敏過(guò)氧化物酶,滴加新鮮配制的DAB溶液顯微鏡下控制顯色程度，適時(shí)終止顯色。每次染色均以已知PAX8陽(yáng)性的輸卵管上皮切片為陽(yáng)性對(duì)照，用PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。參照文獻(xiàn)，大于10%的細(xì)胞核染色可判定PAX8陽(yáng)性表達(dá)[1]。

1.2.2基因表達(dá)譜分析

從采集的卵巢高級(jí)別漿液性癌、輸卵管上皮、卵巢表面上皮組織樣本中隨機(jī)挑選各4例，提取mRNA并純化，通過(guò)IlluminahumanHT-12 v4 expression BeadChip平臺(tái)進(jìn)行基因表達(dá)譜分析，應(yīng)用GenomeStudio軟件對(duì)芯片數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化處理，并篩選出差異表達(dá)基因。

1.2.3實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)

RT-PCR提取卵巢高級(jí)別漿液性癌和輸卵管上皮組織的細(xì)胞總RNA，提純并測(cè)定濃度，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。

根據(jù)BLAST軟件設(shè)計(jì)引物：上游引物GCTTCCCTGT￣TCTGATCCTATC；下游引物TCTTATACTCTACCCGAC￣CTGC。將引物加入實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)體系，按照反應(yīng)條件(42℃ 5min,95℃ 10s，58℃ 30s，40個(gè)循環(huán))在Light Cycler 480上進(jìn)行。

1.2.4蛋白印記

將卵巢高級(jí)別漿液性癌、輸卵管上皮組織標(biāo)本進(jìn)行稱重、粉碎、裂解。按BCA蛋白質(zhì)定量法測(cè)定樣品濃度，然后進(jìn)行變性聚丙烯酰胺不連續(xù)凝膠電泳(sodium salt-Polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)。分別上樣，電泳分離蛋白，濃縮膠80V，分離膠120V。然后將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到0.45μm孔徑聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidene fluoride，PVDF)。封閉過(guò)的膜加入一抗(TACSTD2，1:2 000)4℃孵育過(guò)夜，二抗孵育2h。ECL顯影，上機(jī)檢測(cè)。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(χ±S)表示，兩組數(shù)據(jù)比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，兩組數(shù)據(jù)分布的概率比較采用卡方檢驗(yàn)，P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1卵巢高級(jí)別漿液性癌和輸卵管上皮、卵巢上皮的組組織學(xué)表型相似性比較

PAX8目前被推薦用于區(qū)別苗勒氏管起源和非苗勒氏管起源腫瘤的可行分子標(biāo)志物。免疫組化法檢測(cè)顯示：PAX8在卵巢高級(jí)別漿液性癌的陽(yáng)性表達(dá)率為83.33%(30/36)，在輸卵管上皮中的陽(yáng)性表達(dá)率為100.00%(36/36)，在卵巢上皮中的陽(yáng)性表達(dá)率為16.67%(6/36)。卵巢高級(jí)別漿液性癌和輸卵管上皮之間的PAX8表達(dá)率比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=2.180，P=0.140>0.05)；而卵巢高級(jí)別漿液性癌和卵巢上皮的PAX8表達(dá)率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=10.670，P=0.001<0.05)。由此可見，相比較卵巢表面上皮，卵巢高級(jí)別漿液性癌和輸卵管上皮之間更具有組織學(xué)表型上的相似性，見圖1。

圖1免疫組化法檢測(cè)苗勒氏管起源標(biāo)志物PAX8在輸卵管上皮、卵巢高級(jí)別漿液性癌、卵巢上皮中的表達(dá)(×100)

Fig.1 Expression of PAX8 in fallopian tube epithelium, high-grade ovarian serous carcinoma, and ovarian epithelium detected by immunohistochemistry (×100)

2.2卵巢高級(jí)別漿液性癌、輸卵管上皮、卵巢上皮的基因表達(dá)譜相似性比較

通過(guò)Illumina光纖微珠芯片平臺(tái)進(jìn)行卵巢高級(jí)別漿液性癌、輸卵管上皮、卵巢表面上皮的基因表達(dá)譜比較，發(fā)現(xiàn)卵巢高級(jí)別漿液性癌和輸卵管上皮被聚類到同一分支并且距離較近。提示相對(duì)于卵巢上皮，卵巢高級(jí)別漿液性癌和輸卵管上皮更具有基因表達(dá)譜的相似性，見圖2A。

注：A為卵巢高級(jí)別漿液性癌和輸卵管上皮被聚類到同一分支并且距離較近；B為相對(duì)于輸卵管上皮，在卵巢高級(jí)別漿液性癌中差異表達(dá)的候選基因。

圖2卵巢高級(jí)別漿液性癌、輸卵管上皮、卵巢上皮的基因表達(dá)譜聚類分析

Fig.2 Clustering analysis of gene expression profile in high-grade ovarian serous carcinoma, fallopian tube and ovarian epithelium

2.3卵巢高級(jí)別漿液性癌和輸卵管上皮之間的差異表達(dá)基因

數(shù)據(jù)分析顯示：卵巢高級(jí)別漿液性癌和輸卵管上皮之間存在2 412個(gè)差異表達(dá)基因，包括822個(gè)上調(diào)基因及1 590個(gè)下調(diào)基因。結(jié)合文獻(xiàn)檢索及綜合評(píng)析，篩選出若干候選基因，其中差異表達(dá)顯著并且與腫瘤關(guān)系密切的TACSTD2成為本次研究的目標(biāo)，見圖2B及表1。

表1相比較輸卵管上皮，在卵巢高級(jí)別漿液性癌中差異表達(dá)的部分基因

Table 1 Different expressed genes in high-grade ovarian serous carcinoma compared with fallopian tube epithelium

項(xiàng)目基因全稱相對(duì)倍數(shù)上調(diào)基因 S100PS100鈣結(jié)合蛋白P(S100calciumbind?ingproteinP)61．3 TACSTD2腫瘤關(guān)聯(lián)鈣信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)因子2(tumor?as?sociatedcalciumsignaltransducer2)25．9 PTGES前列腺素E合成酶(prostaglandinEsyn?thase)23．3 MGST1微粒體谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶1(microsomalglutathioneS?transferase1)16．7 TMPRSS3跨膜絲氨酸蛋白酶3(transmembraneprotease，serine3)14．7下調(diào)基因 LDOC1癌癥亮氨酸拉鏈下調(diào)因子1(leucinezipper，down?regulatedincancer1)-28．3 LXN膠乳素(latexin)-25．0

2.4目的基因TACSTD2在卵巢高級(jí)別漿液性癌組織中的基因和蛋白表達(dá)

通過(guò)Real time PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，相比較于輸卵管上皮，TACSTD2在卵巢高級(jí)別漿液性癌中的基因表達(dá)升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-50.411，P=0.000<0.05)。通過(guò)Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，相比較于正常輸卵管上皮，TACSTD2在卵巢高級(jí)別漿液性癌中的蛋白表達(dá)升高。見圖3。

注：A為通過(guò)Real time PCR檢測(cè)TACSTD2的基因表達(dá)，F(xiàn)是輸卵管上皮，S是卵巢高級(jí)別漿液性癌；B為通過(guò)Western blot檢測(cè)TACSTD2的蛋白表達(dá)，R1～R3是輸卵管上皮，R4-R6是卵巢高級(jí)別漿液性癌。

圖3 TACSTD2在卵巢高級(jí)別漿液性癌中的異常表達(dá)

Fig.3 Abnormal expression of TACSTD2 in high-grade ovarian serous carcinoma

3討論

3.1卵巢癌的表面上皮起源理論缺陷

作為致死率最高的女性生殖系統(tǒng)腫瘤，卵巢癌約75%的組織學(xué)類型表現(xiàn)為高級(jí)別漿液性癌，發(fā)病時(shí)大多為晚期，進(jìn)展迅速，常伴盆腹腔轉(zhuǎn)移和不良預(yù)后[2]。因此，針對(duì)卵巢高級(jí)別漿液性癌的研究，具有切實(shí)的臨床意義，一直推動(dòng)研究者和臨床醫(yī)師對(duì)其起源和發(fā)病機(jī)制的探索。卵巢癌的起源具有爭(zhēng)議性，傳統(tǒng)的卵巢表面上皮起源理論認(rèn)為卵巢癌起源于卵巢表面生發(fā)上皮。隨著近十幾年的研究進(jìn)展，人們逐漸發(fā)現(xiàn)卵巢表面上皮起源理論本身存在的缺陷。首先，研究者沒(méi)有找到卵巢表面上皮化生的直接證據(jù)，也一直未能在卵巢組織內(nèi)發(fā)現(xiàn)卵巢癌的癌前病變。另外，卵巢上皮性癌和卵巢表面上皮在免疫表型上也存在差異。研究發(fā)現(xiàn)，間皮組織來(lái)源的分子標(biāo)志物間皮素(calretinin)在卵巢表面上皮多呈陽(yáng)性表達(dá)，而在卵巢上皮性癌中卻完全不表達(dá)。而一些生物學(xué)印跡如人類同源盒基因A(human homeobox gene A，HOXA)、PAX8、配對(duì)盒基因2(paired box gene 2，PAX2)在卵巢上皮性癌中多呈過(guò)表達(dá)，但在卵巢表面上皮中不表達(dá)[3-4]。與之相一致，在本次研究中，通過(guò)免疫組化檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，苗勒氏管組織起源的分子標(biāo)志物PAX8在輸卵管表面上皮、卵巢高級(jí)別漿液性癌均多呈陽(yáng)性表達(dá)，而在卵巢表面上皮中卻多不表達(dá)，揭示輸卵管上皮和卵巢高級(jí)別漿液性癌的組織學(xué)表型相似性。而卵巢高級(jí)別漿液性癌的苗勒氏管起源可能性與卵巢表面上皮的間皮組織起源的確是不相符合的。

3.2卵巢癌的輸卵管起源學(xué)說(shuō)進(jìn)展

目前卵巢高級(jí)別漿液性癌的輸卵管起源學(xué)說(shuō)在國(guó)內(nèi)外均獲得很大進(jìn)展。隨著SEE-FIM Protocol規(guī)范應(yīng)用，輸卵管傘端病變的檢出率大大增加。Piek等于2001年在BRCA+婦女預(yù)防性切除的輸卵管標(biāo)本中發(fā)現(xiàn)高級(jí)別漿液性癌以及原位癌病變，但在卵巢標(biāo)本中卻沒(méi)有找到相關(guān)癌灶和癌前病變。Kindelberger等在2007年進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，輸卵管上皮內(nèi)原位癌也表現(xiàn)出和卵巢高級(jí)別漿液性癌一致的特征性TP53突變。Crum等于2011年在輸卵管上皮中發(fā)現(xiàn)了特征性的病理學(xué)形態(tài)改變并提出“p53 signatures”和“secretory cell outgrowths”的概念，推測(cè)其可能為漿液性癌的前驅(qū)病變。國(guó)內(nèi)對(duì)卵巢癌的二元論模型和輸卵管起源學(xué)說(shuō)日漸重視，并分別在卵巢高級(jí)別和低級(jí)別漿液性癌的發(fā)病機(jī)制研究中有所發(fā)現(xiàn)[5]。最新的WHO分期納入了卵巢高級(jí)別漿液性癌輸卵管起源的理論[6]。另外，美國(guó)婦科腫瘤協(xié)會(huì)(Society of Gynecologic Oncology,SGO)也強(qiáng)調(diào)了輸卵管起源在卵巢高級(jí)別漿液性癌診治和預(yù)防中的重要性[7]。在本次研究中，通過(guò)Illumina光纖微珠芯片平臺(tái)進(jìn)行卵巢高級(jí)別漿液性癌、輸卵管上皮、卵巢表面上皮的基因表達(dá)譜比較，發(fā)現(xiàn)卵巢高級(jí)別漿液性癌和輸卵管上皮被聚類到同一分支并且距離較近。提示相對(duì)于卵巢上皮，卵巢高級(jí)別漿液性癌和輸卵管上皮更具有基因表達(dá)譜的相似性。當(dāng)然，這些數(shù)據(jù)僅為輸卵管起源提供了支持性證據(jù)，并不能從根本上證明卵巢高級(jí)別漿液性癌和輸卵管上皮的同源性。要徹底證實(shí)此理論，需大量研究，卻可為臨床帶來(lái)革命性的影響。

3.3 TACSTD2的研究意義

基于目前國(guó)內(nèi)外對(duì)輸卵管起源理論的認(rèn)可趨勢(shì)，從卵巢高級(jí)別漿液性癌和輸卵管上皮的差異表達(dá)基因入手以探索發(fā)病機(jī)制，應(yīng)是可行之策。從本次芯片分析獲取的數(shù)據(jù)中，結(jié)合文獻(xiàn)檢索及綜合評(píng)析，差異表達(dá)顯著并且與腫瘤關(guān)系密切的TACSTD2被篩選出來(lái)，成為具體分析的目的基因。TACSTD2基因即tumor-associated calcium signal transducer 2，又稱Trop2、MlSl基因，全長(zhǎng)1.8Kb，編碼323個(gè)氨基酸。TACSTD2 蛋白是細(xì)胞表面有單個(gè)跨膜區(qū)域的磷酸化的糖蛋白，含有一個(gè)EGF樣的重復(fù)區(qū)，一個(gè)甲狀腺球蛋白樣的重復(fù)區(qū)和一個(gè)跨膜區(qū)，羧基端有絲氨酸和酪氨酸的磷酸化位點(diǎn)和PIP2結(jié)合序列。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)TACSTD2在多種上皮癌中高表達(dá)，而在正常上皮組織中表達(dá)很低或者不表達(dá)。TACSTD2的過(guò)表達(dá)可促進(jìn)某些腫瘤細(xì)胞包括卵巢癌的增殖、浸潤(rùn)、侵襲等生物學(xué)行為；反之，沉默TACSTD2基因則可抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)[8]。研究發(fā)現(xiàn)TACSTD2與多種調(diào)控因子有所關(guān)聯(lián)，可能通過(guò)激活ERK/MAPK通路驅(qū)動(dòng)NF-kB、cyclin D1等蛋白表達(dá)發(fā)揮作用[9-10]。本次研究證實(shí)，TACSTD2在卵巢高級(jí)別漿液性癌中呈高表達(dá)，而在輸卵管上皮中呈低表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示其與腫瘤發(fā)病機(jī)制的相關(guān)性。目前的研究尚表淺，下一步將著重分析TACSTD2在卵巢癌中的具體分子機(jī)制。

總之，本研究通過(guò)比較卵巢高級(jí)別漿液性癌、輸卵管上皮和卵巢表面上皮的組織學(xué)表型及基因表達(dá)譜相似性，為卵巢癌的“輸卵管起源”學(xué)說(shuō)提供證據(jù)支持；并通過(guò)聚類分析篩選出差異基因TACSTD2，明確其在卵巢高級(jí)別漿液性癌中的異常表達(dá)，提示其與卵巢高級(jí)別漿液性癌“輸卵管起源”發(fā)病機(jī)制的相關(guān)性。下一步將探討闡釋TACSTD2在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用及具體分子機(jī)制，以期為臨床診斷及預(yù)后指標(biāo)提供可行的分子標(biāo)志物選擇。

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