冀 靜，左 萍，黃康榕，劉海娟，方 靜，王月玲

(1.西安交通大學第一附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，陜西 西安，710061；2.西安市第四醫(yī)院婦產(chǎn)科，陜西 西安 710004)

宮頸癌是女性最常見的婦科惡性腫瘤之一，全世界范圍內(nèi)每年新發(fā)病例約52.76萬，死亡26.57萬，居發(fā)展中國家女性癌癥死亡原因第三位[1]。在我國，年輕女性發(fā)病率亦逐年升高，雖然人乳頭瘤病毒(human papillomavirus，HPV)感染與宮頸癌發(fā)病密切相關，但目前宮頸癌發(fā)生發(fā)展的具體機制仍未完全闡明。Sox2(SRY-related high-mobility-group box2)基因是迄今為止最早發(fā)現(xiàn)的干細胞轉錄因子之一，在維持胚胎干細胞的多潛能性、自我更新能力、器官發(fā)生、細胞分化等過程中發(fā)揮關鍵作用[2]。近年來研究發(fā)現(xiàn)Sox2亦參與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程，如乳腺癌、肺癌等[3-4]。Singh等早在2012年就從非小細胞肺癌細胞系中分離出具有干細胞特征的SP(side population)細胞，其Sox2、Oct4(octamer-binding transcription factor 4)和Nanog(nanog homeobox)表達升高；而通過siRNA瞬時轉染下調(diào)Sox2基因的表達后，SP細胞的增殖能力下降[4]。Sox2也可以通過調(diào)控G1/S-特異性周期蛋白-D3(G1/S-specific cyclin-D3 ，CCND3)、G1/S-特異性周期蛋白-D1(G1/S-specific cyclin-D1，CCND1)、p21(cyclin-dependent kinase inhibitor 1，p21)等多個細胞周期相關基因改變細胞周期進程從而加速細胞的惡性轉變及增殖。在我們前期研究中發(fā)現(xiàn)，宮頸癌組織中Sox2的表達明顯高于正常宮頸組織，并且Sox2的表達與病理分級相關[5]。為了進一步探討Sox2在宮頸癌發(fā)生發(fā)展中的作用，本實驗在高表達Sox2的宮頸鱗癌C33A細胞中穩(wěn)定沉默Sox2基因的表達，探討下調(diào)Sox2對宮頸癌細胞增殖能力的影響及其可能的機制。

1材料和方法

1.1主要試劑

人宮頸鱗癌細胞株C33A由西安交通大學第一附屬醫(yī)院轉化實驗中心惠存，胎牛血清購自法國Biowest公司；Sox2基因shRNA干擾質(zhì)粒、qPCR引物購自美國Gene Copoeia公司；轉染試劑Turbo Fect購自美國Thermo Scientific公司；反轉錄、qPCR試劑盒購自Takara寶生物工程有限公司；嘌呤霉素，兔抗人Sox2、β-actin單克隆抗體購自美國Santa Cruz公司；DMEM高糖培養(yǎng)基(Dulbecco’s modified Eagle medium，DMEM)、胰酶、四甲基偶氮唑藍[3-(4,5-dimethythiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide, MTT)]、碘化丙啶(propidium iodide, PI)、Rnase酶均購自美國Sigma公司。

1.2細胞培養(yǎng)

宮頸癌C33A細胞常規(guī)置于恒溫37℃、含5%CO2的細胞培養(yǎng)箱中，用含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)，待細胞生長至80%密度時，用0.25%胰酶常規(guī)消化、傳代培養(yǎng)。

1.3細胞轉染及穩(wěn)轉細胞株的建立

轉染嚴格參照轉染試劑TurboFect的說明書進行操作。轉染前24h，取2×105個處于對數(shù)生長期的C33A細胞接種于35mm平皿中，置37℃培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。轉染當天將shRNA質(zhì)粒、對照組NC質(zhì)粒分別與轉染試劑按比例混勻后進行轉染，轉染后12h換液，加入2mL新鮮含10%胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)的DMEM培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)。轉染24h后，胰酶常規(guī)消化細胞，按照1：2比例接種到100mm平皿中，并加入嘌呤霉素(600ng/mL)進行壓力篩選3～4周，在熒光顯微鏡下挑取標記的綠色單克隆并擴增、傳代，經(jīng)實時熒光定量核酸擴增法(quantitative polymerase chain reaction，qPCR)和蛋白質(zhì)印跡法(Western blot)驗證。

1.4 Western blot檢測Sox2蛋白、cyclinD1蛋白表達情況

穩(wěn)定干擾的克隆株細胞(干擾組shRNA-Sox2-C33A和對照組shRNA-NC-C33A細胞)擴增后，待細胞融合度達80%～90%時，加入細胞裂解液提取總蛋白，ABC試劑盒測定蛋白濃度。經(jīng)煮沸變性后，取40μg/孔上樣，電泳，轉膜，封閉，分別加入兔抗人Sox2單克隆抗體(1: 1 000)，兔抗人β-actin單克隆抗體(1：1 000)，兔抗人cyclinD1抗體(1:500)，4℃孵育過夜。次日TBST(Tris-Buffered Saline and Tween-20)緩沖液洗膜4次后，HRP-山羊抗兔(1: 5 000)37℃孵育1 h，使用TBST再次洗膜3次，經(jīng)電化學發(fā)光法顯色并曝光，灰度分析目的蛋白與內(nèi)參β-actin的相對表達量。

1.5 MTT法繪制細胞生長曲線

將處于對數(shù)生長期的干擾組shRNA-Sox2-C33A細胞及其對照組細胞以1×104cell/孔密度接種于24孔板，分別培養(yǎng)1d、3d、5d、7d后，棄去培養(yǎng)液，每孔加入200μL DMEM+100μL MTT(5 mg/mL)，37℃培養(yǎng)箱避光孵育4 h。將24孔板1 000rpm離心5min，棄上清，每孔中加入250μL二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)，避光震蕩混勻10min，設置調(diào)零孔、空白對照孔，每組6個復孔，酶聯(lián)免疫儀檢測490nm波長的各孔吸光度值(optical density，OD值)。

1.6平板克隆實驗

將穩(wěn)定干擾的兩組細胞經(jīng)胰酶消化后，計數(shù)，分別以200cell/孔接種于60mm平皿中，搖勻后置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～3周，取出培養(yǎng)皿，棄去培養(yǎng)液，甲醇固定后0.1%結晶紫染色30min，純水洗滌后，計數(shù)克隆并計算克隆形成率(%)=克隆數(shù)目/接種細胞數(shù)目×100%。

1.7流式細胞術測定細胞周期分布變化

胰酶消化處于對數(shù)生長期的干擾組細胞及對照組細胞，制成2×105/mL的細胞懸液，采用冰預冷PBS(phosphate buffered saline, PBS)洗滌2次，75%冰乙醇4℃固定30min，1 000rpm離心5min去除乙醇并使用冷PBS洗滌細胞，再次收集細胞向其加入400μLPI染液(500μg/mL)，置于室溫使其避光染色30min。過300目尼龍網(wǎng)濾去細胞團塊，上流式細胞儀檢測細胞周期(美國BD公司)。

1.8統(tǒng)計學方法

運用SPSS 17.0軟件進行數(shù)據(jù)處理計量資料以均數(shù)±標準差(χ±S)表示，組間差異采用配對樣本t檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2結果

2.1穩(wěn)定干擾Sox2基因的C33A單克隆細胞株的建立及鑒定

C33A細胞成功轉染shRNA-Sox2質(zhì)?；蚱鋵φ召|(zhì)粒后，在含嘌呤霉素的培養(yǎng)基中壓力培養(yǎng)3～4周形成肉眼可見白色克隆，在熒光顯微鏡下挑取綠色熒光標記的克隆繼續(xù)培養(yǎng)、傳代、擴增，提取RNA后行qPCR實驗鑒定：和對照組shRNA-NC-C33A細胞相比，干擾組shRNA-Sox2-C33A細胞中Sox2基因mRNA(messenger RNA)相對表達量為0.45±0.12，差異具有顯著統(tǒng)計學意義(t=7.94，P<0.01)，見圖1。表明我們成功構建了穩(wěn)定干擾Sox2基因的C33A細胞(shRNA-Sox2-C33A)及其對照組細胞(NC-Sox2-C33A)，可用于后續(xù)實驗。

注：**P<0.01。

圖1 qPCR法鑒定穩(wěn)定干擾Sox2的C33A細胞克隆株

Fig.1 Identifying of stably transfected shRNA-Sox2 in C33A cell clones by qPCR

2.2 Sox2基因?qū)m頸鱗癌C33A細胞增殖能力的影響

MTT結果顯示(圖2)，隨著時間的延長，干擾組shRNA-Sox2-C33A細胞的增殖速度明顯慢于對照組shRNA-NC-C33A細胞，兩組細胞的OD值在第5d后差異具有統(tǒng)計學意義(t=10.93，P<0.05)，表明干擾Sox2基因表達能夠抑制宮頸癌C33A細胞的增殖。

注：*P<0.05;**P<0.01。

圖2 MTT法檢測穩(wěn)定沉默Sox2后C33A細胞增殖曲線

Fig.2 Growth curves of C33A cell after stably transfected with shRNA-Sox2 by MTT

2.3 Sox2基因?qū)m頸鱗癌C33A克隆形成能力的影響

在培養(yǎng)皿中接種相同細胞數(shù)并培養(yǎng)2周后，干擾組shRNA-Sox2-C33A組的克隆形成率為(20.33±3.51)%，而對照組shRNA-NC-C33A細胞的克隆形成率為(44.67±5.51%)，兩組間的差異有統(tǒng)計學意義(t=8.30，P<0.01)，見圖3，結果表明Sox2被干擾后C33A細胞的增殖能力顯著減弱。

注：**P<0.01。

圖3穩(wěn)定沉默Sox2后C33A細胞的克隆形成能力

Fig.3 Colony formation ability of C33A cell after stably silencing of Sox2

2.4 Sox2基因?qū)m頸鱗癌C33A細胞周期分布的影響

細胞周期測定(圖4)發(fā)現(xiàn)：Sox2表達下調(diào)之后，干擾組shRNA-Sox2-C33A細胞G0/G1期細胞比例為(60.21±2.61)%，顯著高于對照組shRNA-NC-C33A細胞(45.60±4.83)%，差異具有統(tǒng)計學意義(t=-4.60，P<0.01)；而對于S期和G2/M期而言，對照組細胞的比例都高于干擾組，差異具有統(tǒng)計學意義(t值分別為4.67、3.08，均P<0.05)。細胞周期的結果表明沉默Sox2表達后宮頸癌C33A細胞周期被阻滯于G0/G1。

圖4穩(wěn)定沉默Sox2對C33A細胞周期的影響

Fig.4 Influence on cell cycles of C33A cell by stably silencing of Sox2

2.5下調(diào)Sox2基因?qū)m頸癌細胞CyclinD1表達的影響

Western blot檢測結果發(fā)現(xiàn)，在宮頸癌細胞中干擾Sox2表達后，與對照組細胞相比，干擾組shRNA-Sox2-C33A細胞的細胞周期蛋白CyclinD1的表達明顯下降，差異具有統(tǒng)計學意義(t=113.79，P<0.05)，見圖5。

圖5 Western blot法檢測CyclinD1表達

Fig.5 CyclinD1 expression detected by Western blot

3討論

3.1干細胞轉錄因子Sox2的研究現(xiàn)狀

Sox2基因是SOX(SRY-like HMG box)基因家族成員之一，位于人染色體3q26.3～q27，它和Oct4基因一樣處于干細胞信號網(wǎng)絡調(diào)控中心，在維持胚胎干細胞自我更新、神經(jīng)發(fā)育、多向分化等發(fā)面發(fā)揮重要的作用。近年來的研究發(fā)現(xiàn)Sox2不僅維持胚胎干細胞的自我更新能力和多潛能性，而且也是腫瘤干細胞的關鍵轉錄因子之一，其表達的微小改變都將影響腫瘤干細胞的增殖和克隆形成能力[6]。目前已有大量研究表明Sox2基因的表達與多種惡性腫瘤的生物學行為相關，例如在乳腺癌[3]、胰腺癌[7]中，Sox2作為一個原癌基因的角色，其高表達促進腫瘤細胞的增殖和自我更新能力，促進細胞周期進程、抑制細胞凋亡；在喉癌[8]中Sox2基因促進腫瘤細胞的遷移和侵襲能力，在肺鱗癌中Sox2的高表達可延長患者的無瘤生存期[9]。

在前期研究中發(fā)現(xiàn)，干細胞轉錄因子Sox2在正常宮頸組織中僅為25%，且多集中在基底膜處，在宮頸癌組織中的表達為77.5%，且與病理分級相關[5]，這一結果提示Sox2在宮頸癌的發(fā)生發(fā)展中起到一定的作用。接著，從新鮮的宮頸癌細胞中懸浮培養(yǎng)出宮頸癌腫瘤球細胞，誘導其分化后腫瘤球貼壁生長，免疫組化結果發(fā)現(xiàn)Sox2在宮頸癌腫瘤球細胞中陽性表達，而在其分化后細胞中不表達，這些結果提示Sox2可能是宮頸癌干細胞轉錄因子之一，其可能通過調(diào)控癌干細胞生長而在宮頸癌發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮作用。

3.2利用siRNA沉默Sox2的表達后，對宮頸癌細胞增殖能力的影響

本實驗在前期研究的基礎上，采用基因沉默技術將shRNA質(zhì)粒轉染入高表達Sox2基因的宮頸鱗癌C33A細胞中，并采用嘌呤霉素壓力篩選，成功構建了穩(wěn)定下調(diào)Sox2基因的克隆細胞株shRNA-Sox2-C33A及其對照細胞shRNA-NC-C33A，經(jīng)qPCR方法檢測到Sox2在mRNA水平下調(diào)了60%左右。接著MTT實驗和平板克隆形成實驗表明Sox2基因表達下調(diào)后，C33A細胞增殖速度明顯降低，體外平板克隆形成率下降。這些實驗結果同Sox2在尤文肉瘤中的結果保持一致[10]，也首次在宮頸癌中表明Sox2起著一個原癌基因的角色，一旦在宮頸癌C33A細胞中沉默Sox2基因表達，能夠抑制細胞的增殖和克隆形成能力。

3.3沉默Sox2對宮頸癌細胞增殖能力抑制的作用機制

細胞周期是指細胞從上一有絲分裂結束到下一次細胞分裂結束的全過程，包括靜止期(G0期)、DNA合成前期(G1期)、合成期(S期)、合成后期(G2期)及有絲分裂期(M期)。細胞進程改變也是細胞發(fā)生惡性轉變的重要原因，一旦細胞的正常周期程序不受控制，都將直接導致細胞進行不可抑制的惡性增殖。在正常細胞周期中，CyclinD1與周期蛋白依賴性激酶(cyclin-dependent kinases，CDK)4，6結合形成復合物后，并使CDK激活，從而磷酸化關鍵底物pRB(retinoblas￣toma protein，pRB)，促進脫氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid，DNA)轉錄，使細胞跨過G1/S期檢查點，促進細胞增殖。本實驗中，在高表達Sox2的宮頸癌C33A細胞中下調(diào)Sox2基因后，流式細胞術結果顯示干擾組shRNA-NC-C33A細胞的G0/G1期細胞較對照組明顯增多，而S期細胞減少，同時Western blot結果表明干擾組細胞CyclinD1表達下調(diào)，因此我們推測沉默Sox2基因表達能夠抑制宮頸癌細胞C33A的增殖，這一作用可能是通過下調(diào)細胞周期素CyclinD1來阻滯G1期細胞進入S期，從而抑制細胞增殖速度。這一實驗同Oppel等[11]在膠質(zhì)瘤細胞中的結果一致，同時本研究結果也進一步在宮頸癌中證明，沉默Sox2基因能夠抑制宮頸癌細胞增殖的分子機制。

綜上所述，在宮頸癌C33A細胞中穩(wěn)定下調(diào)Sox2的表達，能夠抑制宮頸癌細胞增殖、克隆形成能力，其可能通過下調(diào)細胞周期蛋白CyclinD1從而阻滯G1期細胞進入S期，發(fā)揮抑制細胞增殖的作用。本研究為宮頸癌的發(fā)病機制及宮頸癌干細胞研究提供了新的線索，Sox2有望成為宮頸癌基因治療的新靶標。

[1]Torre L A, Bray F, Siegel R L,etal. Global cancer statistics, 2012[J].CA Cancer J Clin,2015,65(2):87-108.

[2]Sarkar A, Hochedlinger K. The sox family of transcription factors: versatile regulators of stem and progenitor cell fate[J]. Cell Stem Cell, 2013,12(1):15-30.

[3]李雄武，張徽，柳滿然. Sox2下調(diào)表達對MDA-MB-231乳腺癌細胞β-catenin與轉錄中介因子γ的影響[J]. 第三軍醫(yī)大學學報, 2016, 38(1):55-61.

[4]Singh S, Trevino J, Bora-Singhal N,etal. EGFR/Src/Akt signaling modulates Sox2 expression and self-renewal of stem-like side-population cells in non-small cell lung cancer[J]. Mol Cancer, 2012,11:73.

[5]Ji J, Wei X, Wang Y. Embryonic stem cell markers Sox-2 and OCT4 expression and their correlation with WNT signal pathway in cervical squamous cell carcinoma[J].Int J Clin Exp Pathol, 2014,7(5):2470-2476.

[6]Acanda de la Rocha A M, López-Bertoni H, Guruceaga E,etal. Analysis of SOX2-regulated transcriptome in glioma stem cells[J]. PLoS One, 2016,11(9):e0163155.

[7]Herreros-Villanueva M, Zhang J S, Koenig A,etal. SOX2 promotes dedifferentiation and imparts stem cell-like features to pancreatic cancer cells[J]. Oncogenesis, 2013,2:e61.

[8]Yang N, Wang Y, Hui L,etal. Silencing SOX2 expression by RNA interference inhibits proliferation, invasion and metastasis, and induces apoptosis through MAP4K4/JNK signaling pathway in human laryngeal cancer TU212 cells[J]. J Histochem Cytochem, 2015, 63(9):721-733.

[9]Yoon H I, Park K H, Lee E J,etal. Overexpression of SOX2 Is Associated with Better Overall Survival in Squamous Cell Lung Cancer Patients Treated with Adjuvant Radiotherapy[J].Cancer Res Treat, 2016,48(2):473-482.

[10]Ren C, Ren T, Kang Y,etal. Inhibition of SOX2 induces cell apoptosis and G1/S arrest in Ewing's sarcoma through the PI3K/Akt pathway[J]. J Exp Clin Cancer Res, 2016,35:44.

[11]Oppel F, Müller N, Schackert G,etal. SOX2-RNAi attenuates S-phase entry and induces RhoA-dependent switch to protease-independent amoeboid migration in human glioma cells[J]. Mol Cancer, 2011,10:137.