盧夢琪，蔡耀通，吳旭平，何超銀，曾艷玲

（中南林業(yè)科技大學(xué) a.經(jīng)濟林培育與保護(hù)教育部重點實驗室；b.經(jīng)濟林育種與栽培國家林業(yè)局重點實驗室；c.經(jīng)濟林培育與利用湖南省協(xié)同創(chuàng)新中心，湖南 長沙 410004）

油茶Camellia oleifera屬山茶科山茶屬常綠小喬木，在我國已有2 300多年的栽培歷史，是我國南方重要的木本油料樹種，與油橄欖、椰子、油棕合稱為世界四大木本植物油料樹種。茶油富含不飽和脂肪酸，具有預(yù)防和治療高血壓、心血管系統(tǒng)疾病等功效，是國際糧農(nóng)組織重點推薦的保健植物食用油，也是我國政府提倡的純天然木本食用油，有“東方橄欖油”之稱[1-3]。據(jù)報道，全國油茶林面積約400多萬hm2，茶油產(chǎn)量約51.8萬t。但是，油茶種植生產(chǎn)中還存在優(yōu)質(zhì)品種少、產(chǎn)量不穩(wěn)定且低產(chǎn)等問題[4]。我國食用油對外依存度較高，研發(fā)和培育高產(chǎn)、高抗、高質(zhì)油茶新品種，不僅可以有效緩解國內(nèi)植物油缺乏的局面，而且可以帶動其相關(guān)產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，充分發(fā)揮油茶的生產(chǎn)潛力。

自然界中多倍體植株普遍存在。自從1937年Blakeslee等發(fā)現(xiàn)并證實秋水仙素可誘導(dǎo)植物多倍體之后，世界便掀起了一股多倍體研究熱潮。秋水仙素能抑制紡錘體的形成，使細(xì)胞在分裂前期或者后期染色體不能移向兩極而使染色體加倍[5]?，F(xiàn)已在獼猴桃[6]、蘋果[7]、三色堇[8]、矮牽牛[9]、番茄[10]、西瓜[11]、滇楊[12-13]和杜仲[14]多種林木、花卉、農(nóng)作物多倍體育種中獲得了成功。多倍體植株染色體成倍增加，基因也成倍增加，新陳代謝活躍，蛋白質(zhì)、碳水化合物、維生素、植物堿等物質(zhì)的合成速率加快，含量增多，其莖、葉、花、果實等變大[15]。目前，關(guān)于油茶多倍體育種的研究報道很少，國外的尚未見到，國內(nèi)也只有極少數(shù)。譬如，李鐵柱等[16]用秋水仙素處理油茶種子，獲得了多株普通油茶變異體，有的表現(xiàn)出葉、花、果實增大，有的則表現(xiàn)出早花早果。但是，種子本身異質(zhì)性強，所以本研究選取性狀差異小的同株系嫩葉為材料，采用組織培養(yǎng)與秋水仙素誘導(dǎo)相結(jié)合的方法（簡稱為“混培法”）誘導(dǎo)多倍體細(xì)胞，以期為后期篩選培育油茶多倍體優(yōu)良種質(zhì)，提高油茶產(chǎn)量提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試材料為油茶國家審定品種‘華碩’[17]當(dāng)年春季新抽嫩葉，采集地為中南林業(yè)科技大學(xué)生命科學(xué)樓頂樓油茶資源圃。

1.2 材料的處理

春季4月選取當(dāng)年生完全展開的嫩葉，用超純水沖洗2～3次，放入滅菌的燒杯中。在超凈工作臺上，用75%的酒精浸洗30～40 s，無菌水沖洗3～5次；用0.1%升汞溶液浸洗8 min，無菌水沖洗5～6次。用無菌濾紙吸干葉面水分后，將葉片切成0.5 cm×0.5 cm大小的葉盤，接種在附加了不同濃度秋水仙素的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上。

1.3 愈傷組織的誘導(dǎo)和再分化

愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基參照畢方鋮等[18]的油茶子葉愈傷組織最佳誘導(dǎo)配方，即為MS＋2.0 mg·L-12,4-D＋1.0 mg·L-1KT。秋水仙素的濃度梯度和處理時間參照陳杰等[19]誘導(dǎo)滇楊多倍體的秋水仙素濃度和時間設(shè)計，共組成30個處理，詳見表1。將消毒好的葉盤接種在附加了不同濃度秋水仙素的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，暗培養(yǎng)7 d后轉(zhuǎn)入光照條件下培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為（29±2）℃，光強約為6 000 lx，光照時間為16 h。每個處理接種 10瓶，每瓶3枚葉盤，每隔3 d觀察1次，記錄葉盤的死亡情況、愈傷組織形成情況及愈傷組織的生長狀態(tài)、顏色等性狀。2個月后，統(tǒng)計愈傷率、死亡率等指標(biāo)。采用SPSS Statistics v19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析。

表1 秋水仙素濃度梯度設(shè)計Table1 Design of colchicine concentration gradient

愈傷率＝(誘導(dǎo)愈傷組織數(shù)/接種葉片總數(shù))×100%；

死亡率＝(褐化材料數(shù)/接種葉片總數(shù))×100%。

1.4 愈傷組織倍性的測定

以二倍體博白大果油茶[20]作為參照，用Sysmex流式細(xì)胞儀檢測愈傷組織相對DNA含量，電壓設(shè)為422 V。在超凈工作臺上取少量長勢良好、沒有褐化的愈傷組織放入培養(yǎng)皿中，加入400 mL的細(xì)胞解離液，用刀片將愈傷組織切碎，用400目的尼龍網(wǎng)篩過濾至離心管中制成單細(xì)胞懸浮液。在黑暗條件下，加入800 mL的DNA染色液，立即檢測。每次檢驗至少收集4 000個顆粒。

1.5 細(xì)胞核大小的觀察

參照趙云等[21]石蠟切片制作方法，調(diào)整固定到復(fù)水等步驟的處理時間。使用蘇木精-伊紅對染法染色，用2%的愛式蘇木精避光浸泡14 h，洗去浮色后用1%的水溶性伊紅染色20 s左右。用中性樹膠封片，用Olympus BX-51光學(xué)顯微鏡觀察細(xì)胞及細(xì)胞核的大小，進(jìn)行顯微照相。

將細(xì)胞和細(xì)胞核均看作球形進(jìn)行核質(zhì)比的計算，其計算公式為：

NP＝VN/(Vc－VN)。

式中，NP為核質(zhì)比，VN為核的體積，Vc為細(xì)胞的體積。

2 結(jié)果與分析

2.1 秋水仙素對葉盤的存活及愈傷組織誘導(dǎo)的影響

接 種 第 2天， 3、6、8、13、16、18、23、26、29號處理組的葉盤均出現(xiàn)了輕微的褐化（圖1A）；接種14 d后，各處理組的葉盤均出現(xiàn)褐化，褐化比較嚴(yán)重的處理組號分別為8、9、10、18、19、20、28、29、30。培養(yǎng)14d 后，2、12、15、17號處理組的葉盤開始變厚，邊緣泛黃，長出少量愈傷組織（圖1B）；培養(yǎng)20 d后，11、12、13、15、17、27號等處理組開始長愈傷組織。培養(yǎng)30 d后，每個處理組均誘導(dǎo)出愈傷組織；“混培法”對油茶多倍體細(xì)胞誘導(dǎo)的影響情況如表2所示。整體而言，愈傷組織的生長狀況均一般，生長速度快的卻褐化嚴(yán)重，生長速度慢的而其愈傷組織量低。以秋水仙素處理30 d的愈傷組織其生長狀況比處理10與20 d的明顯差一些。從顏色上來說，當(dāng)秋水仙素的濃度為20～80 mg·L-1時，處理20 d后誘導(dǎo)出來的愈傷組織長勢最好，顏色呈現(xiàn)綠色或者黃綠色，長速較快（圖1C）。從愈傷組織生長的量來說，以秋水仙素處理20 d的處理組要多于處理時間分別為10、30 d的處理組。

圖1 愈傷組織誘導(dǎo)情況Fig.1 Callus induction status

一般認(rèn)為，秋水仙素對外植體有毒害作用，會使外植體存活率隨著秋水仙素濃度的增高而降低。從表2中可以看出， 1、2、3、11、12、21、22號處理組的死亡率均相對較低，且組間無顯著差異； 1、2、3、4、11、12、21號處理組的愈傷率均相對較高，且組間無顯著差異。這一結(jié)果說明，在較低濃度的秋水仙素處理下，處理時間的長短對葉盤的死亡率、愈傷率的影響均不大；而較高濃度秋水仙素處理組的數(shù)據(jù)顯示，雖然處理時間長短不同，死亡率無顯著差異，但是愈傷率存在差異。當(dāng)秋水仙素濃度達(dá)到200 mg·L-1時，無論處理時間長或短，葉盤的死亡率均較高，而愈傷率均較低，當(dāng)處理天數(shù)為30 d時，愈傷率約為0。低濃度處理組和高濃度處理組之間，無論死亡率還是愈傷率均存在顯著差異，且均呈現(xiàn)出隨著處理濃度增高，死亡率逐漸增加，愈傷率逐漸減少的規(guī)律。

對表2數(shù)據(jù)進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果如表3所示。由表3可知，死亡率與處理時間長度、秋水仙素濃度間均呈極顯著正相關(guān)，其相關(guān)系數(shù)分別為0.445和0.598；愈傷率與處理時間長度、秋水仙素濃度間均呈極顯著負(fù)相關(guān)，其相關(guān)系數(shù)分別為-0.379和-0.666；其中，處理濃度與愈傷率的相關(guān)性最高。

表2 “混培法”對油茶多倍體細(xì)胞誘導(dǎo)的影響?Table2 Influence of mixed tissue culture on inducing polyploid cells in C. oleifera %

表3 不同處理下葉盤培養(yǎng)結(jié)果的相關(guān)性分析結(jié)果?Table3 Correlation analysis of different treatments on leaf disc culture

2.2 秋水仙素處理對愈傷組織相對DNA含量及其細(xì)胞核大小的影響

參比二倍體油茶‘博白大果’的相對DNA含量，根據(jù)未添加秋水仙素的1、11、21號對照組的愈傷組織相對DNA含量，計算出的‘華碩’愈傷組織相對DNA含量均值是348.92。以此為參照，求出各處理組愈傷組織相對DNA含量與對照組相對DNA含量之間的比值，即為倍數(shù)，計算結(jié)果如表4所示。從表4中可以看出，各處理組的倍數(shù)都大于1.0，愈傷組織相對DNA含量均有所增加，說明各處理組都有多倍體細(xì)胞產(chǎn)生。倍數(shù)在2.0左右的處理組包括4、8、9、13、14、15、16、25號。

表4 愈傷組織細(xì)胞相對DNA含量及核質(zhì)比?Table4 Relative DNA contents and nuclear-cytoplasmic ratios in callus cells

根據(jù)愈傷組織切片分析不同處理組的細(xì)胞核質(zhì)比（見表4），在此基礎(chǔ)上統(tǒng)計了不同倍數(shù)的核質(zhì)比均值，結(jié)果如表5所示。倍數(shù)為1.0的愈傷組織細(xì)胞核質(zhì)比為（0.098±0.036），其相對DNA含量為348.05（如圖2 A1和B1所示）；倍數(shù)為2.0的愈傷組織細(xì)胞核質(zhì)比為（0.130±0.023），其相對DNA含量為677.33（如圖2 A2和B2所示），比倍數(shù)為1.0的要大，細(xì)胞相對DNA含量增多，其相應(yīng)的核質(zhì)比也會增大。Pearson相關(guān)性分析結(jié)果顯示，倍數(shù)與核質(zhì)比之間的相關(guān)系數(shù)為0.441，表示兩者在P＜0.05水平上呈顯著正相關(guān)，即核質(zhì)比隨著相對DNA含量的增多而增大。

培養(yǎng)相同天數(shù)后，只有13與22號處理組的愈傷組織有分生細(xì)胞團（分別如圖3A和B所示）出現(xiàn)。根據(jù)袁德義[22]油茶葉片組織培養(yǎng)試驗結(jié)果可知：不是所有形態(tài)的愈傷組織都能分化成芽，而是一定形態(tài)、一定結(jié)構(gòu)的愈傷組織在適宜的培養(yǎng)條件下才能分化成芽。處理組13與22號的愈傷組織生長速度相對來說較快些，均呈黃綠色，有少量白色突起。

表5 不同倍數(shù)的核質(zhì)比均值Table5 Mean values of nuclear-cytoplasmic ratios of different multiples

圖2 愈傷組織的石蠟切片及相對DNA含量Fig.2 Paraff i n sections and relative DNA contents of calluses

圖3 處理組13與22號的愈傷組織分生區(qū)和分生細(xì)胞團Fig.3 Callus meristematic zones and meristematic cells of the treatment group No.13 and No.22

3 結(jié)論與討論

油茶是我國重要的木本食用油料樹種，通過倍性育種可快速創(chuàng)新種質(zhì)資源，培育高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)品種。秋水仙素誘導(dǎo)是目前最常用的方法，可采用以其溶液浸泡種子、點滴處理生長點或者結(jié)合組織培養(yǎng)等方法[23]。本研究采用添加秋水仙素的植物組織培養(yǎng)混培法進(jìn)行培養(yǎng)，研究結(jié)果表明，低濃度秋水仙素處理對油茶葉片離體培養(yǎng)的副作用相對較小，致死率低，同時能獲得相當(dāng)數(shù)量的多倍體細(xì)胞；但是，高濃度的秋水仙素處理會嚴(yán)重影響外植體的活性，導(dǎo)致葉盤或愈傷組織褐化死亡，隨著秋水仙素濃度的升高和處理時間的延長，葉盤的死亡率逐漸升高，愈傷率逐漸降低。這與張靜靜[24]和劉麗[25]的研究結(jié)果一致。

本研究結(jié)果表明，以不同濃度秋水仙素處理油茶葉盤，均能誘導(dǎo)多倍體細(xì)胞的產(chǎn)生，其中以40 mg·L-1的秋水仙素處理 20 d 和以 20 mg·L-1的秋水仙素處理30 d培養(yǎng)獲得的油茶愈傷組織細(xì)胞相對DNA含量的倍數(shù)均在2.0以上，而且在顯微鏡下均能觀察到細(xì)胞分生團，但后期是否能分化出多倍體植株還有待進(jìn)一步觀察。此外，本研究結(jié)果產(chǎn)生了多種倍數(shù)的相對DNA含量的愈傷組織，說明愈傷組織的倍性是不穩(wěn)定的。其原因可能是，在愈傷組織的誘導(dǎo)和增殖過程中，不同倍性的細(xì)胞相互融合；在愈傷組織的生長過程中，染色體發(fā)生變異等。其原因也有可能是，切取的材料正好是分裂旺盛的部位，導(dǎo)致倍數(shù)偏高等。

目前，關(guān)于油茶多倍體育種僅見于李鐵柱[16,26]和包梅榮[27]的相關(guān)報道，他們采用的材料分別是種子和實生苗，以浸泡法和點滴處理生長點的方法誘導(dǎo)多倍體植株，雖然獲得了幾株變異株，但是種子和實生苗個體之間本身存在較大差異，這就影響了研究結(jié)果的科學(xué)性。本研究采用同株系當(dāng)年生嫩葉為材料，保證了材料基因型的一致，但是，油茶葉片離體快繁技術(shù)瓶頸尚未攻克，迄今尚未見有培育出完整植株并且存活的報道[22,28]。本研究中有2個處理組的愈傷組織可觀察到分生細(xì)胞團，但是，培養(yǎng)了90 d左右仍未見有芽分化出。后續(xù)研究將在此基礎(chǔ)上繼續(xù)探索油茶葉片愈傷組織多倍體分生團出芽成苗的培養(yǎng)體系，從而為后期快速得到多倍體油茶奠定基礎(chǔ)。

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