周廣振 ，欒林莉 ，宋玉鳳 ，吳友根 ，胡新文 ，何朝族 ，陳健妙

（海南大學(xué)a.熱帶農(nóng)林學(xué)院；b.海南省熱帶生物資源可持續(xù)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室海南，海南 ?？?570228）

油茶Camellia oleifera Abel.又名茶子樹、油茶樹，為常綠小喬木或灌木，分布于我國(guó)海南、福建、湖南、江西、廣西等省區(qū)，與油橄欖、油棕、椰子并稱為世界四大木本油料植物，是我國(guó)得天獨(dú)厚的植物資源，茶油具有“東方橄欖油”之美稱[1]。油茶也是海南省傳統(tǒng)的油料經(jīng)濟(jì)作物，充分利用海南油茶資源和生態(tài)優(yōu)勢(shì)，發(fā)展具有地方特色的茶籽油及其副產(chǎn)品，將進(jìn)一步促進(jìn)海南省農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)調(diào)整和農(nóng)民增收，還可以改善油茶適種市縣的生態(tài)環(huán)境，為海南省打造國(guó)際旅游島而錦上添花[2-3]。近年來，我國(guó)食用油供需矛盾突出，而油茶作為我國(guó)特有的木本油料作物其產(chǎn)業(yè)經(jīng)濟(jì)效益差、產(chǎn)量低等問題明顯[4-5]。將其他省區(qū)的油茶良種引種到海南地區(qū)種植，普遍存在生長(zhǎng)適應(yīng)性差、生長(zhǎng)慢、難開花或坐果率低等問題。因此，生產(chǎn)、種植適合海南本地土壤和氣候條件的良種壯苗是促進(jìn)海南油茶產(chǎn)業(yè)健康可持續(xù)發(fā)展的關(guān)鍵。

各油茶適種省區(qū)的生產(chǎn)實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)證明，油茶雜交難度大，成功率低，品種改良難度極大[6]。芽苗砧嫁接是已經(jīng)被生產(chǎn)實(shí)踐證明了的成熟度非常高的無性繁殖技術(shù)，而目前適合海南土壤、氣候條件的本地芽苗砧嫁接油茶良種壯苗，因?yàn)榻铀胗邢?，?dǎo)致芽苗砧嫁接苗極其匱乏[5]。組織培養(yǎng)作為植物無性繁殖的方式之一，被廣泛應(yīng)用于各種經(jīng)濟(jì)作物的良種繁育之中。油茶通過以不同器官、組織和細(xì)胞培養(yǎng)，經(jīng)器官發(fā)生途徑產(chǎn)生的叢芽可作為嫁接接穗用苗，而通過體細(xì)胞胚發(fā)生途徑形成的再生植株，具有主根，可直接用作栽培用苗[7-8]。以本地優(yōu)良品系為外植體母株，通過兩種途徑繁育組培苗，是解決海南省油茶良種苗匱乏的有效途徑。目前，國(guó)內(nèi)外陸續(xù)有不同產(chǎn)區(qū)油茶組織培養(yǎng)的研究報(bào)道，但因地區(qū)土壤氣候不同，所用油茶基本培養(yǎng)基也相差甚遠(yuǎn)；已有成功形成再生植株的油茶再生體系多數(shù)以成熟和未成熟子葉作為外植體[9]的研究報(bào)道，而以油茶花藥作為外植體，僅限于愈傷組織的誘導(dǎo)，鮮見有再生植株成功培育的報(bào)道，而海南白花油茶組培方面的報(bào)道更為鮮見。為了拓展海南白花油茶的再生體系和完善國(guó)內(nèi)外油茶花藥誘導(dǎo)再生體系，本實(shí)驗(yàn)以海南白花油茶未開放花蕾為外植體，建立了油茶花藥體細(xì)胞胚植株再生體系，探討了影響油茶花藥再生體系的關(guān)鍵因子，旨在加快海南省油茶品種改良進(jìn)程、生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)組培苗供應(yīng)當(dāng)下緊缺的油茶良種壯苗以及建立高效穩(wěn)定的油茶再生體系，為今后有關(guān)油茶功能基因等方面的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

花藥外植體材料于2015年1月采自海南大學(xué)與瓊海市市校合作項(xiàng)目“瓊海油茶高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)配套栽培關(guān)鍵技術(shù)研究與示范”的油茶高產(chǎn)栽培技術(shù)實(shí)驗(yàn)基地（海南省瓊海市陽江鎮(zhèn)盧家村）所選育的油茶高產(chǎn)單株。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 花粉發(fā)育時(shí)期與花蕾外部形態(tài)的對(duì)應(yīng)觀測(cè)

于晴天上午8:00—9:00時(shí)，選摘未開放的海南白花油茶花蕾，及時(shí)放進(jìn)冰盒帶回實(shí)驗(yàn)室。根據(jù)橫徑大小將花蕾分為4組（i、ii、iii和iv），觀察并記錄4組花蕾的外觀形態(tài)特征，用游標(biāo)卡尺測(cè)量花蕾的縱徑（cm）和橫徑（cm），計(jì)算縱橫徑的比值（縱橫徑之比＝縱徑長(zhǎng)度/橫徑長(zhǎng)度），然后撕開花瓣，觀察花蕾中花藥的生長(zhǎng)發(fā)育狀態(tài)，記錄花藥、花絲的形態(tài)和顏色等生物學(xué)特征。每處理3次重復(fù)，取平均值。

將4組油茶花蕾分別用卡諾固定液（純酒精∶冰醋酸∶氯仿＝6∶1∶3）固定24 h，然后剝?nèi)〔煌ɡ俚幕ㄋ?，將花粉輕輕擠壓在載玻片上，滴1滴改良苯酚品紅染色液，去除雜質(zhì)，蓋上蓋玻片，2～3 min后，用體視顯微鏡觀察，數(shù)取視野中處于單核早期、單核靠邊期、雙核期等不同發(fā)育階段的花粉數(shù)目。結(jié)合花蕾外觀形態(tài)特征及其縱徑、橫徑和縱橫徑之比，對(duì)比分析以確定海南白花油茶花蕾的外部形態(tài)與花粉發(fā)育時(shí)期的對(duì)應(yīng)關(guān)系，作為日后花藥外植體選材的外觀依據(jù)。

1.2.2 接種方法、培養(yǎng)方式和培養(yǎng)基種類

取出花蕾，先用低濃度的洗潔精浸泡20 min，然后用自來水沖洗干凈，并用吸水紙吸干水分。在超凈工作臺(tái)上，將花蕾置于無菌燒杯中，用70%的酒精浸泡45 s，用無菌水沖洗1次，然后用0.1%的HgCl2表面消毒14 min，以無菌水沖洗6次。表面消毒完畢后，用解剖刀和鑷子剝?nèi)ネ鈱踊ㄝ?，取下花藥（切除花絲），平鋪接種在胚性愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上。每皿接種不少于25?；ㄋ?，每處理3次重復(fù)。然后置于培養(yǎng)室內(nèi)進(jìn)行暗培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為（27±2）℃。每隔15 d轉(zhuǎn)接1次，待愈傷組織誘導(dǎo)出來后，統(tǒng)計(jì)愈傷組織誘導(dǎo)率（%），繼續(xù)按時(shí)進(jìn)行繼代培養(yǎng)，并統(tǒng)計(jì)愈傷組織生長(zhǎng)速率（g·d-1），培養(yǎng)50 d后，根據(jù)愈傷組織的生長(zhǎng)形態(tài)，篩選出類胚性愈傷組織。將類胚性愈傷組織繼續(xù)轉(zhuǎn)接到體細(xì)胞胚分化誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，誘導(dǎo)出體細(xì)胞胚，再轉(zhuǎn)接至體細(xì)胞胚成熟和萌發(fā)培養(yǎng)基上，形成花藥體細(xì)胞胚再生植株。

初代愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基用如下2種：I號(hào)為改良MS（大量元素減至2/3）＋NAA1mg·L-1＋Kt1mg·L-1＋ 5% 椰汁＋蔗糖 30 g·L-1＋瓊脂7g·L-1，其pH值為5.5；II號(hào)為改良MS（大量元素減至2/3）＋ 2,4-D2mg·L-1＋ Kt 0.5 mg·L-1＋ 5% 椰汁＋蔗糖 30 g·L-1＋瓊脂7g·L-1，其 pH 值亦為 5.5。

胚性愈傷組織增殖與再分化的培養(yǎng)基為：改良MS（大量元素減至1/2）＋NAA 0.5 mg·L-1＋6-BA2mg·L-1＋ Zt1mg·L-1＋ 10% 椰汁 ＋蔗糖30 g·L-1＋瓊脂7g·L-1，其 pH 值為 5.5。

體細(xì)胞胚成熟和植株再生的培養(yǎng)基為：改良MS（大量元素減至1/2）＋NAA 0.1 mg·L-1＋6-BA 0.5 mg·L-1＋ 0.1% 活性炭＋蔗糖 30 g·L-1＋瓊脂7g·L-1，其 pH 值為 5.5。

1.2.3 愈傷組織誘導(dǎo)率的統(tǒng)計(jì)

培養(yǎng)30 d后統(tǒng)計(jì)愈傷組織誘導(dǎo)率，每個(gè)處理3次重復(fù)，取平均值。

愈傷組織誘導(dǎo)率(%)＝(誘導(dǎo)出愈傷組織的花藥數(shù)目/接種總花藥數(shù)目)×100%。

1.2.4 愈傷組織增殖生長(zhǎng)和再分化狀態(tài)的觀測(cè)

稱取一定重量的新鮮愈傷組織接種到新鮮培養(yǎng)基上，繼代培養(yǎng)20 d后，稱取總愈傷組織鮮質(zhì)量，計(jì)算其生長(zhǎng)速率，每個(gè)處理3次重復(fù)，取平均值。

生長(zhǎng)速率(g·d-1)＝(培養(yǎng)第20天的胚性愈傷組織質(zhì)量－原接種愈傷組織的質(zhì)量)/20。

觀測(cè)誘導(dǎo)分化過程中胚性愈傷組織的形態(tài)學(xué)參數(shù)，即清晰可見的原胚組織（calli bearing clearly visible proembryos，EC）、褐色或壞死性愈傷組織（brown or necrotic calli，BC）和松碎的愈傷組織（friable calli，F(xiàn)C），以百分比統(tǒng)計(jì)，每個(gè)處理3次重復(fù)，取平均值。

1.2.5 體細(xì)胞胚的成熟和植株的再生

挑取暗培養(yǎng)條件下肉眼可見的已分化出球形胚狀體的胚性愈傷組織，將之接種到體胚成熟誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，光照培養(yǎng)，等誘導(dǎo)出胚根和胚芽時(shí)，再轉(zhuǎn)接到植株再生培養(yǎng)基（與體細(xì)胞胚成熟基本培養(yǎng)相同，未添加激素）上，光照強(qiáng)度約2 000 lx，每天光照培養(yǎng)12 h。

1.2.6 花藥再生植株的移栽

待再生植株長(zhǎng)出2片真葉時(shí)，即可移栽到裝有基質(zhì)（腐殖土∶蛭石＝1∶1）的育苗杯中，培養(yǎng)20 d后統(tǒng)計(jì)移栽成活率。

2 結(jié)果與分析

2.1 海南白花油茶花蕾的外部形態(tài)及其與花粉發(fā)育時(shí)期的對(duì)應(yīng)關(guān)系

對(duì)于多數(shù)植物而言，花粉發(fā)育處于單核靠邊期時(shí)的花藥最容易誘導(dǎo)胚性愈傷組織，且有利于后期體細(xì)胞胚狀體的分化。因此，選擇花蕾作為花藥離體培養(yǎng)的外植體時(shí)，應(yīng)嚴(yán)格掌握花粉粒的發(fā)育時(shí)期，從而提高花藥愈傷組織植株再生的效率。海南白花油茶花蕾的外部形態(tài)及其與花粉發(fā)育時(shí)期的對(duì)應(yīng)關(guān)系如表1所示。由表1 可知，與i組花蕾的橫徑相比，ii、iii和iv組的橫徑分別顯著增加了28.3%、39.8%和62.4%，其中，ii與iii組間無顯著差異；與i組的花蕾縱徑相比，ii、iii和iv組花蕾的縱徑分別顯著增加了10.2%、24.4%和36.9%，組間差異顯著；與i組花蕾的縱、橫徑之比值相比，隨著縱、橫徑的增加，ii、iii和iv組花蕾的縱橫徑之比與i組的均無顯著差異，其相互間也無顯著差異。

表1 海南白花油茶花蕾的外部形態(tài)及其與花粉發(fā)育時(shí)期的對(duì)應(yīng)關(guān)系?Table1 Corresponding relationship between external morphology of flower buds and pollen development phases of C. oleifera in Hainan

花粉不同發(fā)育時(shí)期的花蕾外觀形態(tài)分別如表1和圖1所示。由表1和圖1可知，i組花蕾全萼包被著花瓣，淡黃色的花藥中，花粉發(fā)育以單核居中期為主；ii和iii組的花蕾也是全萼包被著花瓣，花藥發(fā)育變成橘黃色，花粉發(fā)育以單核靠邊期為主；而iv組的花蕾花瓣已露白，花粉發(fā)育以雙核期為主。

2.2 不同初代誘導(dǎo)培養(yǎng)基對(duì)海南白花油茶花藥愈傷組織誘導(dǎo)的影響

圖1 花粉不同發(fā)育時(shí)期不同處理組別花蕾的外觀形態(tài)Fig.1 External appearances of fl ower buds at different development phases of pollens in different treatments

適宜的初代愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基是確保植物花藥誘導(dǎo)出胚性愈傷組織的前提。以海南白花油茶花粉不同發(fā)育時(shí)期的花蕾為外植體，經(jīng)表面消毒后，剝?nèi)』ㄋ幏謩e接種到I和II號(hào)兩種不同初代愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，暗培養(yǎng)第10天時(shí)觀察外植體生長(zhǎng)情況，第40天時(shí)觀察愈傷組織誘導(dǎo)情況，以篩選合適的花藥外植體和初代愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基，觀測(cè)結(jié)果如圖2所示。在兩種初代愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上暗培養(yǎng)第10天時(shí)，iii和ii組花蕾的花藥生長(zhǎng)均較好，其花藥基本保持鮮黃色，褐變較少，花藥均有明顯的脫分化誘導(dǎo)，在I號(hào)培養(yǎng)基上的尤其明顯；而i和iv組花蕾的花藥褐變均較明顯，卻均未見明顯的花藥脫分化誘導(dǎo)。由表2和圖2可知，在I號(hào)初代愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)第40天時(shí)，i組花蕾的花藥愈傷組織誘導(dǎo)率低于10%，與i組花蕾的花藥愈傷組織誘導(dǎo)率相比，iii和ii組花蕾的分別顯著增加約5與7倍，而iv與i組花蕾的花藥愈傷組織誘導(dǎo)率間卻無顯著差異；愈傷組織多呈緊實(shí)、規(guī)則凸球狀的類原胚性愈傷組織。在II號(hào)初代愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)第40天時(shí)，i組花蕾的花藥愈傷組織誘導(dǎo)率約為5.38%，iii和ii組花蕾的花藥愈傷組織誘導(dǎo)率比i組花蕾的分別顯著增加約5與10倍，而iv與i組花蕾的花藥愈傷組織誘導(dǎo)率間卻無顯著差異；但愈傷組織松軟不規(guī)則，呈水漬狀的多，多數(shù)呈現(xiàn)出非胚性愈傷組織。

2.3 不同培養(yǎng)方式對(duì)花藥胚性愈傷組織增殖和再分化的影響

挑取I號(hào)培養(yǎng)基上生長(zhǎng)質(zhì)地緊實(shí)、呈規(guī)則小凸球狀的類原胚性愈傷組織接種至胚性愈傷組織的增殖與再分化培養(yǎng)基上，采取光照與暗培養(yǎng)兩種方式進(jìn)行繼代培養(yǎng)。培養(yǎng)15 d后，觀測(cè)愈傷組織的生長(zhǎng)速率和生長(zhǎng)狀態(tài)，結(jié)果分別如圖3A與B所示。從圖3A中可以看出，暗培養(yǎng)能明顯維持胚性愈傷組織的胚性特性（EC），組織質(zhì)地堅(jiān)實(shí)、松碎（FC）而略帶透明，呈現(xiàn)出明顯的體細(xì)胞胚再分化球形胚狀態(tài)，褐色組織（BC）相對(duì)少。從圖3B中可以看出，光照培養(yǎng)條件下，愈傷組織雖也能生長(zhǎng)，但只有少部分能維持胚性愈傷組織的胚性特性（EC），而大多數(shù)變褐，部分甚至壞死（BC）。經(jīng)測(cè)定，兩種愈傷組織生長(zhǎng)速率間的差異不顯著，其生長(zhǎng)速率分別為0.078和0.056 g·d-1。

2.4 花藥體細(xì)胞胚的萌發(fā)和植株再生狀況

將肉眼可見的具球形體細(xì)胞胚的胚性愈傷組織轉(zhuǎn)接至體細(xì)胞胚成熟誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，繼續(xù)暗培養(yǎng)30 d左右，陸續(xù)看到有球形的體細(xì)胞胚逐漸再分化形成子葉形體細(xì)胞胚（如圖4A所示），隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，胚芽萌發(fā)，胚根伸長(zhǎng)，形成具有主根的花藥體細(xì)胞胚再生植株（如圖4B所示），但體細(xì)胞胚誘導(dǎo)率極低，僅約有8%。把已具主根的體細(xì)胞胚再生植株轉(zhuǎn)接到?jīng)]有激素的植株再生培養(yǎng)基上，培養(yǎng)20 d即可長(zhǎng)成具主根和胚芽的花藥胚性愈傷再生植株（如圖4C所示）。

表2 不同發(fā)育時(shí)期的花藥在不同初代誘導(dǎo)培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)情況Table2 Growth status of anthers at different development phases in different primary induction media

圖2 花粉不同發(fā)育時(shí)期的花藥在不同初代誘導(dǎo)培養(yǎng)基上的誘導(dǎo)生長(zhǎng)情況Fig.2 Growth status of anthers at different development phases in different primary induction media

2.5 花藥再生植株的移栽情況

待油茶花藥體細(xì)胞胚再生植株在培養(yǎng)瓶里長(zhǎng)出展開的新葉后取出再生植株，在慢速流水下沖洗粘在根部的培養(yǎng)基，洗干凈后用吸水紙吸干多余的水分，即時(shí)移栽到裝有腐殖土和蛭石的比例為6∶4的混合基質(zhì)的育苗杯中，澆足定根水，遮陰處理2周后即可看到新芽長(zhǎng)出（如圖4D所示）。本次實(shí)驗(yàn)誘導(dǎo)出一小批花藥再生植株，以蛭石和椰糠（1∶1）的混合物為基質(zhì)，全部移栽成活。

3 討論與結(jié)論

3.1 花藥胚性愈傷組織誘導(dǎo)的合適花蕾外植體的篩選

圖3 不同培養(yǎng)方式對(duì)海南白花油茶花藥愈傷組織增殖和分化的影響Fig.3 Effects of different culture modes on proliferation and differentiation of anther calli of white fl ower C. oleifera in Hainan

圖4 海南白花油茶花藥誘導(dǎo)體細(xì)胞胚形成再生植株Fig.4 Somatic embryogenesis regenerated plants of white fl ower C. oleifera anthers in Hainan

花粉粒所處的發(fā)育時(shí)期對(duì)花藥胚性愈傷組織的誘導(dǎo)起關(guān)鍵作用，很多研究結(jié)果都表明，大多數(shù)植物處于單核期的花粉粒其誘導(dǎo)成功率更高[10-11]，我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果與此相符，ii和iii組花蕾的花粉粒發(fā)育大多處于單核靠邊期，花萼全包裹花瓣，花藥橘黃色，誘導(dǎo)胚性愈傷組織的效果均明顯優(yōu)于i和iv組花蕾的。綜合花蕾的縱徑長(zhǎng)、橫徑長(zhǎng)及縱橫徑之比來看，對(duì)于海南白花油茶而言，其橫徑的長(zhǎng)度（1.19～1.30 cm）與花粉發(fā)育單核靠邊期的對(duì)應(yīng)關(guān)系最近。處此發(fā)育階段的花蕾其花萼全包被花瓣，花粉粒大多數(shù)處于單核靠邊期，小孢子活力大，最利于誘導(dǎo)花藥胚性愈傷組織。聞麗等[12]的研究結(jié)果也表明，在盛花初期所采樣品的愈傷組織誘導(dǎo)率高于盛花末期所采樣品的誘導(dǎo)率。另外，整個(gè)花蕾被花萼包裹得很緊實(shí)，外界環(huán)境中的微生物、昆蟲等也不易進(jìn)入，接種外植體污染率低，這是海南白花油茶適合花藥誘導(dǎo)愈傷組織的合適外植體，可作為外植體采摘的外觀評(píng)價(jià)指標(biāo)。而縱徑間差異顯著、縱橫徑比值間的差別微小，與花粉發(fā)育單核靠邊期的對(duì)應(yīng)關(guān)系不密切，不宜作為外植體采摘的外觀評(píng)價(jià)指標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)研究第1次采摘花蕾分析花粉發(fā)育時(shí)期，經(jīng)驗(yàn)尚不足，下一步的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)可采摘橫徑為0.93～1.19 cm的花蕾，再適當(dāng)細(xì)化其橫徑梯度，以便更加精準(zhǔn)地篩選出海南白花油茶花粉粒處于單核靠邊期的花蕾，從而提高今后實(shí)驗(yàn)研究和栽培生產(chǎn)的效率。

3.2 花藥胚性愈傷組織誘導(dǎo)的合適初代誘導(dǎo)培養(yǎng)基的篩選

胚性愈傷組織是植物體細(xì)胞胚狀體間接發(fā)生的前提。一般胚性愈傷組織質(zhì)地較堅(jiān)實(shí)，顏色為乳白色或黃色，表面具小球形顆粒，細(xì)胞內(nèi)容豐富；而分化能力差的非胚性愈傷組織則與之相反，其組織結(jié)構(gòu)疏松，細(xì)胞相對(duì)巨大，內(nèi)含一大液泡，幾乎無細(xì)胞器，多呈水浸或褐化狀。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，I號(hào)培養(yǎng)基（改良MS＋NAA＋Kt組合）上的愈傷組織誘導(dǎo)率（%）比II號(hào)培養(yǎng)基（改良MS＋2,4-D＋Kt組合）上的略低，但I(xiàn)號(hào)培養(yǎng)基誘導(dǎo)出的愈傷組織呈白色略顯透明發(fā)亮，松碎，具小凸球狀，原胚性愈傷組織特征明顯，容易誘導(dǎo)出體細(xì)胞胚；而II號(hào)培養(yǎng)基誘導(dǎo)出的愈傷組織呈白色略顯暗沉或水漬狀，松軟，不規(guī)則塊狀，不適合誘導(dǎo)體細(xì)胞胚。故選用I號(hào)培養(yǎng)基作為海南白花油茶花藥胚性愈傷的初代誘導(dǎo)培養(yǎng)基較為合適，下一步可通過調(diào)整NAA和Kt的濃度配比來優(yōu)化胚性愈傷組織的誘導(dǎo)培養(yǎng)基，以提高胚性愈傷組織誘導(dǎo)率。丁植磊等的研究結(jié)果表明，以MS或N6培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，添加激素配比如NAA 0.5 mg·L-1＋2,4-D 0.6 mg·L-1或 6-BA 0.2 mg·L-1＋ 2,4-D 0.5 mg·L-1，以適用于白花油茶與紅花油茶等不同物種愈傷組織的誘導(dǎo)[10]，而本研究中以改良MS為基本培養(yǎng)基，添加了NAA＋Kt的組合培養(yǎng)基，誘導(dǎo)出的愈傷組織質(zhì)量更適于體細(xì)胞胚的分化，說明2,4-D并不是油茶花藥愈傷組織誘導(dǎo)所必需的培養(yǎng)基，比較而言，同樣在添加細(xì)胞分裂素類的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑Kt的基礎(chǔ)上，輔以添加生長(zhǎng)素類的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，而添加NAA比添加2,4-D更適用于海南白花油茶愈傷組織的誘導(dǎo)，在后期的增殖培養(yǎng)階段也顯示出了同樣的效果。丁植磊等的研究結(jié)果也表明，油茶花藥愈傷組織增殖過程中，在同樣添加生長(zhǎng)素類生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑物質(zhì)NAA的基礎(chǔ)上，輔以添加如玉米素Zt、6-BA和Kt等細(xì)胞分裂素，均能獲得較好的愈傷組織增殖效果[10]，綜合成本和愈傷組織后期體細(xì)胞胚分化的態(tài)勢(shì)來考慮，NAA＋Kt的組合培養(yǎng)基較有利于體細(xì)胞胚后期的分化和節(jié)約成本。

3.3 花藥胚性愈傷組織體細(xì)胞胚狀體的再分化

胚狀體的誘導(dǎo)與外植體所處的生理狀況、培養(yǎng)方式和內(nèi)源激素的變化及遺傳性、倍性等都有密切關(guān)系。在海南白花油茶花藥愈傷組織增殖和再分化過程中，對(duì)比分析暗培養(yǎng)和光照培養(yǎng)結(jié)果得知，暗培養(yǎng)和光照培養(yǎng)的生長(zhǎng)量相差不大，但暗培養(yǎng)能使原胚性愈傷組織有效增殖且能再分化出體細(xì)胞胚（再分化率極低，尚待進(jìn)一步優(yōu)化篩選培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件），而光照培養(yǎng)條件下，花藥愈傷組織早期有綠色芽點(diǎn)突顯，但后期原胚性組織逐漸老化褐死，再生植株分化難。丁植磊等的研究結(jié)果表明，油茶花藥愈傷組織暗培養(yǎng)5～10 d即可改善愈傷組織繼代增殖的生長(zhǎng)狀況，以葉片作為外植體誘導(dǎo)出的愈傷組織，在光照條件下，前期嫩綠、致密的愈傷組織能正常增殖，但隨著繼代培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，愈傷組織會(huì)褐死，也不能分化出體細(xì)胞胚狀體[10]，故油茶花藥愈傷組織的增殖與再分化宜在暗培養(yǎng)條件下誘導(dǎo)。因此，下一步的研究可以采用暗培養(yǎng)的培養(yǎng)方式，對(duì)I號(hào)培養(yǎng)基中所含激素的種類和配比進(jìn)行調(diào)整，以篩選與優(yōu)化添加輔助有機(jī)物的種類，以提高原胚組織的增殖和再分化效率，促進(jìn)油茶花藥再生植株的生長(zhǎng)。

據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，在大多數(shù)植物的花藥培養(yǎng)中，給予一定溫度和時(shí)間的低溫預(yù)處理是必要的，低溫處理對(duì)于雄核發(fā)育的影響涉及到花藥內(nèi)部一系列復(fù)雜結(jié)構(gòu)及生理生化的變化[13-14]。低溫可以改變紡錘絲的軸向，破壞紡錘絲的微管蛋白，從而阻止紡錘絲的形成，使有絲分裂的正常過程被打破，從而導(dǎo)致分化過程的發(fā)生[15]。雖然本次研究設(shè)置的各處理都能誘導(dǎo)出海南白花油茶的花藥愈傷組織，但誘導(dǎo)率都還不夠高，尤其是再分化率太低。據(jù)有關(guān)油茶花藥再生體系的研究報(bào)道，國(guó)內(nèi)油茶以花藥為外植體，目前以花藥愈傷組織的誘導(dǎo)和增殖為主[10,12]，鮮有形成植株的報(bào)道，油茶再生植株形成，目前多數(shù)仍以嫩莖段、葉片和子葉為外植體[9]，其中，以嫩莖段為外植體形成的再生植株，可以很好地保持外植體母株的優(yōu)良性狀，屬自根植株，但誘導(dǎo)生根屬于不定根，所育種苗類似于扦插苗。國(guó)家林業(yè)局在油茶種苗培育規(guī)定中明確規(guī)定，禁止使用不定根苗造林，故此類植株更適合作為油茶采穗圃種植供苗，比較而言，其優(yōu)于遺傳相對(duì)不穩(wěn)定的葉片誘導(dǎo)再生植株。以子葉作為外植體的體細(xì)胞胚植株或不定芽植株，雖然相對(duì)容易誘導(dǎo)出體細(xì)胞胚植株，但由于子葉已屬有性繁殖產(chǎn)物，即使能生產(chǎn)出再生植株，種苗性質(zhì)也類似于以種子繁育的實(shí)生苗，外植體母株的優(yōu)良性狀因性狀分離會(huì)造成遺傳不穩(wěn)定，故以葉片、子葉為外植體形成的再生體系，更適合作為油茶遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)體系。而以未授粉花藥為外植體，通過誘導(dǎo)花藥胚性愈傷組織體細(xì)胞胚胎發(fā)生途徑所形成的再生植株，是由體細(xì)胞誘導(dǎo)出的具有胚芽和強(qiáng)壯主根的體細(xì)胞胚再生植株，可以穩(wěn)定遺傳外植體母株的優(yōu)良性狀，又具有強(qiáng)壯主根，省略了當(dāng)前油茶良種壯苗為了擁有強(qiáng)壯的主根而采取的嫁接環(huán)節(jié)，可以節(jié)省更多的人力、物力和財(cái)力。故下一步的研究應(yīng)對(duì)海南白花油茶花藥再生體系進(jìn)行優(yōu)化改良，以期早日建立高效、穩(wěn)定的油花花藥再生體系，為今后利用花藥體細(xì)胞胚再生體系生產(chǎn)良種壯苗，建立高效、穩(wěn)定的海南白花油茶遺傳轉(zhuǎn)化體系，從而為后期的油茶功能基因研究和利用基因工程技術(shù)加速油茶抗病、高產(chǎn)育種而奠定基礎(chǔ)。

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