吉晟男， 肖能文， 鄧懷慶， 胡德夫

(1. 中國環(huán)境科學(xué)研究院生物多樣性研究中心，北京100012； 2. 貴州師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，貴陽550001；3.北京林業(yè)大學(xué)自然保護(hù)區(qū)學(xué)院，北京100083)

高溫通常被認(rèn)為是一種不利的脅迫因子，會(huì)影響動(dòng)物的生存活動(dòng)(Farooqetal.，2010)。高溫應(yīng)激會(huì)影響反芻動(dòng)物的生長和繁殖(La Sallesetal.，2017)。溫度變化在動(dòng)物的耐受范圍內(nèi)時(shí)，動(dòng)物可通過自身生理或行為的改變進(jìn)行體溫調(diào)節(jié)，以適應(yīng)不良的生活環(huán)境(Bernabuccietal.，2010)；當(dāng)溫度變化超過了動(dòng)物的耐受范圍，動(dòng)物生理或免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)失常，嚴(yán)重的或死亡(Serbesteretal.，2005；Bohmanova，2006)。已有的高溫應(yīng)激研究主要在經(jīng)濟(jì)動(dòng)物中，如綿羊Ovisaries、奶牛Bostaurus等(何世山，金小軍，2003；Renaudeauetal.，2008；Serbesteretal.，2012)；對(duì)野生動(dòng)物的研究，僅見夏季高溫條件下生理狀況的簡(jiǎn)單描述(Huberetal.，2003；Gesquiereetal.，2008)。

激素調(diào)節(jié)在動(dòng)物應(yīng)對(duì)高溫時(shí)起著非常重要的作用，尤其是糖皮質(zhì)激素和三碘甲腺原氨酸(T3)(Maraietal.，2007；Renaudeauetal.，2008)。短期應(yīng)激對(duì)動(dòng)物有利，但長期的激素應(yīng)激可能會(huì)損害動(dòng)物的健康(Sapolsky，1998)。目前可以通過測(cè)定糖皮質(zhì)激素和T3各自的代謝產(chǎn)物在血液、唾液和身體排泄物(如糞便)中的含量來判斷動(dòng)物的應(yīng)激狀況(Renaudeauetal.，2008)。在血液和唾液的采集過程中，對(duì)動(dòng)物重復(fù)的捕捉和保定不可避免(Millspaugh & Washburn，2004)，對(duì)大型哺乳動(dòng)物和瀕危物種而言難度較大。糞便相對(duì)容易采集且不會(huì)過度干預(yù)動(dòng)物的行為，研究者可在遠(yuǎn)處觀察目標(biāo)動(dòng)物，待其排便離開后再采集。這種非損傷性取樣方法在野生動(dòng)物研究中已得到了廣泛應(yīng)用(Creeletal.，2002；Keechetal.，2010；Dengetal.，2014)。

普氏野馬Equusprezwalskii是世界上僅存的野生馬種類，其野生種群在20世紀(jì)中期于中國和蒙古野外滅絕(Mohr，1971)，但其圈養(yǎng)種群使得這一物種得到保存(Ryder，1994)。在國際保護(hù)組織的努力下，普氏野馬圈養(yǎng)種群獲得了充足的發(fā)展，并嘗試放歸實(shí)驗(yàn)以恢復(fù)野生種群(Ryder & Wedermeyer，1982)。中國于1985年在新疆維吾爾自治區(qū)籌建了第一個(gè)普氏野馬繁育中心，分別在德國和英國進(jìn)行引種培育，由于該地歷史上曾經(jīng)有野生種群分布，環(huán)境條件適宜，新疆普氏野馬繁育中心在社會(huì)和政府的共同努力下，圈養(yǎng)種群繁育狀況良好，種群數(shù)量不斷擴(kuò)大，并成功放歸。新疆普氏野馬繁育中心位于中國西北部，冬寒夏熱，四季分明，最熱月(7月)氣溫可達(dá)50 ℃(陳金良，2008)。普氏野馬不可避免受到夏季高溫的影響，在此極端條件下，普氏野馬會(huì)產(chǎn)生怎樣的生理應(yīng)答未見報(bào)道。高溫對(duì)圈養(yǎng)普氏野馬生理和行為產(chǎn)生的應(yīng)激反應(yīng)可能會(huì)影響其管護(hù)工作。鑒于此，本研究利用非損傷性取樣法對(duì)普氏野馬夏季高溫刺激的生理應(yīng)答進(jìn)行了監(jiān)測(cè)，以期為科學(xué)的保護(hù)管理提供基礎(chǔ)資料。

1 研究方法

1.1 研究對(duì)象

選擇新疆普氏野馬繁育中心(89°14′～89°36′E，45°49′～46°04′N)5個(gè)家族群中的15匹成年個(gè)體，分為雄馬、雌馬和帶駒雌馬3組，每組5匹(表1)。研究時(shí)間為2011年7月4日—8月3日。采用隔日取樣法收集目標(biāo)個(gè)體的糞便樣品，如果遇到極端高溫，則每天持續(xù)采樣，待高溫天氣結(jié)束后3～4 d，恢復(fù)隔日取樣法。為排除激素代謝產(chǎn)物水平的時(shí)間差異，所有待測(cè)樣品均于同一時(shí)間段(08∶00—10∶00)采集。在整個(gè)取樣期間，不改變普氏野馬的飼喂方式。

表1 實(shí)驗(yàn)個(gè)體組別及年齡Table 1 Information of captive Equus prezwalskiiin the experiment

1.2 溫濕度指數(shù)

在飼養(yǎng)場(chǎng)中1.5 m處懸掛干濕溫度計(jì)，從08∶00開始，每隔1 h記錄一次溫濕度。利用每天最高溫度和最低相對(duì)濕度計(jì)算溫濕度指數(shù)(temperature-humidity index，THI)：

THI=db-[(0.31-0.31RH)(db-14.4)]

其中，db為溫度(℃)，RH為相對(duì)濕度(%)。當(dāng)THI>28.9時(shí)，動(dòng)物為高溫應(yīng)激狀態(tài)(LPHSI，1990；Maraietal.，2001)。

1.3 樣品采集及檢測(cè)

跟蹤觀察目標(biāo)個(gè)體，待其排便離開后，用一次性塑料手套收集糞樣上層新鮮部分，混合后用塑料自封袋保存，在袋上標(biāo)記采集時(shí)間及個(gè)體，帶回基地后放于-20 ℃的冰箱內(nèi)保存待測(cè)(Cavigelli，1999；Curtisetal.，2000)。

樣品激素測(cè)定參照M?stl等(1999)和Galama等(2004)的方法并略作改進(jìn)。首先解凍樣品，然后取濕糞10 g進(jìn)行冷凍干燥，取0.5 g干燥樣品粉碎后放于10 mL 80%甲醇中萃取，離心后取上清液，同時(shí)對(duì)剩余沉淀物進(jìn)行二次萃取，離心后取上清液。合并2次收集的上清液進(jìn)行水浴蒸干，用1 mL 80%甲醇溶解剩余固體并于-20 ℃保存。

采用放射性免疫法測(cè)定激素代謝產(chǎn)物水平。皮質(zhì)醇及T3試劑盒(北京北方生物所)主要技術(shù)參數(shù)見表2。N-682型放射性免疫γ光子計(jì)數(shù)器(上海核福光電儀器有限公司)測(cè)定激素代謝產(chǎn)物水平，測(cè)定結(jié)果換算成單位干糞的激素水平(ng·g-1)。普氏野馬糞便激素水平平均具有24 h的延遲(曹婷婷，2008)，數(shù)據(jù)分析時(shí)，當(dāng)日糞便激素水平對(duì)應(yīng)為前日采集日期。

表2 試劑盒主要技術(shù)參數(shù)Table 2 Technical parameters of the kits

1.4 數(shù)據(jù)檢驗(yàn)

運(yùn)用SPSS 23.0(SPSS Inc.，Chicago，USA)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。THI作為分類變量(THI>28.9為高溫應(yīng)激；THI≤28.9為非高溫應(yīng)激)，整合不同類群普氏野馬的糖皮質(zhì)激素代謝產(chǎn)物(fecal glucocorticoid metabolites，F(xiàn)GM)水平與T3代謝產(chǎn)物水平，同一類群當(dāng)日糞便激素取均值對(duì)應(yīng)前一天的THI。對(duì)比同一類群高溫與非高溫應(yīng)激狀態(tài)下的激素差異，以及不同類群間激素水平差異。使用One Sample Kolmogorov-Smirnov Test對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)分布檢驗(yàn)，多因變量一般線性模型(Multivariate tests of general linear model)做多因素方差分析，組別和應(yīng)激程度作為固定因子，組間多重比較采用LSD，對(duì)比前檢驗(yàn)數(shù)據(jù)方差齊性。數(shù)據(jù)結(jié)果以Mean±SE表示，P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 夏季普氏野馬總體激素水平

繁育中心夏季炎熱干旱，夏季每日最高溫度和最低相對(duì)濕度幾乎同時(shí)出現(xiàn)，一般出現(xiàn)在每日的13∶00—18∶00，持續(xù)時(shí)間相對(duì)較長(圖1)。在整個(gè)夏季高溫期，普氏野馬都維持在一個(gè)較高的激素水平，F(xiàn)GM水平為161.30～237.19 ng·g-1，T3代謝產(chǎn)物水平為11.64～17.65 ng·g-1。

2.2 夏季高溫期普氏野馬FGM水平

圈養(yǎng)普氏野馬在夏季高溫期不同類群的FGM水平具有明顯差異(圖2)，雄馬組水平最高，為237.19 ng·g-1±10.24 ng·g-1；雌馬組水平居中，為208.34 ng·g-1±6.39 ng·g-1；帶駒雌馬組水平最低，僅為161.30 ng·g-1±5.01 ng·g-1。對(duì)3個(gè)不同類群的FGM水平進(jìn)行多因素方差分析，結(jié)果表明，3組間的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F2， 60=22.885，P<0.001)，具體為：雄馬vs.雌馬(MD=28.855，SE=11.163，P=0.012)、雄馬vs.帶駒雌馬(MD=75.899，SE=11.163，P<0.001)、雌馬vs.帶駒雌馬(MD=47.045，SE=11.163，P<0.001)。此外，以THI=28.9為界，將普氏野馬各組組內(nèi)高溫應(yīng)激與非高溫應(yīng)激的FGM水平進(jìn)行對(duì)比，多因素方差分析結(jié)果顯示，3組組內(nèi)不同應(yīng)激程度的FGM水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F1， 60=0.233，P=0.631)，且組別與應(yīng)激程度不存在交互作用(F2， 60=0.024，P=0.976)。

圖1 夏季高溫期日最高溫度、最低相對(duì)濕度及溫濕度指數(shù)Fig. 1 Daily maximum temperature， minimal relative humidity and temperature-humidity index during high temperature periods in summer

圖2 圈養(yǎng)普氏野馬不同類群夏季高溫期糞便糖皮質(zhì)激素代謝產(chǎn)物水平Fig.2 Fecal glucocorticoid metabolites of Equus przewalskii in different groups during high temperature periods in summer

2.3 夏季高溫期普氏野馬T3代謝產(chǎn)物水平

圈養(yǎng)普氏野馬不同類群在夏季高溫期間T3代謝產(chǎn)物水平具有明顯差異(圖3)，雌馬組水平最高，為17.65 ng·g-1±0.59 ng·g-1，雄馬組居中，為14.76 ng·g-1±0.43 ng·g-1，帶駒雌馬組最低，僅為11.64 ng·g-1±0.33 ng·g-1。對(duì)3個(gè)不同類群的T3代謝產(chǎn)物水平進(jìn)行多因素方差分析，結(jié)果表明，3組間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F2， 60=37.780，P<0.001)，具體為：雄馬vs.雌馬(MD=-2.891，SE=0.662，P<0.001)、雄馬vs.帶駒雌馬(MD=3.120，SE=0.662，P<0.001)、雌馬vs.帶駒雌馬(MD=6.011，SE=0.662，P<0.001)。此外，以THI=28.9為界，將普氏野馬各組組內(nèi)高溫應(yīng)激與非高溫應(yīng)激的T3代謝產(chǎn)物水平進(jìn)行對(duì)比，多因素方差分析結(jié)果顯示，3組組內(nèi)不同應(yīng)激程度的T3代謝產(chǎn)物水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F1， 60=0.333，P=0.566)，且組別與應(yīng)激程度不存在交互作用(F2， 60=2.260，P=0.113)。

圖3 圈養(yǎng)普氏野馬不同類群夏季高溫期三碘甲腺原氨酸代謝產(chǎn)物水平
Fig.3 Fecal thyroid triiodothyronine metabolites ofEquusprzewalskiiin different groups during high temperature periods in summer

3 討論

極端溫度會(huì)影響動(dòng)物生理狀況，動(dòng)物亦可通過自身生理調(diào)節(jié)以適應(yīng)不良生活環(huán)境(Bernabuccietal.，2010)。新疆屬于中國西北干旱地區(qū)，夏季炎熱，7月為當(dāng)?shù)叵募靖邷仄?陳金良，2008)，在此期間，普氏野馬肯定會(huì)受到高溫脅迫。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，普氏野馬在整個(gè)高溫期一直維持在較高的FGM和T3水平，遠(yuǎn)高于冬季圈養(yǎng)雄馬的FGM水平(34.00 ng·g-1±5.14 ng·g-1)(曹婷婷等，2009)。但是，普氏野馬在夏季高溫期不同溫度下，生理應(yīng)激程度的激素水平差異并不顯著，因此推測(cè)，新疆普氏野馬在應(yīng)對(duì)夏季高溫脅迫時(shí)，其生理代謝水平會(huì)升高，并維持較高水平，但在其正常調(diào)節(jié)范圍內(nèi)，沒有超過其耐受的閾值。普氏野馬生理代謝水平的升高可能是其抵御不利環(huán)境的必要保證(于小杰，2011；吉晟男，2013)。此外，LPHSI(1990)僅對(duì)畜禽類的高溫應(yīng)激閾值給出統(tǒng)一值，即當(dāng)THI>28.9時(shí)，畜禽類動(dòng)物處于嚴(yán)重高溫應(yīng)激狀態(tài)，并未針對(duì)動(dòng)物個(gè)體大小進(jìn)一步細(xì)分。Marai等(2001)將THI=28.9作為高溫閾值，應(yīng)用于雌性穴兔Oryctolaguscuniculus的研究中，然而，將THI=28.9作為圈養(yǎng)普氏野馬高溫與非高溫的分界值還有待驗(yàn)證。

動(dòng)物身體的核心溫度超過正常范圍時(shí)，會(huì)導(dǎo)致身體總熱負(fù)荷(內(nèi)環(huán)境)超過散熱能力，動(dòng)物會(huì)通過生理或行為方式降低這種反應(yīng)(Bernabuccietal.，2010)。已有研究發(fā)現(xiàn)，圈養(yǎng)普氏野馬在其他季節(jié)的休息時(shí)間和飲水頻次顯著低于夏季，且休息和飲水行為發(fā)生高峰期與夏季高溫時(shí)間一致(陳金良，2008；張峰，2010)。吉晟男等(2013)的研究表明，夏季高溫期普氏野馬偏好選擇迎風(fēng)背陰處站立休息，且飲水和排尿次數(shù)增多；同時(shí)圈舍面積較小、缺乏足夠的庇蔭場(chǎng)所，為爭(zhēng)奪較好的庇蔭環(huán)境，普氏野馬的攻擊行為會(huì)增加。

本文研究結(jié)果顯示，圈養(yǎng)普氏野馬的FGM和T3代謝產(chǎn)物在夏季高溫期一直維持較高水平，不同類群間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，總體上成年雄性及雌性的應(yīng)激水平高于帶駒雌馬。這一結(jié)果也許不僅與性別或帶駒有關(guān)， 3組野馬間的年齡差異也可能影響結(jié)果，需要后續(xù)驗(yàn)證。此外，在干旱地區(qū)，高溫往往與干旱同時(shí)共存，水資源的缺乏對(duì)野生動(dòng)物生存影響更大(Krausman & Etchberger，1995；Maraietal.，2007)。陳金良(2008)研究發(fā)現(xiàn)，在新疆普氏野馬繁育中心的圈舍內(nèi)缺乏大面積的地表積水，不利于普氏野馬伏水降溫。Marai等(2010)研究表明，野生水牛Bubalusarneearnee只有在樹蔭下或水中，并有風(fēng)的情況下，體溫才能保持正常。鑒于此，為減少群內(nèi)個(gè)體的爭(zhēng)斗，增加其個(gè)體生存的適宜度，建議夏季高溫期實(shí)行分組、分圈管護(hù)，優(yōu)化圈舍環(huán)境，增大圈舍內(nèi)積水面積，具體措施為：(1)分組、分圈管護(hù)，將帶駒雌馬和幼駒分離出家族群，合圈飼養(yǎng)。(2)搭建簡(jiǎn)易遮陽棚，挖掘小面積水池，增設(shè)飲水槽，增加圈舍內(nèi)積水面積和供水次數(shù)；降低水源因子的限制。(3)圈舍間設(shè)置障礙物，避免普氏野馬之間相互干擾和攻擊。

采用非損傷性取樣法對(duì)普氏野馬FGM和T3代謝產(chǎn)物水平進(jìn)行監(jiān)測(cè)，可定量評(píng)估圈養(yǎng)普氏野馬夏季高溫期的生理狀況，及時(shí)調(diào)整圈養(yǎng)種群的管護(hù)模式，降低高溫對(duì)普氏野馬的生理及行為影響，為該物種的管護(hù)提供數(shù)據(jù)資料。

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