楊文婧，周 俊，龐 敏，操麗麗

靈芝是一種藥用真菌，其含有豐富的生理活性物質(zhì)，包括三萜類、靈芝多糖、甾醇等。靈芝孢子是靈芝的有性生殖細(xì)胞，具有靈芝的全部遺傳活性物質(zhì)。靈芝孢子油是靈芝孢子的脂質(zhì)提取物，富含三萜類靈芝酸、多不飽和脂肪酸[1-2]，具有抗腫瘤[3-4]、免疫調(diào)節(jié)[5]、保護(hù)調(diào)節(jié)神經(jīng)系統(tǒng)[6]、降血脂[7]、保肝護(hù)肝[8-9]等生理活性。因此，對(duì)靈芝孢子油的研究是靈芝研究的一個(gè)熱點(diǎn)。

目前，靈芝孢子油的提取主要是采取溶劑浸提法、超臨界CO2萃取法[10]等。超臨界CO2萃取法具有無化學(xué)溶劑消耗和殘留、無污染、工藝簡(jiǎn)單、萃取物純度高等優(yōu)點(diǎn)，但由于其設(shè)備昂貴、生產(chǎn)成本高、批處理量小等缺點(diǎn)，其在工業(yè)化上的應(yīng)用也受到了一定的限制[11-12]。溶劑浸提法具有生產(chǎn)成本小、提取率較高、操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，但存在溶劑殘留的問題。水酶法具有工藝條件溫和安全、操作溫度低、能耗低、能有效地保護(hù)油脂的品質(zhì)等優(yōu)點(diǎn)，已應(yīng)用于大豆油、花生油、玉米胚芽油等油脂工業(yè)中，但關(guān)于用水酶法提取靈芝孢子油鮮見報(bào)道[13-14]。試驗(yàn)采用超臨界CO2萃取法、索氏抽提法、水酶法3種方法對(duì)靈芝孢子油進(jìn)行提取，以靈芝孢子油的提取率為指標(biāo)，對(duì)3種提取方法進(jìn)行比較分析，確定靈芝孢子油的最佳提取方法，旨在為今后靈芝孢子油的工業(yè)化生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

破壁靈芝孢子粉（破壁率≥99.9%），安徽黃山云樂靈芝有限公司提供。

齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥98%，色譜級(jí)）、中性蛋白酶（80 000 U/g），北京索萊寶科技有限公司提供；石油醚（沸程30～60℃）、無水乙醇、乙酸乙酯、香草醛、冰醋酸、無水硫酸鈉等試劑均為分析純，中國國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司提供；正庚烷、甲醇，色譜純，美國Merck公司提供。

食品級(jí)CO2，純度大于99.5%。

1.2 儀器與設(shè)備

TU-1901型雙光束紫外可見分光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司產(chǎn)品；HA121-50-01-C型超臨界CO2萃取裝置，江蘇南通華安超臨界萃取有限公司產(chǎn)品；AL104型電子天平，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司產(chǎn)品；SER158/3型全自動(dòng)索氏提取儀，意大利VELP公司產(chǎn)品；7890A型氣相色譜儀，安捷倫科技有限公司產(chǎn)品。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 索氏提取法提取靈芝孢子油

在50℃烘箱中烘干破壁孢子粉至恒質(zhì)量，準(zhǔn)確稱取5.0 g破壁靈芝孢子粉于濾紙筒中；在已經(jīng)干燥至恒質(zhì)量的抽提瓶中倒入約2/3，使其能浸沒濾紙筒，在萃取溫度60℃條件下，考查萃取時(shí)間分別為4，5，6，7 h對(duì)靈芝孢子油得率的影響；得到石油醚萃取液、減壓蒸餾后，收集油樣待測(cè)。

1.3.2 水酶法提取靈芝孢子油

在50℃烘箱中烘干破壁孢子粉至恒質(zhì)量，稱取10.0 g破壁靈芝孢子粉，按1∶5（g∶mL） 的料液比加入0.025 mol/L的磷酸緩沖液（pH值6.8），使其浸泡1 h后，在100℃水浴鍋高溫滅酶10 min，取出待物料，降到酶解所需溫度50℃時(shí)，按2 000 U/g加入中性蛋白酶，分別研究酶解2，3，4，5 h對(duì)靈芝孢子油得率的影響。將酶解液以轉(zhuǎn)速5 000 r/min離心10 min后，收集上層清油并用無水Na2SO4干燥后保存用于待測(cè)[8-11]。

1.3.3 超臨界CO2萃取法提取靈芝孢子油

在50℃烘箱中烘干破壁孢子粉至恒質(zhì)量，稱取50 g破壁靈芝孢子粉置于500 mL萃取釜中，CO2流量20 L/h，在預(yù)試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，對(duì)影響超臨界萃取效果的萃取溫度、萃取壓力、萃取時(shí)間等因素采用L9（34）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，以靈芝孢子油得率為指標(biāo)，進(jìn)行萃取工藝條件優(yōu)化，所得萃取液經(jīng)減壓蒸餾后，收集油樣待測(cè)。

超臨界CO2萃取工藝因素與水平設(shè)計(jì)見表1。

表1 超臨界CO2萃取工藝因素與水平設(shè)計(jì)

1.3.4 孢子油得率的計(jì)算

1.3.5 三萜類物質(zhì)含量的測(cè)定

（1） 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。精密稱取 10 mg齊墩果酸，以無水乙醇為溶劑，配制成50 mL質(zhì)量濃度為0.2 g/L的齊墩果酸乙醇溶液。精密吸取齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)液0.1，0.2，0.4，0.6，0.8 mL分別置于10 mL具塞試管中，加熱揮去溶劑，再加入0.4 mL新制的5%香草醛-冰醋酸液及1.6 mL高氯酸，在70℃恒溫水浴加熱15 min，冷卻至室溫后再加入4 mL乙酸乙酯稀釋，于波長(zhǎng)560 nm處測(cè)定吸光度[15-16]。以吸光度為縱坐標(biāo)，齊墩果酸質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=4.195 7X+0.155 2，該方程的相關(guān)系數(shù)為0.999。

（2）孢子油中三萜類物質(zhì)含量的測(cè)定。準(zhǔn)確稱取一定量靈芝孢子油樣品充分溶解于乙酸乙酯中，取1.0 mL溶液于水浴上蒸干溶劑后，按上述同樣方法處理后測(cè)定吸光度，計(jì)算三萜類物質(zhì)的含量。

1.3.6 靈芝孢子油脂肪酸組成的測(cè)定

（1） 脂肪酸的甲酯化。取20 mg孢子油于圓底燒瓶中，加入2 mL 0.5 mol/L甲醇鈉溶液，加熱回流20 min后，再加入2 mL 0.5 mol/L的硫酸甲醇溶液，煮沸10 min。取出燒瓶，冷卻后，用2 mL正庚烷萃取2次，合并萃取液，用無水Na2SO4干燥2次，過濾備用進(jìn)行GC分析[17-18]。

（2） 靈芝孢子油脂肪酸組成分析。GC條件為DB-WAX型毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm×0.25μm）；程序升溫：100℃保持1 min，以20℃/min升溫至200℃，再以3℃/min升溫至230℃，保持12 min；進(jìn)樣口溫度230℃，F(xiàn)ID溫度250℃，分流比1∶50，進(jìn)樣量1μL；載氣：N2，載氣流速0.8 mL/min。

脂肪酸組成采用面積歸一法進(jìn)行計(jì)算。

2 結(jié)果與分析

2.1 靈芝孢子油的提取

2.1.1 索氏抽提法

不同提取時(shí)間對(duì)孢子油提取率的影響見表2。

由表2可知，隨著提取時(shí)間的增加，提取率先呈增加的趨勢(shì)，當(dāng)提取時(shí)間達(dá)到6 h以后，提取率基本不再增加，隨著孢子油提取率增加，孢子油中三萜化合物的含量也在不斷增加。這可能是由于隨著提取時(shí)間的增加，有機(jī)溶劑與靈芝孢子接觸越充分，抽提效果也就越充分，當(dāng)提取時(shí)間達(dá)到6 h以后，靈芝孢子中脂類物質(zhì)基本上都被抽提出來，孢子油提取率基本不再增加了。

表2 不同提取時(shí)間對(duì)孢子油提取率的影響

2.1.2 水酶法

不同酶解時(shí)間對(duì)提取效果的影響見表3。

表3 不同酶解時(shí)間對(duì)提取效果的影響

由表3可知，隨著酶解時(shí)間的增加，提取率沒有太大的變化，提取率都較低，這可能是由于水酶法中油與蛋白質(zhì)、多糖等形成了穩(wěn)定的乳化液，嚴(yán)重影響了提油率。但提取的孢子油中的三萜化合物的含量在不斷提高，酶解5 h時(shí)提取的孢子油中三萜化合物含量達(dá)到28.96%，這可能是由于三萜化合物結(jié)構(gòu)中存在親水的羥基基團(tuán)，相較于靈芝孢子油易于溶入乳化液中。

2.1.3 超臨界CO2萃取法

正交試驗(yàn)結(jié)果與分析見表4。

表4 正交試驗(yàn)結(jié)果與分析

從表4中極差分析結(jié)果可以看出，3個(gè)因素對(duì)靈芝孢子油提取率的影響大小依次為萃取壓力（B）＞萃取時(shí)間（C） ＞萃取溫度（A）。在試驗(yàn)設(shè)計(jì)范圍內(nèi)，優(yōu)化得到超臨界CO2萃取靈芝孢子油的最佳條件為A2B2C2，即萃取壓力30 MPa，萃取溫度45℃，萃取時(shí)間3 h，CO2流量20 L/h，該組合沒有在正交試驗(yàn)的9個(gè)組合中出現(xiàn)，驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果表明，在此條件下靈芝孢子油的提取率為24.63%，孢子油中三萜化合物的含量為25.15%。

2.2 孢子油中脂肪酸組成分析

靈芝孢子油的脂肪酸GC圖譜見圖1，靈芝孢子油主要脂肪酸組成見表5。

圖1 靈芝孢子油的脂肪酸GC圖譜

表5 靈芝孢子油主要脂肪酸組成

由圖1和表5可知，3種提取方法得到的靈芝孢子油中脂肪酸種類沒有差異，主要由軟脂酸、軟脂油酸、硬脂酸、油酸、亞油酸、亞麻酸等脂肪酸組成，并且各種脂肪酸含量也不存在顯著差異。靈芝孢子油中不飽和脂肪酸含量高，可達(dá)80%以上，其中油酸的含量超過60%，并富含亞油酸，使靈芝孢子油具有降低血脂、降血壓、軟化血管等生理活性。

3 結(jié)論

比較了索氏抽提法、水酶法、超臨界CO2萃取法對(duì)靈芝孢子油提取效果的影響，結(jié)果表明水酶法的提取率最低，但其孢子油中含有的三萜類物質(zhì)含量最高。索氏提取法提油率最高，三萜類物質(zhì)含量卻是最低的，3種提取方法提取的孢子油脂肪酸組成和含量沒有顯著影響，且靈芝孢子油中富含油酸、亞油酸等不飽和脂肪酸。通過正交試驗(yàn)優(yōu)化得到超臨界CO2萃取靈芝孢子油的最佳條件為萃取壓力30 MPa，萃取溫度45℃，萃取時(shí)間3 h，CO2流量20 L/h，在此條件下靈芝孢子油的得率為24.63%，其中三萜類化合物的含量為25.12%。

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