陳超陽(yáng)　和彥良　占才超

摘要：水貂肺炎是影響水貂養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的一種主要疾病，主要由于感染克雷伯氏和綠膿桿菌所致。本文以某一感染水貂肺炎的水貂養(yǎng)殖場(chǎng)為例，來(lái)闡述此病的實(shí)驗(yàn)室鑒定和預(yù)防措施。

關(guān)鍵詞：水貂肺炎；克雷伯氏；綠膿桿菌；實(shí)驗(yàn)室鑒定；預(yù)防措施

山東省膠南地區(qū)某水貂養(yǎng)殖場(chǎng)所養(yǎng)水貂零散發(fā)生一種以敗血癥、高死亡率為癥狀的傳染病，病貂的主要臨床癥狀表現(xiàn)為精神沉郁、食欲廢絕，1～2日內(nèi)突然死亡，個(gè)別死亡水貂出現(xiàn)口鼻出血，剖檢發(fā)現(xiàn)肺臟鮮紅。采集病料，經(jīng)實(shí)驗(yàn)室分離鑒定，確診為肺炎克雷伯氏菌與綠膿桿菌混合感染。現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1材料與方法

1.1樣品

患病死亡水貂肺臟，低溫運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2主要試劑

TSA培養(yǎng)基、TSB培養(yǎng)基、細(xì)菌革蘭氏染色試劑、綠膿桿菌生化鑒定試劑盒、克雷伯氏菌生化鑒定試劑盒、rTaq酶及D12000 Marker等。

1.3病源分離培養(yǎng)

取病料肺臟，無(wú)菌條件下用手術(shù)刀剪開(kāi)新鮮切口，用接種環(huán)沾取切面后劃線接種TSA平板，至37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24～36h，觀察培養(yǎng)結(jié)果。從培養(yǎng)的平板上挑取單菌落接種TSB培養(yǎng)基，進(jìn)行純化培養(yǎng)。

1.4涂片染色鏡檢

將純培養(yǎng)的細(xì)菌涂片，經(jīng)革蘭氏染色，顯微鏡下觀察菌體形態(tài)。

1.5生化試驗(yàn)

根據(jù)分離細(xì)菌的菌落形態(tài)和純培養(yǎng)結(jié)果，分別用綠膿桿菌生化鑒定試劑盒和克雷伯氏菌生化鑒定試劑盒進(jìn)行生化試驗(yàn)。

1.6PCR鑒定

取純培養(yǎng)菌液以12，000r/min離心5min，棄上清，用注射用水溶解菌泥，煮沸5min后作為DNA模板。采用本實(shí)驗(yàn)室建立的綠膿桿菌和肺炎克雷伯氏菌的PCR方法進(jìn)行鑒定。

1.7分離細(xì)菌的致病力試驗(yàn)

將分離到的兩種細(xì)菌肉湯培養(yǎng)物分別腹腔注射小鼠，每種細(xì)菌培養(yǎng)物注射小鼠5只，0.2mL/只，同時(shí)設(shè)生理鹽水對(duì)照小鼠5只，攻毒后觀察7日，記錄小鼠死亡情況。

2結(jié)果

2.1病原分離培養(yǎng)結(jié)果

劃線TSA培養(yǎng)基培養(yǎng)24h后出現(xiàn)兩種不同形態(tài)的菌落（見(jiàn)圖1）。一種為扁平、邊緣不整齊的黃綠色中大型菌落；一種為光滑隆起、乳白色的小型菌落，接種針挑取時(shí)可拉出絲。挑取兩種單菌落分別接種TSB培養(yǎng)進(jìn)行純培養(yǎng)，接種中大型菌落的培養(yǎng)物呈淡綠色混濁狀態(tài)，接種小型菌落的培養(yǎng)物呈淺褐色混濁狀態(tài)。

2.2染色鏡檢結(jié)果

中大型菌落的細(xì)菌為單個(gè)存在或成雙、呈短鏈排列的革蘭氏陰性桿菌；小型菌落的細(xì)菌為單個(gè)存在或成雙排列的革蘭氏陰性短桿菌。

2.3生化鑒定結(jié)果

中大型菌落的純培養(yǎng)物進(jìn)行綠膿桿菌生化鑒定，結(jié)果符合綠膿桿菌生化特性（見(jiàn)表1）；小型菌落的純培養(yǎng)物進(jìn)行克雷伯氏菌生化鑒定，結(jié)果符合肺炎克雷伯氏菌生化特性（見(jiàn)表2）。

2.4PCR鑒定結(jié)果

中大型菌落的細(xì)菌PCR結(jié)果見(jiàn)圖2，擴(kuò)增出956bp的目的條帶，與綠膿桿菌預(yù)期結(jié)果相符；小型菌落的細(xì)菌PCR結(jié)果見(jiàn)圖3，擴(kuò)增出428bp的目的條帶，與克雷伯氏菌預(yù)期結(jié)果相符。

2.5致病力試驗(yàn)結(jié)果

攻毒7日后，腹腔注射生理鹽水的對(duì)照小鼠健活，注射綠膿桿菌菌液和肺炎克雷伯氏菌菌液的小鼠均于48h內(nèi)死亡，死亡小鼠剖檢均出現(xiàn)肺臟出血（見(jiàn)圖4）。

3小結(jié)與討論

1）根據(jù)臨床癥狀、剖檢變化及病貂肺臟細(xì)菌的分離鑒定，確定水貂發(fā)病是由綠膿桿菌和肺炎克雷伯氏菌混合感染引起的。

2）近些年，由綠膿桿菌和肺炎克雷伯氏菌單獨(dú)感染、或混合感染引起的水貂出血性肺炎越來(lái)越多，因兩種細(xì)菌均為條件性致病菌，所以加強(qiáng)水貂養(yǎng)殖環(huán)境衛(wèi)生，定期消毒，改善飼養(yǎng)條件和完善飼養(yǎng)管理，接種商品化疫苗，可以很大程度上預(yù)防由其引發(fā)的水貂肺炎。endprint