羅燕平+張紅+胡晗緋+曹澤彧+張新莊+曹亮+王振中+蕭偉

[摘要] 探討銀杏二萜內(nèi)酯葡胺注射液對(duì)大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷（MCAO）的保護(hù)作用，并探討其可能的作用機(jī)制。雄性SD大鼠140只，隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、銀杏提取物注射液（金納多，1.0 mL·kg-1）、尼莫地平注射液（0.2 mg·kg-1）組、銀杏二萜內(nèi)酯葡胺注射液（5.2，2.6，1.3 mg·kg-1）組；所有動(dòng)物手術(shù)前4 d尾靜脈注射給藥（模型組及假手術(shù)組給予生理鹽水）。除假手術(shù)組，其他動(dòng)物通過(guò)右側(cè)大腦中動(dòng)脈線(xiàn)栓塞法（MCAO）制作局灶性腦缺血再灌注模型。缺血3 h 后，所用動(dòng)物再次尾靜脈注射給藥。大鼠缺血再灌注后進(jìn)行神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分并采用TTC染色法觀(guān)察腦組織梗死率；測(cè)定腦組織勻漿中超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽（GSH）、丙二醛（MDA）、乳酸（LA）含量及腦脊液中 Ca2+，谷氨酸（Glu），天冬氨酸（Asp）以及磷酸肌酸激酶（CK-BB）和乳酸脫氫酶（LDH）含量的變化。與假手術(shù)組相比，模型組大鼠腦梗死率顯著增加，神經(jīng)嚴(yán)重缺損；腦組織勻漿中MDA、LA含量升高，GSH、SOD含量降低；腦脊液中Ca2+濃度降低，Glu和Asp的含量及CK-BB、LDH含量顯著升高。與模型組相比，銀杏二萜內(nèi)酯葡胺注射液高、中劑量組能顯著減少腦梗死率，改善腦神經(jīng)功能缺損癥狀；提高 SOD、GSH活性，減少血清中MDA、LA含量；升高腦脊液中Ca2+濃度，減低神經(jīng)遞質(zhì)Glu和Asp的含量及CK-BB、LDH的含量。銀杏二萜內(nèi)酯葡胺注射液能明顯改善模型動(dòng)物的神經(jīng)功能缺損，其機(jī)制可能與修復(fù)血腦屏障，減少自由基，減少細(xì)胞外游離鈣內(nèi)流，降低腦脊液中興奮性氨基酸含量等有關(guān)，從而保護(hù)腦缺血。

[關(guān)鍵詞] 銀杏二萜內(nèi)酯葡胺注射液； 腦缺血再灌注； 超氧化物歧化酶； 神經(jīng)遞質(zhì)； 鈣離子

[Abstract] To investigate the protective effects of ginkgo diterpene lactone meglumine injection （GDLMI） on cerebral focal ischemia reperfusion injury induced by middle cerebral artery occlusion （MCAO） in rats， and explore its possible mechanism. One hundred and forty male SD rats were randomly divided into sham operation group， model group， ginkgo biloba extract injection （Ginaton， 1.0 mL·kg-1） group， nimodipine （0.4 mg·kg-1） group， and GDLMI （5.2， 2.6， 1.3 mg·kg-1） groups； All of rats received corresponding drugs by tail vein injection 4 days before operation （normal saline in model group and sham operation group）. Except the sham operation group， the cerebral ischemic stroke model was established by MCAO method in right brain of the other rats. After 3 h of ischemia， all the animals received intravenous administration again. The neurobehavioral scores of rats after ischemia-reperfusion were evaluated and the infarct rate of brain tissue was observed by TTC staining. The super oxide dismutase （SOD）， glutathione （GSH）， malondialdehyde （MDA） and lactic acid （LA） contents in brain tissue homogenate and the concentration of Ca2+， glutamate （Glu） and aspartate （Asp）， creatine phosphate kinase （CK-BB） and lactate dehydrogenase （LDH） content changes in cerebrospinal fluid were measured. As compared with the sham operation group， the cerebral infarction rate was increased significantly in the model group； the content of MDA and LA in the homogenate of brain tissue was increased， and the content of GSH and SOD was decreased； in cerebrospinal fluid， Ca2+ concentration was decreased， and the content of Glu and Asp， CK-BB and LDH increased significantly. As compared with the model group， the high and medium dose GDLMI groups can significantly reduce the cerebral infarction rate and improve the symptoms of neurological impairment； increase SOD and GSH activity， reduce MDA and LA content in serum； increase Ca2+ concentration in cerebrospinal fluid and decrease the content of neurotransmitter Glu and Asp as well as CK-BB and LDH. GDLMI could obviously improve neurologic impairment in model rats， and the mechanism may be related to recovering the blood brain barrier， scavenging free radicals， decreasing free Ca2+ inflow into the cells and the content of excitatory amino acid in cerebrospinal fluid to improve its protective effect on cerebral ischemia.endprint

[Key words] ginkgo diterpene lactone meglumine injection； cerebral ischemia reperfusion injury； super oxide dismutase； neurotransmitter； Ca2+

據(jù)統(tǒng)計(jì)，我國(guó)約有7 000萬(wàn)腦卒中患者，其中缺血性腦卒中約占70%。缺血性腦卒中具有復(fù)發(fā)率高（17.7%），致殘率高（33.3%～44.6%），病死率高（11.4%～15.4%）的特點(diǎn)[1]。臨床上治療缺血性腦卒中的藥物主要為抗血小板藥物，如阿司匹林、氯吡格雷；該類(lèi)藥物長(zhǎng)期服用存在出血風(fēng)險(xiǎn)，并易產(chǎn)生抵抗作用；臨床聯(lián)合用藥發(fā)現(xiàn)，將抗血小板藥物與神經(jīng)保護(hù)藥物聯(lián)用，可顯著改善缺血性腦卒中患者的神經(jīng)功能缺損癥狀[2]。開(kāi)發(fā)一種既能抗血小板又能改善神經(jīng)功能，且出血風(fēng)險(xiǎn)低的藥物具有較好的應(yīng)用前景。

銀杏內(nèi)酯是銀杏葉中一類(lèi)重要的成分，主要含有倍半萜內(nèi)酯和二萜內(nèi)酯[3]；已鑒定的二萜內(nèi)酯類(lèi)化合物有銀杏二萜內(nèi)酯 A，B，C，J，K，L，M，N，P，Q 等。前期藥理研究報(bào)道，銀杏中二萜內(nèi)酯類(lèi)化合物具有較好的抗血小板聚集、抗炎、保護(hù)心腦血管的活性[4-5]，可有效預(yù)防治療心腦血管疾病[6]?；诖耍扇‖F(xiàn)代提取富集工藝從銀杏葉中制備出了以二萜內(nèi)酯為主要成分的原料藥，隨后開(kāi)展了系列的藥理作用研究，以探討銀杏二萜內(nèi)酯治療局灶性腦缺血的作用。

1 材料

1.1 藥品與試劑

銀杏二萜內(nèi)酯葡胺注射液（江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)000409）；銀杏葉提取物注射液（金納多注射液，德國(guó)威瑪舒培博士藥廠(chǎng)，批號(hào)6580199，7.5 mg銀杏提取物 5 mL/支）；尼莫地平注射液（德國(guó)拜爾出品，批號(hào) CATEZ1），水合氯醛 （國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)20000609），氯化三苯基四氮唑（TTC，Sigma 公司，批號(hào) 122016），丙二醛測(cè)定試劑盒（MDA），批號(hào)20000715；超氧化物歧化酶測(cè)定試劑盒（SOD），批號(hào)20000705；谷胱甘肽測(cè)定試劑盒（GSH），批號(hào)20000721；乳酸測(cè)定試劑盒（LA），批號(hào)20000705；考馬斯亮藍(lán)劑盒，批號(hào)20000825；乳酸脫氫酶（LDH）試劑盒，批號(hào)20000515，磷酸肌酸激酶 （CK-BB） 試劑盒，批號(hào)20000524，鈣（Ca2+）試劑盒，批號(hào)20000625；均由南京建成生物工程研究所提供。其他試劑均為市售分析純。

1.2 動(dòng)物

SD大鼠，雄性，SPF級(jí)，6月齡，體質(zhì)量300～400 g，由上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，合格證號(hào) SCXK（滬）2008-0016。動(dòng)物飼養(yǎng)于屏障環(huán)境中，12/12 h 明暗交替，溫度為22～25 ℃，相對(duì)濕度50%～60%，動(dòng)物自由進(jìn)食飲水，適應(yīng)5 d后開(kāi)始試驗(yàn)。

1.3 儀器

TSQ-280 型恒溫培養(yǎng)振蕩器（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司），DHG-9053A 型電熱恒溫干燥箱（上海醫(yī)用恒溫設(shè)備廠(chǎng)），AU600 型全自動(dòng)生化分析儀（日本 Olympus公司），Agilent1100 型高效液相色譜儀（美國(guó)安捷倫科技有限公司），5804R型冷凍離心機(jī)（Eppendorf公司），BS224S 型電子天平（賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）

2 方法

2.1 分組與給藥

大鼠隨機(jī)分為7組：假手術(shù)組、模型組、金納多注射液（1.0 mL·kg-1）、尼莫地平注射液（0.2 mg·kg-1）組、銀杏二萜內(nèi)酯葡胺注射液（5.2，2.6，1.3 mg·kg-1）組，每組20只；造模前4 d，每天尾靜脈注射給藥1次，最后一次給藥30 min后進(jìn)行腦缺血造模，再灌注后注射相同的藥物；假手術(shù)組和模型組于相同時(shí)段注射等體積生理鹽水。

2.2 模型制備

參考Longa等的方法[7]，采用頸內(nèi)動(dòng)脈線(xiàn)栓法制備大鼠大腦中動(dòng)脈閉塞（MCAO）模型。大鼠用10%水合三氯乙醛（300 mg·kg-1）腹腔注射麻醉，仰臥恒溫手術(shù)臺(tái)上頸部正中切口，暴露右側(cè)頸總動(dòng)脈，向外牽引二腹肌及胸鎖乳突肌，由頸總動(dòng)脈分叉處向頭端依次游離，結(jié)扎并剪斷頸外動(dòng)脈的分支：枕骨下動(dòng)脈和甲狀腺上動(dòng)脈，在頸外動(dòng)脈遠(yuǎn)端結(jié)扎，切斷頸外動(dòng)脈使其主干游離備用，然后分離頸內(nèi)動(dòng)脈，用絲線(xiàn)在頸外動(dòng)脈根部打一松扣，夾閉頸總動(dòng)脈和頸內(nèi)動(dòng)脈。將尼龍線(xiàn)（長(zhǎng)4 cm，直徑0.26 mm）經(jīng)頸外動(dòng)脈主干切口，緩慢向頸內(nèi)動(dòng)脈入顱方向推進(jìn)，以頸總動(dòng)脈分叉處為標(biāo)記，推進(jìn)20 mm左右時(shí)感到阻力，即達(dá)到了較細(xì)的大腦前動(dòng)脈內(nèi)，阻斷了MCA的所有血供來(lái)源，扎緊頸外動(dòng)脈根部松扣。1 h后，拔出尼龍線(xiàn)，扎緊動(dòng)脈殘端?？p合皮膚，完成MCAO導(dǎo)致局灶性腦缺血-再灌注模型。假手術(shù)組大鼠麻醉后，僅暴露頸內(nèi)外動(dòng)脈分叉，不閉塞MCA。

2.3 檢測(cè)指標(biāo)

2.3.1 行為學(xué)評(píng)分 術(shù)后24 h按Bederson的方法對(duì)動(dòng)物的行為缺陷進(jìn)行分級(jí)評(píng)分，提尾懸空離地面約 35 cm，觀(guān)察兩前肢狀況；將大鼠置于水平地面，推動(dòng)其雙肩，觀(guān)察兩側(cè)抵抗力的差異。標(biāo)準(zhǔn)如下：0級(jí)，未觀(guān)察到神經(jīng)癥狀；1級(jí)，提尾懸空時(shí)，動(dòng)物的手術(shù)對(duì)側(cè)前肢表現(xiàn)為腕肘屈曲，肩內(nèi)旋，肘外展，緊貼胸壁；2級(jí)，將動(dòng)物置于光滑平面上，推手術(shù)側(cè)肩向?qū)?cè)移動(dòng)時(shí)，阻力降低；3級(jí)，動(dòng)物自由行走時(shí)向手術(shù)對(duì)側(cè)環(huán)轉(zhuǎn)或轉(zhuǎn)圈；4級(jí)，軟癱，肢體無(wú)自發(fā)活動(dòng)[8]。

2.3.2 TTC染色法觀(guān)察大鼠腦梗死率 MCAO 24 h后，斷頭處死大鼠，取出全腦，左右腦分別切開(kāi)，稱(chēng)重。在右腦視交叉及其前后各2 mm處，做冠狀切，腦切片于1%TTC溶液中避光37 ℃孵育25 min，用眼科鑷分離蒼白區(qū)（梗死區(qū)）和非蒼白區(qū)（正常區(qū)），計(jì)算梗死百分比[9]。

梗死率=蒼白區(qū)質(zhì)量/（蒼白區(qū)質(zhì)量+非蒼白區(qū)質(zhì)量）×100%endprint

將染色后的腦組織置于110 ℃烘箱烘干，對(duì)照大腦濕重求出腦含水量如下。

腦組織含水量=（1-腦組織干重/腦組織濕重）×100%

2.3.3 腦組織勻漿中SOD，GSH，MDA，LA量的檢測(cè) 缺血再灌注24 h后，大鼠斷頭處死，取腦，去除小腦。將大腦用生理鹽水制成10%勻漿，按南京建成生物工程研究所提供的試劑盒說(shuō)明書(shū)，測(cè)定大腦組織中的超氧化物歧化酶（SOD），谷胱甘肽（GSH），丙二醛（MDA）和乳酸（LA）含量。腦勻漿蛋白含量按考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定[10]。

2.3.4 腦脊液中氨基酸類(lèi)神經(jīng)遞質(zhì)Glu和Asp 及Ca2+，CK-BB，LDH 測(cè)定 再灌注 24 h 后，大鼠以10%水合氯醛麻醉，剪開(kāi)背面頸部皮膚，鈍性分離頸部肌肉，暴露枕骨大孔。將大鼠頭向腹面彎曲，用 1 mL 一次性注射器輕輕刺穿腦膜，抽取腦脊液約 100 μL。所得腦脊液以1 000 r·min-1離心3 min，取上清液，超濾杯過(guò)濾離心（8 000 r·min-1離心5 min）后待用。取過(guò)濾后的腦脊液樣品 10 μL，行柱前衍生化反應(yīng)并HPLC分析Glu和Asp。Ca2+，CK-BB，LDH 的測(cè)定嚴(yán)格按照各試劑盒操作要求進(jìn)行測(cè)定[11]。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以±s表示，SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，多組間均數(shù)采用One-way ANOVA法檢測(cè)顯著性，P<0.05差異顯著。

3 結(jié)果

3.1 MCAO 大鼠的神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分及腦血管梗死率和腦含水量的影響

缺血再灌注后，與假手術(shù)組相比，模型組神經(jīng)行為評(píng)分、腦梗死率及腦含水量均有顯著性差異（P<0.01）；與模型組相比，銀杏二萜內(nèi)酯葡胺注射液高、中劑量及金納多注射液、尼莫地平注射液均能降低神經(jīng)行為評(píng)分、腦梗死范圍以及腦含水量 （P<0.05），見(jiàn)表1。

3.2 對(duì) MCAO大鼠血清生化指標(biāo)的影響

與假手術(shù)組相比，模型組大鼠血清中的MDA，LA含量顯著增加，SOD，GSH含量顯著減少（P<0.01）；與模型組相比，銀杏二萜內(nèi)酯注射液高、中劑量組及金納多注射液組、尼莫地平注射液組大鼠血清中的MDA，LA含量顯著減少，SOD，GSH含量顯著增加（P<0.01）；低劑量組效果未見(jiàn)顯著性差異，見(jiàn)表2。

3.3 對(duì)MCAO大鼠腦脊液指標(biāo)的影響

與假手術(shù)組相比，模型組大鼠腦脊液中Ca2+含量顯著低于假手術(shù)組（P<0.01）；LDH含量及

CK-BB，Glu，Asp活性均顯著高于假手術(shù)組（P<0.01）。與模型組相比，銀杏二萜內(nèi)酯注射液高、中、低3個(gè)劑量組，金納多注射液，尼莫地平注射液均可顯著提高大鼠腦脊液Ca2+的含量（P<0.05），顯著降低神經(jīng)遞質(zhì)Glu和Asp 含量及CK-BB，LDH的含量（P<0.05），見(jiàn)表3。

4 討論

腦缺血再灌注造成的損傷病理及生理過(guò)程極為復(fù)雜，腦中血流中斷導(dǎo)致局部腦組織處于缺血缺氧狀態(tài)，細(xì)胞能量代謝發(fā)生紊亂[12]。缺血再灌注后使腦組織細(xì)胞發(fā)生損傷級(jí)聯(lián)放大效應(yīng)，包括能量代謝障礙、生成自由基[13]、激活凋亡基因、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞內(nèi)Ca2+穩(wěn)態(tài)失衡等，最終誘發(fā)細(xì)胞凋亡[14-15]。本研究結(jié)果顯示銀杏二萜內(nèi)酯注射液可使局灶性腦缺血大鼠再灌注損傷的腦組織內(nèi)的MDA，LA等含量降低，表明組織缺血缺氧和過(guò)氧化程度受到明顯抑制；同時(shí)SOD和GSH含量增加，反映了藥物對(duì)機(jī)體抗氧化能力和清除自由基的能力有提高。

腦缺血再灌注過(guò)程中，局部腦組織可通過(guò)神經(jīng)元突觸或者胞體與腦脊液發(fā)生信息交流，因此腦脊液中相關(guān)成分變化能夠在一定程度上反映腦組織的損傷情況。Glu、Asp、甘氨酸等氨基酸為中樞神經(jīng)系統(tǒng)中傳遞興奮性的主要神經(jīng)遞質(zhì)，過(guò)度釋放興奮性氨基酸并激活相應(yīng)受體將導(dǎo)致興奮性神經(jīng)毒性，可在較大程度上影響腦缺血再灌注損傷的預(yù)后[16]。本研究結(jié)果顯示大鼠缺血再灌注24 h后，腦脊液中Glu，Asp 含量顯著增高；而銀杏二萜內(nèi)酯葡胺注射液及其主要成分作用之后，能有效降低腦脊液中興奮性氨基酸的含量，表明銀杏二萜內(nèi)酯葡胺注射液能修復(fù)腦內(nèi)的因缺血引起的氨基酸動(dòng)態(tài)平衡失調(diào)。

在正常情況下，機(jī)體神經(jīng)元通過(guò)控制細(xì)胞膜對(duì)Ca2+通透性來(lái)維持鈣離子的內(nèi)外平衡。腦缺血再灌注過(guò)程中細(xì)胞膜通透性發(fā)生改變，使細(xì)胞內(nèi)Ca2+高于正常水平，導(dǎo)致腦組織受傷[17-18]。細(xì)胞內(nèi)鈣濃度的異常升高可誘發(fā)Ca2+依賴(lài)性的谷氨酸持續(xù)釋放，Glu的過(guò)度釋放可引發(fā)神經(jīng)細(xì)胞凋亡的級(jí)聯(lián)反應(yīng)[19]。本研究檢測(cè)了缺血再灌注動(dòng)物模型給藥前后腦脊液中 Ca2+濃度的變化，發(fā)現(xiàn)模型組腦脊液中Ca2+濃度顯著低于假手術(shù)組，可能與Ca2+向細(xì)胞內(nèi)流有關(guān)。銀杏二萜內(nèi)酯葡胺注射液能在一定程度上升高腦脊液中Ca2+含量，表明其可能通過(guò)改善離子轉(zhuǎn)運(yùn)，從而減少缺血再灌注引起的Ca 2+濃度失衡。

CK一種是由B和M型2個(gè)亞單位組成的二聚體同工酶。腦組織中主要是CK-BB，正常情況下，CK-BB 在血液及腦脊液中含量極低。腦組織發(fā)生損傷時(shí)，腦細(xì)胞膜通透性增加，CK-BB 被釋放入細(xì)胞間隙，并通過(guò)受損的血腦屏障進(jìn)入血液，故CK-BB在血及腦脊液中的含量變化可反映腦細(xì)胞受損的嚴(yán)重程度[20]。正常情況下LDH 只能在腦細(xì)胞的胞漿中檢測(cè)到，當(dāng)腦破損時(shí)可從腦細(xì)胞溢出，使腦脊液中的LDH酶濃度升高。因此當(dāng)腦脊液中LDH，CK-BB酶濃度發(fā)生變化表明腦組織受到了損傷，且與濃度呈正相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明銀杏二萜內(nèi)酯葡胺注射液可降低大鼠腦脊液中磷酸肌酸激酶和乳酸脫氫酶的含量。

本研究表明銀杏二萜內(nèi)酯葡胺注射液可顯著降低局灶性腦缺血再灌注后大鼠腦組織的梗死范圍和含水量，改善其神經(jīng)行為。腦組織勻漿生化指標(biāo)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)該藥能顯著降低腦組織中MDA，LA含量，升高GSH，SOD含量。提高模型大鼠腦脊液中 Ca2+，并降低CK-BB，LDH的含量及神經(jīng)遞質(zhì) Glu 和 Asp含量。表明該藥對(duì)大鼠實(shí)驗(yàn)性局灶性腦缺血有顯著的保護(hù)作用。作用機(jī)制可能與其修復(fù)血腦屏障、改善離子轉(zhuǎn)運(yùn)，減少急性腦缺血后細(xì)胞內(nèi)鈣超載和興奮性氨基酸的釋放，從而阻斷一系列腦損傷瀑布效應(yīng)，延遲神經(jīng)元死亡，改善模型動(dòng)物的神經(jīng)功能缺損，發(fā)揮對(duì)腦缺血的保護(hù)作用。endprint

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[責(zé)任編輯 孔晶晶]endprint