曹葉霞+尹愛萍+王曼

摘要：以野生蕨菜為原料，采用超聲波輔助提取法，研究不同提取條件對野生蕨菜中總黃酮含量的影響及其清除1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）自由基的能力。首先在單因素試驗基礎(chǔ)上考察各因素對野生蕨菜總黃酮提取率的影響，然后采用正交試驗優(yōu)化野生蕨菜總黃酮的提取工藝條件，同時比較其與維生素C在清除DPPH自由基方面的差異。結(jié)果表明，超聲輔助提取野生蕨菜中總黃酮的最優(yōu)條件：超聲功率240 W，料液比1 g ∶35 mL，超聲時間 70 min，超聲溫度60 ℃。其中的顯著影響因素是超聲功率、超聲溫度，在最優(yōu)條件下超聲波輔助提取野生蕨菜中總黃酮的提取率可以達(dá)到 3.34%。另外，野生蕨菜黃酮類化合物對DPPH自由基的清除率比相同濃度的維生素C溶液清除率高，其IC50值為 0.005 mg/mL，說明野生蕨菜總黃酮具有很好的抗氧化活性，從而為其綜合開發(fā)提供了一定的理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：野生蕨菜；超聲提??；總黃酮；正交試驗；DPPH

中圖分類號： R284.2文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號：1002-1302（2017）23-0194-04

目前有多種黃酮提取方法，但在眾多方法中，有機溶劑提取法存在溶劑成本高、毒性大等缺點，大孔樹脂吸附法的重現(xiàn)性差、預(yù)處理麻煩，酶提取法、超臨界流體提取法都存在成本偏高的劣勢，只有超聲波輔助提取法能高效地提取蕨菜中的黃酮類物質(zhì)，既能降低成本，又能縮短提取時間。但是對蕨菜黃酮的超聲波輔助提取未見報道，因此本研究以野生蕨菜為對象，采用單因素試驗與正交試驗相結(jié)合的方法，考察超聲波輔助提取野生蕨菜總黃酮的優(yōu)選工藝及其清除1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）自由基的能力，以期為野生蕨菜的綜合開發(fā)利用提供依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

野生蕨菜，產(chǎn)自黑龍江伊春。

1.2試劑與儀器

蕓香苷標(biāo)準(zhǔn)品（純度>99%），購自成都市科龍化工試劑廠；DPPH，購自西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司；亞硝酸鈉、無水乙醇、維生素C、硝酸鋁等，均為分析純。試驗用水均為二次蒸餾水。

KQ-400KDE型高功率數(shù)控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；UV-2500紫外-可見分光光度計，日本島津公司等。

1.3試驗方法

1.3.1野生蕨菜的預(yù)處理將野生蕨菜用蒸餾水洗凈，然后放于60 ℃烘箱中干燥，最后用粉碎機粉碎并過100目篩，裝瓶置于陰涼處備用。

1.3.2最大吸收波長的選擇野生蕨菜中的黃酮類物質(zhì)中含有游離的羥基，在一定條件下能與金屬鋁離子形成金屬絡(luò)合物而顯色，所以本試驗中選擇硝酸鋁比色法測定野生蕨菜中的總黃酮含量[3]。

準(zhǔn)確稱取100 mg蕓香苷標(biāo)準(zhǔn)品，置于50 mL容量瓶中，加約30 mL 50%乙醇，在水浴中加熱溶解，放冷，加50%乙醇稀釋到刻度，混合均勻，準(zhǔn)確量取5 mL上述溶液于100 mL容量瓶中，用蒸餾水定容，混合搖勻，即得0.100 mg/mL蕓香苷標(biāo)準(zhǔn)乙醇溶液。

準(zhǔn)確量取2.0 mL蕓香苷標(biāo)準(zhǔn)溶液于25 mL比色管中，加入1.0 mL 5%亞硝酸鈉溶液，混合搖勻，靜置6 min再加 1.0 mL 10%硝酸鋁溶液，混合均勻，靜置6 min，最后加 10.0 mL 4%氫氧化鈉溶液，加50%乙醇定容后，混合均勻，靜置15 min。取另一個比色管加1 mL 5%亞硝酸鈉，再加1 mL 10%硝酸鋁，最后加10 mL 4%氫氧化鈉，加50%乙醇定容至刻度作為空白對照，在200～800 nm波長范圍內(nèi)進(jìn)行紫外掃描，由圖1可見，在513 nm處有最大吸收峰，因此本試驗選擇513 nm為測定波長。

1.3.3蕓香苷標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制準(zhǔn)確量取蕓香苷標(biāo)準(zhǔn)品乙醇溶液0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL，分別置于25 mL比色管中，加1.0 mL 5%亞酸鈉溶液，混合均勻， 靜置 6 min，

然后加1.0 mL 10%硝酸鋁溶液，混合均勻，靜置 6 min，再然后加10 mL 4%氫氧化鈉溶液，最后加50%乙醇定容到刻度，混合均勻，靜置15 min，在波長513 nm處測定吸光度。由圖2可知，回歸方程為A=10.993C-0.000 7，r2=0.997。結(jié)果表明，蕓香苷標(biāo)準(zhǔn)品濃度在4～24 μg/mL 范圍內(nèi)，吸光度與濃度線性關(guān)系良好。

1.3.4樣品的測定[4]準(zhǔn)確稱取1.000 0 g野生蕨菜于錐形瓶中，超聲提取，常壓過濾，用乙醇溶劑洗至濾液無色即得到待測液。準(zhǔn)確移取2.0 mL野生蕨菜待測液于25 mL比色管中，用“1.3.2”節(jié)的顯色方法測定吸光度，代入標(biāo)準(zhǔn)方程計算野生蕨菜中總黃酮含量和提取率，其中總黃酮含量的計算公式：總黃酮含量=（提取液中總黃酮的質(zhì)量/樣品質(zhì)量）×100%。

1.3.5單因素試驗[5]（1）超聲功率對野生蕨菜中總黃酮提取率的影響。準(zhǔn)確稱取5份野生蕨菜粉末，每份 1.000 0 g，分別加入30 mL 70%（體積分?jǐn)?shù)）乙醇，超聲溫度為50 ℃，分別在160、200、240、280、320 W的功率下超聲提取40 min，常壓過濾至濾液無色，測量提取液體積并取2.0 mL提取液于25 mL比色管中，采用硝酸鋁比色法測定溶液吸光度，計算蕨菜的總黃酮含量。

（2）料液比對野生蕨菜中總黃酮提取率的影響。準(zhǔn)確稱取5份野生蕨菜粉末，每份1.000 0 g，分別加入25、30、35、40、45 mL 70%（體積分?jǐn)?shù)）乙醇，在超聲溫度為50 ℃、超聲功率為240 W的條件下超聲提取40 min，其余步驟同（1）。

（3）超聲時間對野生蕨菜中總黃酮提取率的影響。準(zhǔn)確稱取5份野生蕨菜粉末，每份1.000 0 g，分別加入30 mL 70%（體積分?jǐn)?shù)）乙醇，分別在50 ℃超聲溫度、280 W超聲功率下超聲提取30、50、70、90、110 min，其余步驟同（1）。endprint

（4）乙醇濃度對野生蕨菜中總黃酮提取率的影響。準(zhǔn)確稱取5份野生蕨菜粉末，每份1.000 0 g，分別加入30 mL體積分?jǐn)?shù)為40%、50%、60%、70%、80%的乙醇，在280 W超聲功率、50 ℃超聲溫度下超聲提取90 min，其余步驟同（1）。

（5）超聲溫度對野生蕨菜中總黃酮提取率的影響。準(zhǔn)確稱取5份野生蕨菜粉末，每份1.000 0 g，分別加入30 mL 60%（體積分?jǐn)?shù)）乙醇，分別在25、30、40、50、60 ℃溫度下以280 W的超聲功率超聲提取70 min，其余步驟同（1）。

1.3.6正交試驗[6]在單因素基礎(chǔ)上，選取超聲功率、料液比、超聲時間、超聲溫度作為考察因素，以野生蕨菜中總黃酮含量為目標(biāo)，每個因素設(shè)3個水平，采用L9（34）的正交設(shè)計試驗，因素水平設(shè)計如表1所示。

1.3.7野生蕨菜中總黃酮與維生素C分別清除DPPH自由基的測定（1）蕨菜總黃酮清除DPPH自由基測定。準(zhǔn)確稱取25 mg DPPH，用無水乙醇定容于100 mL棕色容量瓶中，制得DPPH母液，于冰箱中避光保存，用時稀釋5倍，得 50 mg/mL DPPH溶液。另將野生蕨菜提取液分別配成 0.026 4、0.021 1、0.015 8、0.010 6、0.007 9、0.005 3、0.004 0、0.002 6、0.001 3 mg/mL 9個濃度，反應(yīng)30 min后于1 cm比色皿中測定其在517 nm處的吸光度。

（2）維生素C清除DPPH自由基測定。準(zhǔn)確稱取 26.4 mg VC，用60%乙醇溶液定容于50 mL容量瓶中，制得VC母液，取10 mL母液稀釋于50 mL容量瓶中，得 0.052 8 mg/mL VC溶液。VC濃度梯度與DPPH自由基清除試驗中蕨菜濃度一致，反應(yīng)30 min后于1 cm玻璃比色皿中測定其在517 nm處的吸光度。

按下列公式計算DPPH自由基的清除率：清除率=[1-（Ds-Dc）/D0×100]×100%，其中抗氧化劑清除自由基能力采用清除率為50%時所對應(yīng)的抗氧化劑溶液濃度（即IC50值）表示。式中：D0為4.0 mL 50 mg/L DPPH乙醇溶液+ 1.0 mL 60%乙醇溶液的吸光度；Ds為4.0 mL 50 mg/L DPPH乙醇溶液+1.0 mL不同濃度樣品溶液的吸光度；Dc為 4.0 mL 無水乙醇溶液+1.0 mL不同濃度樣品溶液的吸光度[7]。

2結(jié)果與分析

2.1單因素試驗分析

2.1.1超聲功率對野生蕨菜中總黃酮提取率的影響如圖3所示，在160～240 W超聲功率范圍內(nèi)，野生蕨菜中總黃酮的提取率緩慢升高；在240～280 W超聲功率范圍內(nèi)，提取率迅速提高，在280 W超聲功率處理下，野生蕨菜中總黃酮的提取率達(dá)到最大值；但從280 W超聲功率開始，提取率急劇下降，這可能是因為超聲功率達(dá)到一定程度時會破壞黃酮類分子的結(jié)構(gòu)，使黃酮含量降低[6]。因此，確定280 W為最佳超聲功率。

2.1.2料液比對野生蕨菜中總黃酮提取率的影響如圖4所示，在料液比1 g ∶25 mL～1 g ∶30 mL的范圍內(nèi)，野生蕨菜中總黃酮的提取率逐漸提高，但從料液比為1 g ∶30 mL開始，溶劑越多，野生蕨菜中總黃酮的提取率急劇降低。這可能是由于隨著溶劑的增多，所溶解的雜質(zhì)也增多，從而使黃酮提取率降低。綜合提取效果與減少溶劑用量等方面[8]，確定最佳料液比為1 g ∶30 mL。

2.1.3超聲時間對野生蕨菜中總黃酮提取率的影響如圖5所示，野生蕨菜中總黃酮的提取率隨著超聲時間的增加呈現(xiàn)先提高后降低的趨勢，這可能是由于過長的提取時間破壞了黃酮類化合物的結(jié)構(gòu)，降低了總黃酮的含量。所以，確定最佳超聲時間為70 min。

2.1.4乙醇濃度對野生蕨菜中總黃酮提取率的影響如圖6所示，野生蕨菜中總黃酮的提取率隨著乙醇濃度的增加呈現(xiàn)先提高后降低的趨勢，這可能是由于高濃度乙醇溶解了部分脂溶性化合物，導(dǎo)致溶解黃酮化合物的能力降低[5]。因此，確定最佳乙醇濃度為60%。

2.1.5超聲溫度對野生蕨菜中總黃酮提取率的影響如圖

7所示，野生蕨菜中總黃酮的提取率隨著超聲溫度的逐漸上升呈現(xiàn)先提高后降低的趨勢，這可能由于溫度過高，溶劑揮發(fā)，使得野生蕨菜中總黃酮提取率降低[5]。所以，確定50 ℃為最佳超聲溫度。

2.2正交試驗結(jié)果

根據(jù)表2正交試驗結(jié)果可知，各因素對野生蕨菜總黃酮提取率影響大小順序為D>A>C>B，即超聲溫度>超聲功率>超聲時間>料液比，野生蕨菜中總黃酮超聲提取最佳的條件組合為A1B3C2D3，即超聲功率240 W，料液比 1 g ∶35 mL，超聲時間70 min，超聲溫度60 ℃。由表3分析可知，顯著的影響因素是超聲功率和超聲溫度。

2.3驗證試驗

為了更好地考察正交試驗的最優(yōu)工藝的穩(wěn)定性，根據(jù)分析結(jié)果，選取最優(yōu)提取條件即超聲功率240 W，料液比

2.4蕨菜中總黃酮與維生素C分別清除DPPH自由基

DPPH自由基作為一種十分穩(wěn)定、能長時間保存的自由基，當(dāng)它在適當(dāng)?shù)慕橘|(zhì)條件下會被還原[9-10]，消除了該自由基，溶液中化合物的顏色會由原來的紫色變成淡黃色[11]。

如表4、圖8所示，清除DPPH自由基的能力隨著維生素C質(zhì)量濃度的增加在逐漸增強：當(dāng)維生素C的質(zhì)量濃度達(dá)到 0.021 1 mg/mL 時，維生素C的清除率達(dá)到75.83%，其清除能力也趨于穩(wěn)定狀態(tài)，維生素C清除率達(dá)到IC50值所對應(yīng)的濃度為 0.014 mg/mL。清除DPPH自由基的能力隨著蕨菜總黃酮質(zhì)量濃度的增大而增強，當(dāng)質(zhì)量濃度達(dá)到 0.015 8 mg/mL 時，其清除率達(dá)到87.96%，且趨于穩(wěn)定，野生蕨菜清除率達(dá)到IC50值所對應(yīng)的濃度為 0.005 mg/mL[12-18]。因此表明，蕨菜中黃酮類化合物可以較好地清除DPPH自由基，同時也說明其清除能力比維生素C強。endprint