莊芳芳，蘇建強(qiáng)，陳輝煌，朱永官

1. 中國科學(xué)院城市環(huán)境研究所城市環(huán)境與健康重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廈門 361021 2. 中國科學(xué)院大學(xué)，北京 100049

水體環(huán)境與人類生產(chǎn)生活息息相關(guān)，隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)地快速發(fā)展，水體微生物污染日趨加劇，成為全球性環(huán)境問題，我國各大水系均受到不同程度的病原微生物污染。此外，國外40%的河流及河口由于病原微生物污染，水質(zhì)難以達(dá)到水環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)[1]。然而在水質(zhì)安全監(jiān)測方面，目前我國《地表水環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)(GB3838—2002)》僅把糞大腸菌群濃度規(guī)定為唯一的微生物指標(biāo)[2]。水體微生物污染(包括致病菌、病毒、寄生蟲)會(huì)引起多種傳染病和寄生蟲病，對水質(zhì)安全和人體健康造成重要威脅[3]，僅用糞大腸菌群作為唯一指標(biāo)無法準(zhǔn)確評估水體微生物污染。

糞便污染是水體微生物污染的主要來源之一[4]，其中的病原微生物可經(jīng)飲食、呼吸道、皮膚接觸等途徑感染人類，引起胃腸道疾病和呼吸道系統(tǒng)等疾病。由于腸道微生物差異,不同宿主來源糞便對水質(zhì)污染有著不同程度的危害，鑒別水體的糞便污染來源及污染程度有助于水體微生物污染來源監(jiān)管，從而保障水質(zhì)安全。傳統(tǒng)的糞大腸菌群等糞便污染指示微生物由于能夠在自然環(huán)境中存活并繁殖，在各種動(dòng)物的腸道中沒有特異性等缺陷不能分辨糞便污染來源，無法準(zhǔn)確評估水體微生物污染狀況[5-6]。微生物源示蹤技術(shù)的出現(xiàn)解決了這一難題，微生物源示蹤技術(shù)(Microbial Source Tracking，MST)自20世紀(jì)90年代被提出[7-8]，是基于不同宿主腸道微生物的差異，利用宿主特異性或與宿主相關(guān)的微生物指標(biāo)建立鑒別糞便污染源的方法[9]。利用TaqMan探針熒光定量PCR(quantitative PCR, qPCR)方法進(jìn)行溯源準(zhǔn)確度高、特異性強(qiáng)，可同時(shí)進(jìn)行定性和定量檢測，是近年來較為成熟與廣泛應(yīng)用的方法[10-11]。

微生物源示蹤技術(shù)僅可用于鑒別糞便污染的來源，不能指示各種病原微生物的含量，且MST指示微生物與病原微生物之間的相關(guān)關(guān)系尚存在質(zhì)疑。因此，評估水體環(huán)境病原微生物污染仍需對病原微生物種類及含量進(jìn)行測定。培養(yǎng)法與分子生物學(xué)方法是目前主要的病原微生物檢測手段[12]，但由于水體環(huán)境中病原微生物含量往往較低，培養(yǎng)法費(fèi)時(shí)、昂貴且無法對含量進(jìn)行定量[13-14]；隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，qPCR方法更為靈敏、方便、快速，在環(huán)境領(lǐng)域逐漸得到了應(yīng)用[15]。

后溪是廈門市第二大河流，干流全長29.25公里，總面積209.3平方公里，發(fā)源于戴云山脈和博平嶺山脈交界的老寮蒼山西麓，自西北向東南流經(jīng)集美區(qū)大部，經(jīng)后溪水閘后匯入杏林灣[16]。后溪流域是廈門市和集美區(qū)重要的水源涵養(yǎng)區(qū)和生態(tài)敏感區(qū)，其上游石兜、坂頭兩大水庫是廈門市城市飲用水重要供給地；中下游兩岸是快速發(fā)展的城鎮(zhèn)區(qū)域，城區(qū)河流極易受到居民生活污染；下游為入?？?，其上游的污染很可能造成入海口和近岸海岸帶污染。研究該流域微生物污染狀況對保護(hù)流域水環(huán)境、水質(zhì)安全管理及人類健康具有重要意義。

本研究利用基于TaqMan探針的高通量qPCR檢測技術(shù)，對廈門市后溪流域冬季微生物污染狀況進(jìn)行研究，包括常見糞便污染源(人類、反芻動(dòng)物、家禽、豬、狗)微生物源示蹤和病原微生物(胃腸道、肺炎、角膜炎相關(guān)疾病病原微生物)檢測，旨在探明該流域水體微生物污染特征和污染來源。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 研究區(qū)域概況及樣品采集

水樣采集于2017年1月，采樣點(diǎn)分布于整條流域，采樣位置包括上游源頭H1斷面、水庫H2～H5斷面、水庫下游H6斷面、居民生活產(chǎn)業(yè)區(qū)H7、H8斷面及集美新城區(qū)H9、H10斷面，共計(jì)10個(gè)斷面，分布見圖1。所有采樣位置均用GPS 定位儀精確定位，位點(diǎn)信息見表1。使用無菌聚乙烯塑料采樣瓶采集2.5 L水樣，6 h內(nèi)送回實(shí)驗(yàn)室分析。

圖1 研究區(qū)域及采樣點(diǎn)位置Fig. 1 Schematic map of the studied area and sampling sites

1.2 理化性質(zhì)測定

各采樣點(diǎn)pH、濁度、溶解氧的測定采用多參數(shù)水質(zhì)分析儀(Hydrolab DS5，美國)分析?？偺?、總有機(jī)碳、總氮、硝酸鹽、亞硝酸鹽、氨氮、總磷、磷酸鹽根據(jù)以前研究中使用的方法進(jìn)行測定[17]。

1.3 高通量qPCR檢測方法

1.3.1 樣品預(yù)處理與DNA提取

水樣采用0.2 μm的硝酸纖維濾膜，按照水質(zhì)狀況選擇過濾體積，將過濾后的濾膜剪碎并使用FastDNA?土壤DNA試劑盒(MP Biomedical，美國)提取基因組DNA，使用NanoDrop ND-1000分光光度計(jì)(Nanodrop，美國)對提取的DNA質(zhì)量和濃度進(jìn)行檢測。

1.3.2 分子標(biāo)記物

所采用的24個(gè)qPCR分子標(biāo)記物包含1個(gè)細(xì)菌通用16S rRNA基因分子標(biāo)記物、10個(gè)MST分子標(biāo)記物(表2)及13個(gè)病原微生物分子標(biāo)記物(表3)。引物、探針合成于Thermo Fisher公司(中國)。

表1 采樣位點(diǎn)信息Table 1 Characteristics of the sampling sites

表2 糞便污染分子標(biāo)記物序列信息Table 2 Oligonucleotide sequences of MST markers for fecal pollution

表3 病原微生物分子標(biāo)記物序列信息Table 3 Oligonucleotide sequences for pathogen markers

續(xù)表3

表4 采樣點(diǎn)理化性質(zhì)Table 4 Physical and chemical properties of the sampling sites

分子標(biāo)記物中TaqMan探針進(jìn)行優(yōu)化調(diào)整：將5’端熒光報(bào)告基團(tuán)統(tǒng)一為羧基熒光素(6-carboxy-fluorescein，F(xiàn)AM)，3’端熒光淬滅基團(tuán)用黑洞淬滅基團(tuán)1(Black Hole Quencher 1，BHQ1)取代羧基四甲基羅丹明(Carboxytetramethylrhodamine，TAMRA)，3’端淬滅基團(tuán)統(tǒng)一為BHQ1或小溝結(jié)合物-非熒光淬滅基團(tuán)(Minor groove binder-non fluorescent quencher，MGB-NFQ)。這是由于TAMRA為熒光染料，在淬滅報(bào)告基團(tuán)的同時(shí)會(huì)發(fā)射熒光；而BHQ1為非熒光染料，淬滅報(bào)告基團(tuán)時(shí)自身不發(fā)射熒光，探針熒光本底低，使檢測靈敏度更高。對于MGB-NFQ淬滅基團(tuán)，MGB可將探針的Tm值提高10 ℃左右，探針長度較短，使得探針淬滅基團(tuán)與報(bào)告基團(tuán)空間位置更近，且NFQ是非熒光淬滅基團(tuán)，對報(bào)告基團(tuán)熒光淬滅效果更佳。

本試驗(yàn)24對分子標(biāo)記物均使用美國國家生物技術(shù)信息中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI) BLASTn工具進(jìn)行比對，驗(yàn)證探針和引物的特異性，比對后修改了其中的艱難梭菌(Clostridiumdifficile)cdtA分子標(biāo)記物(表3)。

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線質(zhì)粒樣品的制備

采用標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒外標(biāo)法對16S rRNA基因豐度進(jìn)行絕對定量，采用大腸桿菌DNA為模板，將PCR擴(kuò)增目的片段切膠回收、純化(Tiangen，北京)，與PMD19-T載體(Takara，日本)進(jìn)行AT連接、轉(zhuǎn)化，挑取單菌落測序，序列經(jīng)過BLAST比對后確認(rèn)為16S rRNA基因片段，采用TIANprep MINI plasmid試劑盒(Tiangen，北京)提取得到的含有16S rRNA基因的質(zhì)粒以10倍梯度稀釋至拷貝數(shù)范圍為109～103copies·μL-1，用于制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.4 高通量qPCR檢測

采用美國Wafergen公司SmartChip多樣品納升分配器分別將樣品(包括水樣DNA、質(zhì)粒和無核酸酶滅菌水陰性對照，一個(gè)樣品3個(gè)技術(shù)重復(fù))和引物、探針在SmartChip納升芯片(Wafergen，美國)上進(jìn)行分配，隨后將芯片置于SmartChipCycler儀器(Wafergen，美國)上進(jìn)行高通量qPCR[33-34]。

高通量qPCR反應(yīng)體系為100 nL，包含1×TaqMan?Gene Expression Master Mix(Applied Biosystems，美國)、1×ROX 參比染料(Invitrogen，美國)、1 mg·mL-1牛血清白蛋白溶液(Sigma，德國)、0.9 μmol·L-1正向引物與反向引物、0.25 μmol·L-1探針、5 ng·μL-1DNA和無核酸酶滅菌水。擴(kuò)增程序?yàn)椋?0 ℃ 2 min激活尿嘧啶-N-糖基化酶，95 ℃ 10 min激活A(yù)mpliTaq Gold DNA聚合酶，40個(gè)循環(huán)(95 ℃ 15 s變性，60 ℃ 1 min退火和延伸)。程序完成后，軟件將自動(dòng)分析并導(dǎo)出數(shù)據(jù)。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

1.4.1 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

導(dǎo)出的數(shù)據(jù)按以下標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行篩選：1)擴(kuò)增效率需在80%～120%之間；2)循環(huán)臨界值(Cycle Threshold，CT)必須小于31；3)3個(gè)技術(shù)重復(fù)至少2個(gè)得到擴(kuò)增的認(rèn)定為有效擴(kuò)增。篩選后的數(shù)據(jù)根據(jù)文獻(xiàn)計(jì)算相對豐度，公式為[33-34]：

接著，把樣品中目的基因的相對豐度通過16S rRNA基因的絕對定量數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化為目的基因的拷貝數(shù)。

1.4.2 數(shù)據(jù)分析

使用Microsoft Excel 2016對數(shù)據(jù)進(jìn)行運(yùn)算，用R語言2.14.0進(jìn)行熱圖、主成分分析(Principal Component Analysis，PCA)、冗余分析(Redundancy Analysis，RDA)，用Origin Pro 9.0作圖。

2 結(jié)果(Results)

2.1 理化性質(zhì)

廈門后溪中下游H6～H10位點(diǎn)濁度、營養(yǎng)鹽(總碳、總有機(jī)碳、總氮、硝酸鹽、亞硝酸鹽、氨氮、總磷、磷酸鹽)含量普遍高于上游與水庫位點(diǎn)。H7、H8位點(diǎn)濁度、營養(yǎng)鹽含量普遍高于其他位點(diǎn)，溶解氧含量低于其他位點(diǎn)(表4)。根據(jù)我國《地表水環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)(GB3838—2002)》中限值[2]，上游與水庫H1～H5位點(diǎn)中，H1位點(diǎn)為地表水Ⅴ類水質(zhì)，H4為Ⅲ類水質(zhì)，H2、H3、H5為Ⅳ類水質(zhì)，這些位點(diǎn)水質(zhì)無法達(dá)到功能目標(biāo)要求，主要由于總氮含量高，除總氮指標(biāo)外，其他指標(biāo)均達(dá)到地表水Ⅱ類水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)。根據(jù)實(shí)地調(diào)查，流域上游果園面積比較大，上游與水庫總氮含量較高可能與果園施肥有關(guān)。中下游H6～H10位點(diǎn)均為劣Ⅴ類水質(zhì)，主要表現(xiàn)為N、P污染，這些位點(diǎn)總氮含量均超標(biāo)，此外，H7～H9位點(diǎn)氨氮含量超標(biāo)，H6～H9位點(diǎn)總磷含量超標(biāo)，尤其是H7～H9位點(diǎn)營養(yǎng)鹽超標(biāo)較嚴(yán)重。

2.2 后溪微生物污染狀況

所用于檢測的分子標(biāo)記物除了Chicken/duckND5標(biāo)記物為自主設(shè)計(jì)，其余標(biāo)記物均來自于已發(fā)表的文獻(xiàn)(表2, 表3)，據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道具有較高的靈敏度與特異度。我們進(jìn)一步對各分子標(biāo)記物的探針和引物進(jìn)行BLAST比對驗(yàn)證表明探針和引物均具有較高特異性，這些分子標(biāo)記物可用于后續(xù)檢測。通過高通量qPCR得到廈門后溪冬季各采樣點(diǎn)的微生物污染狀況，包括不同宿主來源的糞便污染(圖2)與病原微生物污染(圖3)。

圖2 采樣點(diǎn)不同宿主糞便指示分子標(biāo)記物豐度(log10 copies·(100 mL)-1)Fig. 2 Concentration of fecal indicators (log10 copies·(100 mL)-1) from various hosts in sampling sites

圖3 采樣點(diǎn)病原微生物含量(log10 copies·(100 mL)-1)Fig. 3 Concentration of pathogens (log10 copies·(100 mL)-1) in sampling sites

上游和水庫H1～H5位點(diǎn)以及下游匯入杏林灣口H10位點(diǎn)未檢測出糞便污染，在中下游H6～H8和集美新城區(qū)H9位點(diǎn)檢測出糞便污染，且污染主要集中于點(diǎn)H7、H8。H6位點(diǎn)檢測出少量家禽源污染(4.0 log10copies·(100 mL)-1)及較高的豬源糞便污染(6.7 log10copies·(100 mL)-1)。H7和H8位點(diǎn)呈現(xiàn)出多種來源糞便污染，其中H7位點(diǎn)檢測到人類、反芻動(dòng)物、家禽、狗的糞便污染，基因拷貝數(shù)范圍為4.3～6.3 log10copies·(100 mL)-1，人類、家禽來源的糞便污染為主要污染。H8位點(diǎn)檢測到人源、家禽源、狗源污染(4.1～6.1 log10copies·(100 mL)-1)，其污染程度與H7位點(diǎn)相近。H9位點(diǎn)檢測出少量的人類糞便污染，基因拷貝數(shù)值為4.7 log10copies·(100 mL)-1(圖2)。

用于檢測病原微生物的分子標(biāo)記物包含了10個(gè)胃腸道病原微生物標(biāo)記物、1個(gè)棘阿米巴屬(Acanthamoebaspp.)18S rRNA標(biāo)記物、2個(gè)與肺炎相關(guān)疾病的病原微生物：克雷伯氏肺炎桿菌(Klebsiellapneumoniae)外膜磷酸孔蛋白標(biāo)記物及軍團(tuán)桿菌屬(Legionellaspp.)23S rRNA標(biāo)記物。由圖3可以看出，病原微生物的檢出與糞便污染的檢出有著較相似規(guī)律：H1～H5、H9位點(diǎn)檢測出較少病原微生物，在H6～H8、H10位點(diǎn)檢測出較多病原微生物，且主要集中于點(diǎn)H8。各位點(diǎn)水體的總細(xì)菌含量與糞便污染、病原微生物的檢出也有著相似規(guī)律，即H1～H5水體總細(xì)菌含量較少(8.2～9.1 log10copies·(100 mL)-1)，H6～H10水體總細(xì)菌含量較多(9.4～9.7 log10copies·(100 mL)-1)。不同的是，H1～H10各位點(diǎn)均檢測出軍團(tuán)桿菌，且其在水庫H2～H5位點(diǎn)的含量高于其他位點(diǎn)。所有位點(diǎn)檢測出的病原微生物含量均較少(3.9～5.3 log10copies·(100 mL)-1)。H2位點(diǎn)檢測出棘阿米巴；H6位點(diǎn)檢測出幽門螺桿菌(Helicobacterpylori)與克雷伯氏肺炎桿菌；H7位點(diǎn)檢測出腸聚集性大腸桿菌(enteroaggregativeE.coli)；H8位點(diǎn)檢測出較多病原微生物，包含產(chǎn)氣莢膜梭菌(Clostridiumperfringens)、腸毒素型大腸桿菌(enterotoxigenicE.coli)、棘阿米巴、克雷伯氏肺炎桿菌；H10位點(diǎn)檢測出霍亂弧菌/副溶血弧菌(Vibriocholera/V.parahaemolyticus)。

2.3 PCA與RDA結(jié)果

2.3.1 PCA結(jié)果

對后溪流域各采樣點(diǎn)糞便污染與病原微生物污染進(jìn)行PCA分析進(jìn)一步證實(shí)各點(diǎn)的微生物污染狀況有著差異，特別是上游與水庫H1～H5位點(diǎn)集中聚集，微生物污染狀況相似； H9、H10與H1～H5位點(diǎn)距離較近，微生物污染狀況較為相近；生活產(chǎn)業(yè)區(qū)H7、H8位點(diǎn)距離較近，污染狀況相似，且遠(yuǎn)離H1～H6、H9、H10位點(diǎn)，H7、H8微生物污染與這些位點(diǎn)差異較大(圖4)。對流域各采樣點(diǎn)理化性質(zhì)進(jìn)行PCA分析發(fā)現(xiàn)相似的規(guī)律：H1～H5位點(diǎn)較集中聚集，H7、H8與H1～H6、H10位點(diǎn)差異較大(圖5)。說明該流域微生物污染與理化性質(zhì)有一定相關(guān)關(guān)系。

圖4 采樣點(diǎn)微生物污染狀況PCA圖Fig. 4 Principal component analysis of microbial contamination in sampling sites

圖5 采樣點(diǎn)理化性質(zhì)PCA圖Fig. 5 Principal component analysis of physical and chemical properties in sampling sites

2.3.2 RDA結(jié)果

進(jìn)一步對各采樣點(diǎn)微生物污染與理化性質(zhì)進(jìn)行RDA分析，得到后溪流域微生物污染與pH、濁度、溶解氧、硝酸鹽、亞硝酸鹽含量顯著相關(guān)(P<0.05)，這5個(gè)理化指標(biāo)對流域微生物污染的解釋量為84.4%。H1～H5、H10位點(diǎn)pH、溶解氧含量較高，pH、溶解氧與這些位點(diǎn)微生物污染顯著正相關(guān)；反之，H7、H8位點(diǎn)pH、溶解氧含量較低，pH、溶解氧與H7、H8位點(diǎn)微生物污染顯著負(fù)相關(guān)。H7、H8位點(diǎn)濁度、營養(yǎng)鹽含量(硝酸鹽、亞硝酸鹽)高，濁度、硝酸鹽、亞硝酸鹽與H7、H8位點(diǎn)微生物污染顯著正相關(guān)；H1～H5、H9、H10位點(diǎn)反之亦成立(表4，圖6)。由于H7、H8位點(diǎn)微生物污染較嚴(yán)重，H1～H5、H9、H10位點(diǎn)微生物污染較小，由此可見后溪流域微生物污染與濁度、硝酸鹽、亞硝酸鹽含量顯著正相關(guān)，與pH、溶解氧含量顯著負(fù)相關(guān)。

圖6 采樣點(diǎn)微生物污染與理化性質(zhì)RDA圖Fig. 6 Redundancy analysis depict the relationship between microbial contamination and physical and chemical properties in sampling sites

3 討論(Discussion)

本研究利用高通量qPCR對廈門市后溪流域進(jìn)行了常見糞便污染源(人類、反芻動(dòng)物、家禽、豬、狗)和病原微生物檢測，用以評估該流域微生物污染狀況。所有樣點(diǎn)均未檢出艱難梭菌、沙門氏菌(Salmonella)、金黃葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、霍亂弧菌二元毒素基因(ctxA)污染。所有樣點(diǎn)均檢測出軍團(tuán)菌屬23S rRNA標(biāo)記物，且其在水庫H2～H5位點(diǎn)的含量高于其他位點(diǎn)，這與本研究中其他分子標(biāo)記物、理化性質(zhì)檢出的規(guī)律差異較大。據(jù)報(bào)導(dǎo)軍團(tuán)菌屬中包含多種非致病菌種[35]，所使用的分子標(biāo)記物為該菌的23S rRNA基因，涵蓋了該菌屬中的非致病菌株，因此該分子標(biāo)記物可能不適合用于評估軍團(tuán)菌病原微生物污染，后續(xù)研究中應(yīng)針對致病軍團(tuán)菌的特異基因進(jìn)行。

后溪流域上游為水源地水與水庫蓄水(H1～H5位點(diǎn))，水質(zhì)較好，沒有檢測到糞便污染，且檢出的病原微生物數(shù)量與含量極少，微生物污染極小。但石兜水庫上游H2位點(diǎn)檢測出少量棘阿米巴(4.0 log10copies·(100 mL)-1)污染，近年來有報(bào)導(dǎo)棘阿米巴性角膜炎爆發(fā)可能與飲用水受到棘阿米巴污染有關(guān)[32]，該污染出現(xiàn)于水庫，應(yīng)引起重視，并且需要進(jìn)一步確認(rèn)是否存在棘阿米巴污染。

H6～H8位點(diǎn)均檢測出糞便污染和病原微生物污染，H9位點(diǎn)檢測出少量人類糞便污染，H10位點(diǎn)檢測到病原微生物污染。H6樣點(diǎn)位于水庫下游，在該位點(diǎn)檢測到豬和家禽糞便污染，表明水體流出水庫后受到禽畜養(yǎng)殖污染(豬、家禽)。H7、H8樣點(diǎn)位于舊城區(qū)居民生活、產(chǎn)業(yè)區(qū)，這2個(gè)位點(diǎn)濁度、營養(yǎng)鹽含量普遍高于其他位點(diǎn)，溶解氧含量低于其他位點(diǎn)，N、P污染較為嚴(yán)重，為劣Ⅴ類水質(zhì)，已無法滿足水質(zhì)生態(tài)功能要求；這2個(gè)位點(diǎn)也檢測出最多的糞便污染與病原微生物污染，說明其受到較為嚴(yán)重的微生物污染。流域微生物污染主要來源于城市暴雨徑流、生活污水溢流、禽畜養(yǎng)殖、分散式污水處理系統(tǒng)、污水處理廠排水、流域底泥等[36]。人為因素，包括了人類生產(chǎn)、生活活動(dòng)可能是H7、H8位點(diǎn)微生物污染的主要來源。H9、H10樣點(diǎn)位于集美新城區(qū)，居民區(qū)較少，規(guī)劃與配套污水管網(wǎng)、處理設(shè)施較為科學(xué)環(huán)保，且其上游的污染經(jīng)過流域的稀釋、自凈降解作用，因此檢測出的微生物污染較少，但仍需進(jìn)一步加強(qiáng)控制。值得注意的是，在H10位點(diǎn)檢測出少量霍亂弧菌/副溶血弧菌毒素基因(toxR)與霍亂弧菌外膜蛋白W基因(ompW)，說明H10位點(diǎn)有霍亂弧菌、副溶血弧菌污染；本研究中還有一個(gè)分子標(biāo)記物針對霍亂弧菌二元毒素基因，二元毒素基因是強(qiáng)毒性基因[31, 37]，該位點(diǎn)未檢出霍亂弧菌二元毒素基因，說明H10位點(diǎn)病原微生物污染程度不高，但H10位點(diǎn)位于后溪流域匯入杏林灣的入?？?，該位點(diǎn)的污染很可能造成入?？谖廴?，且可能擴(kuò)散污染，仍需引起重視。

此外，后溪流域微生物污染與流域理化性質(zhì)密切相關(guān)，特別是營養(yǎng)鹽、濁度、pH、溶解氧。微生物污染狀況能進(jìn)一步表征流域綜合污染狀況，對控制流域理化、微生物污染具有重要意義。

綜上表明，城鎮(zhèn)居民生活、生產(chǎn)活動(dòng)是后溪流域微生物污染主要來源。后溪流域是廈門市小流域污染整治與水資源保護(hù)示范區(qū)，具有重要的水源涵養(yǎng)和生態(tài)功能，研究后溪流域污染狀況，特別是微生物污染狀況將有利于水資源保護(hù)與人類健康。本研究基于高通量qPCR技術(shù)對城市化小流域微生物污染狀況進(jìn)行評估，同時(shí)對多種糞便污染源與病原微生物進(jìn)行檢測，實(shí)現(xiàn)了更加快速、及時(shí)、科學(xué)、準(zhǔn)確地發(fā)現(xiàn)糞便污染來源，評估水體微生物污染分布規(guī)律和特征，從而對流域微生物污染監(jiān)管與控制提供更有效的依據(jù)。

[1] 楊勇, 魏源送, 鄭祥, 等. 北京溫榆河流域微生物污染調(diào)查研究[J]. 環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào), 2012, 32(1): 9-18

Yang Y, Wei Y S, Zheng X, et al. Investigation of microbial contamination in Wenyu River of Beijing [J]. Acta Scientiae Circumstantiae, 2012, 32(1): 9-18 (in Chinese)

[2] 國家環(huán)境保護(hù)總局. GB3838—2002 地表水環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)[S]. 北京: 中國標(biāo)準(zhǔn)出版社, 2002

Ministry of Environmental Protection of the People's Republic of China. GB3838—2002 Environmental quality standards for surface water [S]. Beijing: China Standard Press, 2002 (in Chinese)

[3] 世界衛(wèi)生組織. 飲用水水質(zhì)準(zhǔn)則(第四版)[M]. 上海: 上海交通大學(xué)出版社, 2014: 87-232

World Health Organization. Guidelines for Drinking-water Quality (Fourth Edition) [M]. Shanghai: Shanghai Jiaotong University Press, 2014: 87-232 (in Chinese)

[4] Simpson J M, Santo D J, Reasoner D J. Microbial source tracking: State of the science [J]. Environmental Science and Technology, 2002, 36(24): 5279-5288

[5] 王耀兵, 蘇潔, 楊玉敏, 等. 一種糞便污染源識(shí)別新技術(shù)——微生物源示蹤[J]. 海洋環(huán)境科學(xué), 2008, 27(S2): 122-128

Wang Y B, Su J, Yang Y M, et al. New technology of identification of fecal pollution—— Microbial source tracking [J]. Marine Environmental Science, 2008, 27(S2): 122-128 (in Chinese)

[6] 段傳人, 劉愛喜, 王貴學(xué), 等. 應(yīng)用腸道微生物示蹤地表水糞便污染的研究進(jìn)展[J]. 微生物學(xué)通報(bào), 2013, 40(12): 2319-2329

Duan C R, Liu A X, Wang G X, et al. Research progress of using intestinal microbes to track the sources of fecal pollution in surface water [J]. Microbiology China, 2013, 40(12): 2319-2329 (in Chinese)

[7] Wiggins B A. Discriminant analysis of antibiotic resistance patterns in fecalstreptococci, a method to differentiate human and animal sources of fecal pollution in natural waters [J]. Applied and Environmental Microbiology, 1996, 62(11): 3997-4002

[8] Parveen S, Murphree R L, Edmiston L, et al. Association of multiple-antibiotic-resistance profiles with point and nonpoint sources ofEscherichiacoliin Apalachicola Bay [J]. Applied and Environmental Microbiology, 1997, 63(7): 2607-2612

[9] Scott T M, Rose J B, Jenkins T M, et al. Microbial source tracking: Current methodology and future directions [J]. Applied and Environmental Microbiology, 2002, 68(12): 5796-5803

[10] Harwood V J, Staley C, Badgley B D, et al. Microbial source tracking markers for detection of fecal contamination in environmental waters: Relationships between pathogens and human health outcomes [J]. FEMS Microbiology Reviews, 2014, 38(1): 1-40

[11] 魏源送, 鄭嘉熹, 王光宇, 等. 地表水微生物溯源技術(shù)的開發(fā)和應(yīng)用進(jìn)展[J]. 水資源保護(hù), 2016, 32(1): 1-11

Wei Y S, Zheng J X, Wang G Y, et al. Development and application progress of microbial source tracking in surface water [J]. Water Resources Protection, 2016, 32(1): 1-11 (in Chinese)

[12] 陳亞楠, 王亞煒, 魏源送, 等. 不同功能地表水體中病原微生物指示物的標(biāo)準(zhǔn)比較[J]. 環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào), 2015, 35(2): 337-351

Chen Y N, Wang Y W, Wei Y S, et al. Evolution and standard comparison of indicator microorganisms for different surface waters [J]. Acta Scientiae Circumstantiae, 2015, 35(2): 337-351 (in Chinese)

[13] Field K G, Samadpour M. Fecal source tracking, the indicator paradigm, and managing water quality [J]. Water Research, 2007, 41(16): 3517-3538

[14] Ferguson A S, Layton A C, Mailloux B J, et al. Comparison of fecal indicators with pathogenic bacteria and rotavirus in groundwater [J]. Science of the Total Environment, 2012, 431: 314-322

[15] 張崇淼, 王曉昌, 周進(jìn)宏, 等. 城市地表水中腸道病原微生物與糞便污染指示菌的關(guān)系研究[J]. 環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào), 2012, 32(11): 2789-2794

Zhang C M, Wang X C, Zhou J H, et al. Comparative study on enteric pathogens and their relations with fecal indicator bacteria in urban surface waters [J]. Acta Scientiae Circumstantiae, 2012, 32(11): 2789-2794 (in Chinese)

[16] 王寧, 黃友誼, 陳偉偉. 構(gòu)建城市水系生態(tài)安全格局初探——以廈門市后溪為例[C]. 青島: 城市時(shí)代，協(xié)同規(guī)劃——2013中國城市規(guī)劃年會(huì), 2013: 1-12

Wang N, Huang Y Y, Chen W W. A Preliminary study on establishing an ecological security pattern of urban water system—A case study of Houxi River, Xiamen [C]. Qingdao: City Times, Collaborative Planning-China Urban Planning Annual Meeting 2013, 2013: 1-12 (in Chinese)

[17] Liu L, Yang J, Yu X, et al. Patterns in the composition of microbial communities from a subtropical river: Effects of environmental, spatial and temporal factors [J]. PLOS One, 2013, 8(11): e81232

[18] Mieszkin S, Furet J P, Corthier G, et al. Estimation of pig fecal contamination in a river catchment by real-time PCR using two pig-specificBacteroidales16S rRNA genetic markers [J]. Applied and Environmental Microbiology, 2009, 75(10): 3045-3054

[19] Shanks O C, Kelty C A, Sivaganesan M, et al. Quantitative PCR for genetic markers of human fecal pollution [J]. Applied and Environmental Microbiology, 2009, 75(17): 5507-5513

[20] Lee C S, Lee J. Evaluation of newgyrB-based real-time PCR system for the detection ofB.fragilisas an indicator of human-specific fecal contamination [J]. Journal of Microbiological Methods, 2010, 82(3): 311-318

[21] Green H C, Haugland R A, Varma M, et al. Improved HF183 quantitative real-time PCR assay for characterization of human fecal pollution in ambient surface water samples [J]. Applied and Environmental Microbiology, 2014, 80(10): 3086-3094

[22] Schill W B, Mathes M V. Real-time PCR detection and quantification of nine potential sources of fecal contamination by analysis of mitochondrial cytochromebtargets [J]. Environmental Science & Technology, 2008, 42(14): 5229-5234

[23] Layton A, Mckay L, Williams D, et al. Development ofBacteroides16S rRNA gene TaqMan-based real-time PCR assays for estimation of total, human, and bovine fecal pollution in water [J]. Applied and Environmental Microbiology, 2006, 72(6): 4214-4224

[24] Kobayashi A, Sano D, Hatori J, et al. Chicken- and duck-associatedBacteroides-Prevotellagenetic markers for detecting fecal contamination in environmental water [J]. Applied Microbiology and Biotechnology, 2013, 97(16): 7427-7437

[25] Kildare B J, Leutenegger C M, Mcswain B S, et al. 16S rRNA-based assays for quantitative detection of universal, human-, cow-, and dog- specific fecalBacteroidales: A Bayesian approach [J]. Water Research, 2007, 41(16): 3701-3715

[26] Green H C, White K M, Kelty C A, et al. Development of rapid canine fecal source identification PCR-based assays [J]. Environmental Science and Technology, 2014, 48(19): 11453-11461

[27] Wroblewski D, Hannett G E, Bopp D J, et al. Rapid molecular characterization ofClostridiumdifficileand assessment of populations ofC.difficilein stool specimens [J]. Journal of Clinical Microbiology, 2009, 47(7): 2142-2148

[28] Lee D Y, Shannon K, Beaudette L A. Detection of bacterial pathogens in municipal wastewater using an oligonucleotide microarray and real-time quantitative PCR [J]. Journal of Microbiological Methods, 2006, 65(3): 453-467

[29] Liu J, Gratz J, Amour C, et al. A laboratory-developed TaqMan Array Card for simultaneous detection of 19 enteropathogens [J]. Journal of Clinical Microbiology, 2013, 51(2): 472-480

[30] Kobayashi D, Eishi Y, Ohkusa T, et al. Gastric mucosal density ofHelicobacterpyloriestimated by real-time PCR compared with results of urea breath test and histological grading [J]. Journal of Medical Microbiology, 2002, 51(4): 305-311

[31] Bliem R, Schauer S, Plicka H, et al. A novel triplex quantitative PCR strategy for quantification of toxigenic and nontoxigenicVibriocholeraein aquatic environments [J]. Applied and Environmental Microbiology, 2015, 81(9): 3077-3085

[32] Wang H, Edwards M, Falkinham J R, et al. Molecular survey of the occurrence ofLegionellaspp.,Mycobacteriumspp.,Pseudomonasaeruginosa, and amoeba hosts in two chloraminated drinking water distribution systems [J]. Applied and Environmental Microbiology, 2012, 78(17): 6285-6294

[33] Su J Q, Wei B, Ou-Yang W Y, et al. Antibiotic resistome and its association with bacterial communities during sewage sludge composting [J]. Environmental Science & Technology, 2015, 49(12): 7356-7363

[34] Zhu Y G, Zhao Y, Li B, et al. Continental-scale pollution of estuaries with antibiotic resistance genes [J]. Nature Microbiology, 2017, 2: 16270

[35] 路鳳, 金銀龍, 程義斌. 軍團(tuán)菌病的流行概況[J]. 國外醫(yī)學(xué)(衛(wèi)生學(xué)分冊), 2008(2): 78-83

Lu F, Jin Y L, Cheng Y B. Epidemiology of Legionella disease [J]. Foreign Medicine (Hygiene), 2008(2): 78-83 (in Chinese)

[36] James E S, Joyce M P. Assessment and management of watershed microbial contaminants [J]. Critical Reviews in Environmental Science and Technology, 2004, 34(2): 109-139

[37] Blackstone G M, Nordstrom J L, Bowen M D, et al. Use of a real time PCR assay for detection of thectxAgene ofVibriocholeraein an environmental survey of Mobile Bay [J]. Journal of Microbiological Methods, 2007, 68(2): 254-259