雷剛，何彥

1 引言

眾所周知，等離子體納米顆粒(PNPs)因其獨(dú)特的局域表面等離子共振(LSPR)吸收和散射而展現(xiàn)出優(yōu)良的光學(xué)性質(zhì)1。近年來(lái)，PNPs的光散射性質(zhì)得到了越來(lái)越多的關(guān)注，并逐漸被應(yīng)用于分析化學(xué)領(lǐng)域2。在光散射分析化學(xué)的初期，研究者們主要利用溶液中大量納米顆粒的平均散射信號(hào)來(lái)進(jìn)行定量分析3,4，盡管這種分析方法快速、簡(jiǎn)便且檢測(cè)范圍廣泛，但其在靈敏度和準(zhǔn)確度方面必然存在一定的局限性。暗場(chǎng)顯微鏡(DFM)的出現(xiàn)促進(jìn)了單個(gè) PNPs的 LSPR光散射性質(zhì)方面的研究，也為實(shí)現(xiàn)單納米顆粒水平上的分析提供了可能5-7。PNPs的LSPR散射光對(duì)周?chē)橘|(zhì)環(huán)境非常敏感，有機(jī)小分子和生物大分子的吸附以及化學(xué)反應(yīng)都能夠引起PNPs表面介質(zhì)環(huán)境的變化，從而使其 LSPR散射光譜發(fā)生相應(yīng)的移動(dòng)，因此，單個(gè) PNPs可以作為彼此獨(dú)立的光散射探針用于分子檢測(cè)以及其它相互作用的分析。

作為一種具有超高靈敏度的檢測(cè)技術(shù)，單分子光譜(SMS)技術(shù)自被建立以來(lái)就受到大量關(guān)注，并于近十年間得到迅猛的發(fā)展8，為分析化學(xué)開(kāi)啟了一扇全新的大門(mén)。SMS技術(shù)是考察復(fù)雜細(xì)胞系統(tǒng)內(nèi)動(dòng)力學(xué)變化及物質(zhì)相互作用的強(qiáng)有力方法。不同于以大量分子長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)的平均行為為信號(hào)來(lái)源的傳統(tǒng)分析方法，SMS技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)對(duì)溶液中單個(gè)分子的檢測(cè)與實(shí)時(shí)成像，從而排除宏觀測(cè)量對(duì)系統(tǒng)復(fù)雜性造成的簡(jiǎn)化，發(fā)現(xiàn)隱藏在整體平均中的個(gè)體差異，捕捉淹沒(méi)于宏觀測(cè)量的極少數(shù)的中間體或過(guò)渡狀態(tài)，追蹤被掩蓋在平衡狀態(tài)之下隨時(shí)間和空間變化著的微觀動(dòng)力學(xué)過(guò)程。目前，相對(duì)成熟的SMS技術(shù)大都是以熒光分子或者半導(dǎo)體量子點(diǎn)為探針的熒光成像技術(shù)9，如激光共聚焦、全內(nèi)反射熒光等等。但是，傳統(tǒng)的熒光小分子和蛋白光穩(wěn)定性差，且光強(qiáng)度較弱，而半導(dǎo)體量子點(diǎn)又存在有細(xì)胞毒性較大且難以進(jìn)行特定修飾等缺點(diǎn)10。這些問(wèn)題一方面推動(dòng)著開(kāi)發(fā)新型熒光探針的研究，另一方面促進(jìn)著非熒光標(biāo)記單分子成像技術(shù)的建立。與熒光探針相比，PNPs易于修飾、生物兼容性好，且其 LSPR散射光具有強(qiáng)度高、穩(wěn)定性好及持續(xù)性長(zhǎng)等優(yōu)點(diǎn)。因此，發(fā)展以PNPs為探針的單分子成像技術(shù)對(duì)化學(xué)傳感、生物成像與生物納米技術(shù)的重要性不言而喻。

單個(gè)PNPs的成像主要基于其LSPR吸收和散射特性，如微分干涉相差(DIC)成像和暗場(chǎng)成像。由于DIC圖像對(duì)比度不高，從中難以區(qū)分探針和各種亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，所以大多數(shù)關(guān)于成像單個(gè)PNPs的報(bào)道都是以暗場(chǎng)成像為手段的。暗場(chǎng)成像技術(shù)是一種以所測(cè)樣品的散射光為信號(hào)在較低背景下進(jìn)行成像的技術(shù)，通過(guò)與光譜儀聯(lián)用，該技術(shù)還可用于獲取單個(gè)顆粒的LSPR光譜11。目前，常見(jiàn)的DFM主要利用高數(shù)值孔徑聚光鏡產(chǎn)生斜照明，在空間上實(shí)現(xiàn)對(duì)入射光與所測(cè)樣品散射光的信號(hào)分離，從而產(chǎn)生極高的對(duì)比度。用暗場(chǎng)成像技術(shù)拍攝的細(xì)胞圖像背景暗樣品亮，其對(duì)比度甚至可以與熒光圖像媲美。但是，傳統(tǒng)的DFM也存在分辨率不高、光學(xué)切割能力較弱和背景干擾大等缺點(diǎn)。通過(guò)對(duì)光源、檢測(cè)器及其它光學(xué)元件的擇優(yōu)組裝和調(diào)試，我們開(kāi)發(fā)出了一系列具有高靈敏度、高時(shí)空分辨率和高通量的暗場(chǎng)成像技術(shù)，并采用經(jīng)可控合成篩選出的單分散單個(gè)PNP探針，將這些技術(shù)巧妙地應(yīng)用于單分子檢測(cè)、多顆粒傳感、生物過(guò)程示蹤以及單細(xì)胞成像等領(lǐng)域。除此之外，我們還以具有光學(xué)各向異性的PNPs為探針，研制出精確的活細(xì)胞三維掃描成像系統(tǒng)和激光暗場(chǎng)高速毛細(xì)管電泳聯(lián)用系統(tǒng)，為高效率的儀器偶聯(lián)提供參照。這些技術(shù)有望將單分子光譜技術(shù)的發(fā)展推向一個(gè)全新的高度。

2 PNPs的合成

PNPs的LSPR性質(zhì)與其自身的組成成分、大小和形狀等有著密切的關(guān)系，為了篩選出合適的PNP探針，已有許多研究深入探討了各種 PNPs的可控合成方法，如利用DNA介導(dǎo)及電置換反應(yīng)等12-14。由于銀和金納米顆粒(AgNPs和 AuNPs)的吸收和散射信號(hào)主要集中在近紫外-可見(jiàn)-近紅外光區(qū)，且強(qiáng)度較高，所以其已成為最常用的PNP探針15,16。相對(duì)于 AgNPs，AuNPs因?yàn)榫哂懈€(wěn)定的光學(xué)性質(zhì)和更低的細(xì)胞毒性而在生物成像中得到廣泛的應(yīng)用。金納米棒(AuNRs)是最為典型的一個(gè)例子，其不僅能夠產(chǎn)生強(qiáng)而穩(wěn)定的散射信號(hào)，而且具有起源于自身各向異性的光學(xué)偏振特性，因此，AuNRs作為一種非常理想的光學(xué)成像探針近年來(lái)得到研究者們的廣泛關(guān)注。AuNRs最早的制備是在含有十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)的金離子溶液中通過(guò)硅或鋁的微孔中經(jīng)電化學(xué)還原所實(shí)現(xiàn)的17，此方法得到的AuNRs雖有著一些特殊的光學(xué)特性，但是沒(méi)有明顯的 LSPR性質(zhì)。2001年，Murphy課題組最先提出晶種生長(zhǎng)法的概念18，他們將小 AuNPs作為晶種加入到含有氯金酸和CTAB的混合溶液中，通過(guò)多步生長(zhǎng)法得到了長(zhǎng)徑比可控的AuNRs19。然而，該方法的產(chǎn)率較低，而且樣品需要分離，較為繁瑣。在2003-2004年，很多研究小組研發(fā)了一種高產(chǎn)率的小長(zhǎng)徑比AuNPs的合成方法，即使用外部有1.5 nm的CTAB保護(hù)的 AuNPs為晶種，并加入一定量的 AgNO3作為輔助20-22。該方法可以通過(guò)控制硝酸銀的量來(lái)調(diào)控AuNRs的長(zhǎng)徑比，所制備的AuNRs的產(chǎn)率在 95%以上。由于操作簡(jiǎn)單、重復(fù)性高且易于調(diào)控，這種銀離子輔助的晶種生長(zhǎng)法是目前使用最多的AuNRs制備方法。鑒于要經(jīng)常使用單分散且均一的AuNRs作為生物成像和系統(tǒng)性能測(cè)試的探針，我們基于晶種生長(zhǎng)法系統(tǒng)地研究了AuNRs的合成，發(fā)現(xiàn)pH值不僅能改變還原劑抗壞血酸的還原能力，還能改變CTAB分子在金表面的吸附能力以及CTAB雙分子層膠束的形狀和大小，并最終改變合成產(chǎn)物的形狀23。在此基礎(chǔ)上，我們又發(fā)現(xiàn)除了常用的抗壞血酸，亞硝鈉和氯化鐵在酸性條件下都可以作為溫和的還原劑對(duì)AuNRs的長(zhǎng)徑比進(jìn)行精確的調(diào)控24，相較于可控合成，這種利用刻蝕反應(yīng)調(diào)節(jié)AuNRs的LSPR性質(zhì)以得到滿足條件的探針的方法更為簡(jiǎn)便。此外，我們還發(fā)現(xiàn)在堿性條件下用雙氧水作還原劑可以合成小尺寸的AuNRs，彌補(bǔ)了在堿性條件下合成AuNRs的空缺25。由于無(wú)論采用哪種方法合成AuNRs都不可避免地會(huì)得到包含有各種長(zhǎng)徑比的AuNRs與具有其它形狀的AuNPs的混合物，為了獲得單分子成像必需的均一的AuNRs探針，我們發(fā)展了一種簡(jiǎn)便的、基于梯度分離法分離純化AuNRs的新方法26。

在諸多 PNPs之中，AuNPs的生物兼容性最好，但是其它金屬也有著金所不具備的優(yōu)異性能，比如銀的氧化活性，鉑的催化性能等27,28。因此，合成具有核殼結(jié)構(gòu)的金與其它金屬的復(fù)合納米材料可能會(huì)降低其它金屬的細(xì)胞毒性，從而使其特殊的性能可以在應(yīng)用于生物體內(nèi)的研究體系中得到施展，我們課題組也開(kāi)展了一些這方面的工作。最近的研究表明，活性氧系列分子(ROS)的生成與累積能夠引起細(xì)胞的氧化性損傷，這也是紫外線照射引起細(xì)胞損傷的主要途徑之一。因此，清除細(xì)胞內(nèi)的ROS以防止其累積對(duì)維護(hù)人體健康和防治疾病有著重要的意義。為了達(dá)到清除細(xì)胞內(nèi)ROS的目的，我們制備了一種表面帶有刺狀鉑納米點(diǎn)的AuNRs，相較于的單純的鉑納米顆粒，這種復(fù)合納米材料表現(xiàn)出更好的生物兼容性和催化性能，實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明其能有效地催化分解細(xì)胞內(nèi)的ROS從而緩解紫外線輻射所造成的細(xì)胞損傷29。我們還合成了金銀復(fù)合PNPs以實(shí)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)的H2S傳感和調(diào)節(jié)探針顏色響應(yīng)區(qū)間的目的，詳細(xì)的內(nèi)容見(jiàn)下一節(jié)。

3 PNPs在生化分析中的應(yīng)用

3.1 單分子檢測(cè)

由于在臨床診斷方面具有潛在的應(yīng)用價(jià)值，基于 PNPs聚集引起光譜變化所建立的特定核酸序列的檢測(cè)和定量方法已經(jīng)受到了大量的關(guān)注。如Alivisatos等所展示的那樣30，通過(guò)金―硫鍵把兩段核苷酸序列分別修飾到AuNPs表面之后，將含有與這兩段核苷酸序列互補(bǔ)的目標(biāo) DNA溶液與之混合，DNA的三明治雜交會(huì)使得AuNPs形成二聚體或者多聚體，從而允許研究者們通過(guò)AuNPs紫外吸收光譜的位移或者肉眼可分辨的顏色變化實(shí)現(xiàn)對(duì)DNA的檢測(cè)。這種比色檢測(cè)DNA的方法雖然簡(jiǎn)便，但是存在靈敏度不高、難以定量和無(wú)法同時(shí)實(shí)現(xiàn)多靶物檢測(cè)等缺點(diǎn)。本課題組使用一個(gè)帶有真彩 CCD的 DFM，以單個(gè)顏色編碼的AuNPs為探針，發(fā)展了一種基于耦合顆粒計(jì)數(shù)的DNA檢測(cè)方法，這種方法能夠?qū)Χ喾N目標(biāo)分子同時(shí)進(jìn)行動(dòng)態(tài)檢測(cè)(圖1(a, b)，而且靈敏度極高，檢測(cè)下限達(dá)到0.02 pmol·L-1(圖1(c))31。但是，由于該方法需要將PNP探針固定在玻片上來(lái)進(jìn)行計(jì)數(shù)，較為耗時(shí)，因此我們?cè)诤罄m(xù)工作中使用一個(gè)高亮度短脈沖的頻閃光源來(lái)代替顯微鏡標(biāo)配的鹵鎢燈，利用改造后的 DFM (FLDM)對(duì)溶液中的AuNPs進(jìn)行直接快速的計(jì)數(shù)，通過(guò)DNA雜交引起的AuNPs探針數(shù)量的減少與目標(biāo)DNA濃度之間的線性關(guān)系實(shí)現(xiàn)了對(duì)目標(biāo)DNA的檢測(cè)，從而解決了上述問(wèn)題32。但是，依靠探針數(shù)量減少的方法在目標(biāo)分子濃度很低時(shí)會(huì)存在較大的誤差?？紤]到球形的PNPs是各向同性的，經(jīng)線性偏振光照射之后，不能夠改變線性偏振光的振動(dòng)方向，因此在起偏器與檢偏器垂直的情況下，檢測(cè)器無(wú)法收集到球形PNPs的光學(xué)信號(hào)。當(dāng)球形PNPs發(fā)生聚集之后，其聚集體很不均一，具有很強(qiáng)的各向異性，因此能夠產(chǎn)生偏振散射信號(hào)。通過(guò)在之前的FLDM 上裝配起偏器和檢偏器，我們發(fā)展了一種基于頻閃光源的正交偏振DFM方法，由于檢測(cè)的是目標(biāo)分子導(dǎo)致的可檢測(cè)探針顆粒的增加，大大提高了檢測(cè)的精密度33。該方法對(duì)硫化物有著0.1 nmol·L-1的檢測(cè)下限，且動(dòng)態(tài)范圍跨越五個(gè)數(shù)量級(jí)。

圖1 利用顏色編碼的PNPs建立單分子檢測(cè)方法31Fig.1 Single molecule detection using color coded PNPs31.

3.2 多顆粒傳感

由于PNPs的LSPR散射光對(duì)自身性質(zhì)及周?chē)h(huán)境的變化都非常敏感，因此發(fā)展能夠快速且高通量地獲取單個(gè)納米顆粒的 LSPR散射光譜的技術(shù)是非常必要的。傳統(tǒng)的基于光譜儀的單顆粒光譜成像技術(shù)通量較低，只能獲取狹長(zhǎng)區(qū)域內(nèi)少數(shù)顆粒的光譜，因?yàn)槠浔匦枰褂萌肷洫M縫來(lái)排除背景光譜的干擾。在實(shí)現(xiàn)了高信背比單顆粒散射光成像的基礎(chǔ)上，我們通過(guò)去除入射狹縫，在顯微鏡檢測(cè)光路中加入透射光柵的方法，建立了一種能夠同時(shí)獲取多個(gè)單顆粒的散射光譜的技術(shù)。利用該技術(shù)，我們以單個(gè)AuNRs為探針實(shí)時(shí)觀察了H2O2氧化金的反應(yīng)，并且通過(guò)實(shí)時(shí)分析多個(gè)納米顆粒的動(dòng)態(tài)散射光譜，發(fā)現(xiàn)金納米棒在反應(yīng)中會(huì)以自催化的方式加快反應(yīng)的速率(圖2)34。

細(xì)胞內(nèi)環(huán)境復(fù)雜，經(jīng)常需要同時(shí)檢測(cè)不同區(qū)域的單顆粒光譜來(lái)監(jiān)測(cè)細(xì)胞內(nèi)某些物質(zhì)的區(qū)域濃度。作為一種特殊的氣體信號(hào)分子，H2S在許多生物系統(tǒng)中具有重要的調(diào)控作用。采用這種高通量的單顆粒暗場(chǎng)光譜成像技術(shù)，我們以具有核殼結(jié)構(gòu)的銀包金納米棒為探針，對(duì)細(xì)胞內(nèi)硫化物的局部濃度進(jìn)行了高靈敏地檢測(cè)。我們的方法基于對(duì)因形成硫化銀所導(dǎo)致的納米探針 LSPR光譜紅移的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)。特別地，我們發(fā)現(xiàn)單個(gè)金銀復(fù)合納米探針的光譜的變化與局部硫化物濃度以及在細(xì)胞內(nèi)環(huán)境復(fù)雜，經(jīng)常需要同時(shí)檢測(cè)不同區(qū)域的單顆粒光譜來(lái)監(jiān)測(cè)細(xì)胞內(nèi)某些物質(zhì)的區(qū)域濃度。作為一種特殊的氣體信號(hào)分子，H2S在許多生物系統(tǒng)中具有重要的調(diào)控作用。采用這種高通量的單顆粒暗場(chǎng)光譜成像技術(shù)，我們以具有核殼結(jié)構(gòu)的銀包金納米棒為探針，對(duì)細(xì)胞內(nèi)硫化物的局部濃度進(jìn)行了高靈敏地檢測(cè)。我們的方法基于對(duì)因形成硫化銀所導(dǎo)致的納米探針 LSPR光譜紅移的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)。特別地，我們發(fā)現(xiàn)單個(gè)金銀復(fù)合納米探針的光譜的變化與局部硫化物濃度以及在單個(gè)金納米棒表面生成硫化銀的反應(yīng)速率直接相關(guān)，從而首次以 nmol·L-1靈敏度實(shí)現(xiàn)了針對(duì)活細(xì)胞內(nèi)局域硫化物水平實(shí)時(shí)變化的高靈敏度、高選擇性和大動(dòng)態(tài)范圍的檢測(cè)(圖 3(a-e)35。雖然采用透射光柵能夠一次性地獲得多個(gè)納米顆粒的光譜，但是提取這些光譜卻要耗費(fèi)大量的時(shí)間，為此，我們建立了一種通過(guò)跟蹤直觀易確認(rèn)的顏色變化來(lái)更為簡(jiǎn)便地獲取多個(gè)顆粒的光譜變化信息的方法。由于顏色響應(yīng)的敏感區(qū)間主要位于可見(jiàn)光黃綠光區(qū)(530-590 nm)，我們通過(guò)用金銀核殼球形納米顆粒取代金銀核殼棒狀納米顆粒，把納米顆粒探針的響應(yīng)區(qū)間調(diào)整至顏色檢測(cè)最敏感的區(qū)間，從而能夠利用探針的顏色變化同時(shí)監(jiān)測(cè)大量顆粒對(duì)局域H2S的響應(yīng)，實(shí)現(xiàn)了更為簡(jiǎn)便的高通量的多顆粒硫化物傳感(圖3(f-h)36。根據(jù)顏色的形成機(jī)制，顏色并非一種可以測(cè)量的客觀物理量，而是一種主觀感覺(jué)。盡管人們能夠?qū)κ挛锏念伾纬晒沧R(shí)，但同一物體采用同一檢測(cè)器，其顏色表現(xiàn)都會(huì)因照明光源的不同而產(chǎn)生顯著差異。通過(guò)激光照明工程技術(shù)，采用多束窄帶光源的組合，我們發(fā)展了基于彩色CCD三基色分光的PNPs散射光檢測(cè)技術(shù)。該技術(shù)可以把顏色分辨能力提高一個(gè)數(shù)量級(jí)，使光譜差異較小、在白光下無(wú)法區(qū)分的AuNPs呈現(xiàn)出明顯的顏色差異，從而實(shí)現(xiàn)納米金粒徑以及團(tuán)聚解團(tuán)聚的高靈敏可視化檢測(cè)37。

圖2 實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)單個(gè)AuNRs的氧化動(dòng)力學(xué)過(guò)程34Fig.2 Real-time monitoring the dynamic oxidation process34.

圖3 體內(nèi)外的高通量硫化物傳感35,36Fig.3 High-throughput sulfide sensing in vitro and in vivo35,36.

4 基于PNPs的單細(xì)胞成像

當(dāng)PNPs應(yīng)用于單細(xì)胞成像時(shí)，由于細(xì)胞內(nèi)環(huán)境復(fù)雜，存在極大的背景干擾，因此如何提高成像的信噪比以及如何區(qū)分納米顆粒是在細(xì)胞膜上還是細(xì)胞內(nèi)部一直是一個(gè)亟待解決的問(wèn)題。此外，盡管 PNPs常被用作光散射探針以實(shí)時(shí)示蹤細(xì)胞內(nèi)的一些生命活動(dòng)和代謝過(guò)程38,39，但是其進(jìn)入細(xì)胞的途徑及原理一直以來(lái)都未得到進(jìn)一步的揭示。本課題組長(zhǎng)期開(kāi)展了有關(guān)細(xì)胞內(nèi)納米顆粒高分辨成像以及納米顆粒與細(xì)胞相互作用方面的研究，在此過(guò)程中研發(fā)出不少能夠示蹤納米顆粒在運(yùn)動(dòng)過(guò)程中的三維角度變化、實(shí)現(xiàn)突破衍射極限的超分辨成像和活細(xì)胞三維掃描成像等技術(shù)，這些先進(jìn)的成像系統(tǒng)將為單細(xì)胞成像方面的研究提供有力的幫助。

4.1 基于雙偏振成像檢測(cè)單個(gè)AuNR的三維取向

要考察單個(gè)納米顆粒在液固表面的運(yùn)動(dòng)行為，不僅需要實(shí)時(shí)跟蹤單個(gè)納米顆粒的平移運(yùn)動(dòng)，還需要準(zhǔn)確地知曉它們的三維角度，而傳統(tǒng)的暗場(chǎng)成像技術(shù)顯然不能提供這些信息。為此，我們發(fā)展了基于雙通道偏振成像檢測(cè)單個(gè)AuNR三維空間取向的技術(shù)。該技術(shù)的原理是把具有特定傳播方向的入射光照射到含有AuNRs的樣品上，由于AuNRs的長(zhǎng)軸方向與入射光之間存在著可用數(shù)學(xué)方程準(zhǔn)確描述的平面角與極化角，其產(chǎn)生的散射光信號(hào)號(hào)會(huì)同時(shí)包含具體的三維角度信息。通過(guò)在檢測(cè)光路中加入一塊雙折射晶體，就可以同時(shí)獲取該AuNR在兩個(gè)正交偏振方向上的散射光總強(qiáng)度和相對(duì)強(qiáng)度，從而推算出其平面角與極化角的大小。我們通過(guò)理論和實(shí)驗(yàn)證明平面照明模式和環(huán)形照明模式都可以獲取AuNRs的三維空間取向。采用該技術(shù)，我們考察了單個(gè)AuNR跨越細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞的全過(guò)程，獲得了該重要生物學(xué)行為的大量細(xì)節(jié)信息(圖 4)40。此外，我們還考察了牛血清蛋白修飾的單個(gè) AuNR與 C18修飾的玻片表面在色譜流動(dòng)相淋洗過(guò)程中的相互作用，發(fā)現(xiàn)二者之間不是簡(jiǎn)單的吸附與解吸附的關(guān)系，而是包含了許多復(fù)雜的動(dòng)力學(xué)狀態(tài)(圖5)41。

4.2 單個(gè)細(xì)胞的高分辨成像及三維掃描成像

有多種方法可以實(shí)現(xiàn)三維熒光成像，但其前提都是在接近零背景的情況下對(duì)熒光探針?lè)肿舆M(jìn)行選擇性的識(shí)別42。但是，由于檢測(cè)波長(zhǎng)與照射波長(zhǎng)相同，以AuNPs為探針的共振光散射成像不能使用波長(zhǎng)濾光片來(lái)消除背景瑞利散射的干擾。我們開(kāi)發(fā)了一種雙波長(zhǎng)差異成像方法來(lái)解決這個(gè)問(wèn)題43。如圖6(a, c)所示，在波長(zhǎng)分別為473 nm和532 nm的激光照射下，純的細(xì)胞溶解產(chǎn)物的雙通道圖像幾乎沒(méi)有表現(xiàn)出強(qiáng)度的變化。相比之下，純的AuNPs的雙通道圖像則展現(xiàn)出很大的強(qiáng)度變化(圖6(b, d)?；诖?，我們可以通過(guò)雙波長(zhǎng)成像模式下強(qiáng)度差異的大小來(lái)有效地區(qū)分活細(xì)胞中的細(xì)胞背景與AuNP探針，實(shí)現(xiàn)對(duì)單個(gè)小AuNP探針的高靈敏檢測(cè)(圖6(e, f)。

圖4 直接成像單個(gè)AuNR的跨膜動(dòng)力學(xué)過(guò)程40Fig.4 Direct imaging of transmembrane dynamics of single gold nanorod40.

圖5 直接觀察液固表面上單個(gè)蛋白質(zhì)包被的納米顆粒的方向動(dòng)力學(xué)41Fig.5 Direct observation of the orientation dynamics of single protein-coated nanoparticles at liquid/solid interfaces41.

圖6 活細(xì)胞中PNPs的無(wú)背景雙波長(zhǎng)差異成像43Fig.6 Noise-free dual-wavelength difference imaging of plasmonic resonant nanoparticles in living cells43.

為了實(shí)現(xiàn)高分辨暗場(chǎng)成像，我們還采用正交偏振光檢測(cè)技術(shù)，基于AuNRs的LSPR散射光強(qiáng)度對(duì)其空間取向的敏感性建立了對(duì)各向異性AuNPs進(jìn)行準(zhǔn)確定位和超分辨成像的新方法。正交偏振成像可以有效地消除來(lái)自球形納米顆粒、玻璃基底和細(xì)胞內(nèi)部的瑞利散射光背景(圖7)。我們證明該技術(shù)可實(shí)現(xiàn)對(duì)單個(gè)AuNRs 15 nm的定位精度和水平方向上最小80 nm左右的分辨率44。除此之外，當(dāng)采用高數(shù)值孔徑的物鏡鏡頭時(shí)，通過(guò)使用一個(gè)步進(jìn)旋轉(zhuǎn)電機(jī)來(lái)精確地控制 Z方向上的距離，該技術(shù)還可以對(duì)單個(gè)AuNRs進(jìn)行選擇性地三維成像，從而實(shí)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)AuNR探針三維分布的高分辨定位45。

4.3 探究單個(gè)PNPs與細(xì)胞外環(huán)境的相互作用

采用傳統(tǒng)的單分子暗場(chǎng)成像技術(shù)，我們實(shí)時(shí)原位觀察了50-130 nm的AuNPs與癌細(xì)胞的相互作用。在AuNPs被癌細(xì)胞內(nèi)吞的過(guò)程中，它們?cè)谝詳U(kuò)散的方式到達(dá)細(xì)胞膜之前經(jīng)歷了一個(gè)明顯的減速過(guò)程。通過(guò)光學(xué)切割，我們發(fā)現(xiàn)這層能夠減慢AuNPs運(yùn)動(dòng)的細(xì)胞外周介質(zhì)厚度大約為3-20 μm46。進(jìn)一步的研究表明，這個(gè)以前被人們所忽略的、在光學(xué)顯微鏡下很難觀察到的介質(zhì)層其實(shí)是以多糖聚合物透明質(zhì)酸為主要成分的細(xì)胞膜外基質(zhì)(PCM)，它是細(xì)胞個(gè)體的緩沖區(qū)，對(duì)細(xì)胞外納米顆粒的捕獲和內(nèi)吞有重要影響。當(dāng)PCM存在時(shí)，AuNPs被細(xì)胞捕獲和內(nèi)吞的數(shù)量較多；但當(dāng)PCM被溶解掉之后，AuNPs被細(xì)胞捕獲和內(nèi)吞的數(shù)量就相對(duì)較少(圖8)。通過(guò)對(duì)單個(gè)納米顆粒的實(shí)時(shí)示蹤，我們發(fā)現(xiàn)PCM的主要作用是“緩沖減速”，即把在一定尺寸范圍內(nèi)(50-200 nm)的AuNPs的擴(kuò)

散速率，都調(diào)整到與細(xì)胞膜上蛋白受體的擴(kuò)散速率相接近的水平，即0.1 μm2·s-1，從而有利于受體與AuNPs的結(jié)合，這表明PCM似乎具有某種程度的主動(dòng)性。不僅如此，我們還發(fā)現(xiàn)能夠抑制細(xì)胞內(nèi)吞納米顆粒的條件和試劑也同時(shí)會(huì)抑制PCM對(duì)納米顆粒的捕獲。所有這些結(jié)果意味著細(xì)胞內(nèi)吞納米顆粒這一重要生理功能是由以細(xì)胞膜為核心，包括細(xì)胞骨架和PCM在內(nèi)的多種細(xì)胞內(nèi)外結(jié)構(gòu)共同完成的，是亞細(xì)胞層面上的一層精巧的自組織行為，這對(duì)于我們加深對(duì)細(xì)胞整體功能的認(rèn)識(shí)具有深刻的意義47,48。

4.4 活細(xì)胞中機(jī)械力轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程的可視化

圖7 基于各向異性PNPs的亞衍射極限成像44Fig.7 Subdiffraction-limited imaging based on anisotropic PNPs44.

圖8 細(xì)胞膜外基質(zhì)對(duì)納米顆粒滯留和攝取的增強(qiáng)效應(yīng)47Fig.8 Pericellular matrix enhances retention and cellular uptake of nanoparticles47.

活細(xì)胞中的機(jī)械力信號(hào)被視為諸多生理功能的生物學(xué)基礎(chǔ)，想要更好地理解這些過(guò)程的本質(zhì)，就要對(duì)活細(xì)胞內(nèi)的局域機(jī)械力轉(zhuǎn)導(dǎo)的動(dòng)力學(xué)過(guò)程進(jìn)行成像和測(cè)定。通過(guò)合成以彈性分子PEG連接的兩個(gè)金納米顆粒構(gòu)成的納米彈簧為探針，我們利用暗場(chǎng)光譜成像技術(shù)對(duì)納米彈簧因受細(xì)胞骨架的收縮或伸展的影響而產(chǎn)生的光譜變化進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，從而可視化了活細(xì)胞中由外加刺激信號(hào)觸發(fā)的細(xì)胞膜上局域機(jī)械力的轉(zhuǎn)導(dǎo)活動(dòng)49。如圖9(ac)所示，納米彈簧的一端與玻片底部相連，另一端通過(guò)抗體與細(xì)胞膜上特定受體相連，當(dāng)細(xì)胞因外部刺激而產(chǎn)生不均勻的收縮或伸展時(shí)，一對(duì)納米彈簧中兩個(gè)納米顆粒之間的距離也會(huì)隨之改變，從而導(dǎo)致兩者之間的等離子耦合效應(yīng)的強(qiáng)度變化，根據(jù)納米彈簧LSPR散射光譜變化的大小就可以得出實(shí)時(shí)的生物機(jī)械力大小。圖9(d)展示了在ROS刺激下活細(xì)胞中不同區(qū)域和不同時(shí)間段內(nèi)的機(jī)械力信號(hào)變化。我們預(yù)期該策略也適用于探測(cè)活體組織中其它方式的機(jī)械力信號(hào)傳導(dǎo)與調(diào)節(jié)。

5 單層照明暗場(chǎng)成像與微通道檢測(cè)聯(lián)用系統(tǒng)的構(gòu)建

我們?cè)趥鹘y(tǒng)的暗場(chǎng)及光片照明顯微鏡的基礎(chǔ)上，通過(guò)對(duì)光源、檢測(cè)器以及其它光學(xué)元件的選擇和優(yōu)化，開(kāi)發(fā)出一套具有高靈敏度、高信噪比、高時(shí)空分辨率以及高各向異性分辨率的激光單層照明暗場(chǎng)成像體系，如圖10所示。整個(gè)顯微系統(tǒng)通過(guò)直接利用超連續(xù)白光激光光片照射樣品的方式來(lái)進(jìn)行暗場(chǎng)散射成像，由此獲取納米探針的數(shù)目、散射光顏色、光譜和強(qiáng)度等信息，為單個(gè)顆粒的實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)提供了一種全新的研究方法。比如，利用所搭建的激光單層照明暗場(chǎng)成像系統(tǒng)，結(jié)合毛細(xì)管-缺口管陣列進(jìn)樣系統(tǒng)，我們考察了單個(gè)AuNRs在氧化過(guò)程中的動(dòng)力學(xué)行為，通過(guò)分析其電遷移率、散射光顏色、光譜和強(qiáng)度等變化信息的變化趨勢(shì)，我們發(fā)現(xiàn)表面帶有不同修飾物的AuNRs的氧化行為之間的差異以及AuNRs在氧化過(guò)程中表面所帶的電荷總量的變化，進(jìn)一步地揭示了AuNRs氧化的反應(yīng)機(jī)理50。

圖9 活細(xì)胞中局域機(jī)械力轉(zhuǎn)導(dǎo)的可視化49Fig.9 Visualization of localized mechanical force transduction in live cells49.

圖10 用于毛細(xì)管電泳檢測(cè)的超連續(xù)激光單層照明暗場(chǎng)成像系統(tǒng)的搭建原理50Fig.10 Schematic of the supercontinuum laser light-sheet plasmonic imaging system for capillary electrophoresis detection50.

6 總結(jié)與展望

PNPs因?yàn)榫哂袃?yōu)異的光學(xué)性質(zhì)、催化性能和生物兼容性而逐漸從基礎(chǔ)科學(xué)研究走向?qū)嶋H應(yīng)用之中，其在功能材料、化學(xué)傳感、生物醫(yī)藥和光學(xué)成像等領(lǐng)域已經(jīng)得到了廣泛的應(yīng)用。PNPs的LSPR響應(yīng)對(duì)周?chē)h(huán)境極其敏感，這也使得我們能夠利用其消光或散射光譜的變化對(duì)一些有害的物質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)。值得注意的是，暗場(chǎng)成像技術(shù)的應(yīng)用和優(yōu)化在最佳條件下可使視野中的每一個(gè)PNP都能夠作為單獨(dú)的傳感器，這種以單個(gè)PNPs的LSPR散射光為信號(hào)的分析手段因具有常規(guī)方法難以企及的靈敏度和高通量而備受關(guān)注，具有非凡的發(fā)展空間?，F(xiàn)有的熒光探針，包括最近興起的碳納米點(diǎn)，都存在光穩(wěn)定性差或光信號(hào)較弱等缺點(diǎn)，相比之下，PNPs的散射光強(qiáng)度很高且非常穩(wěn)定，更重要的是每一個(gè)PNPs都可以作為單獨(dú)的探針而對(duì)樣品的不同區(qū)域進(jìn)行成像，使得我們能夠?qū)崟r(shí)原位長(zhǎng)時(shí)間地觀測(cè)同一樣品中的多個(gè)區(qū)域。因此，基于PNPs的單分子光譜成像技術(shù)必將在復(fù)雜體系的成像領(lǐng)域中得到越來(lái)越多的重視。特別地，在近來(lái)非?；钴S的活體組織和智能材料研究中，單個(gè)PNP的大小相比于材料自身的尺寸基本上可以忽略不計(jì)，從而更能夠客觀地反映出材料內(nèi)部的結(jié)構(gòu)和功能信息。此外，目前常用的單顆粒PNP探針多為金銀納米顆?；蚱鋸?fù)合材料，很少有研究用到其它PNPs，因此該領(lǐng)域還有很大的發(fā)展前景，采用除金銀納米顆粒之外的單顆粒PNP探針將能進(jìn)一步地拓寬單顆粒光散射成像技術(shù)的應(yīng)用范圍。另一方面，目前的單顆粒暗場(chǎng)成像技術(shù)雖能實(shí)時(shí)記錄多個(gè)PNP探針的動(dòng)態(tài)行為，對(duì)樣品的多個(gè)區(qū)域進(jìn)行同時(shí)監(jiān)測(cè)，但尚不能夠?qū)γ看斡^測(cè)獲得的海量數(shù)據(jù)進(jìn)行全面快速的分析，主要還是依賴(lài)研究者的個(gè)人經(jīng)驗(yàn)選取個(gè)別有代表性的顆粒進(jìn)行繁瑣的手動(dòng)分析，從提取的有限信息中推斷出普遍性的結(jié)論。但是，隨著大數(shù)據(jù)分析技術(shù)的發(fā)展和普及，我們有望利用先進(jìn)的數(shù)據(jù)挖掘技術(shù)，對(duì)每一單顆粒探針的時(shí)空軌跡進(jìn)行詳盡的分析，并通過(guò)數(shù)據(jù)可視化技術(shù)，快速準(zhǔn)確地從大量探針的各種時(shí)空變化過(guò)程之中提取出所需要的信息。因此，將單顆粒檢測(cè)技術(shù)與大數(shù)據(jù)分析相結(jié)合，必然能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)復(fù)雜的生命過(guò)程更為細(xì)致的研究。總之，PNPs在生化分析和生物成像等領(lǐng)域仍舊有著巨大的發(fā)展?jié)摿?，而單個(gè)PNP光散射探針的應(yīng)用也為單分子光譜技術(shù)注入了一股新鮮的活力。我們有理由相信，PNPs將會(huì)在未來(lái)更廣泛地應(yīng)用于現(xiàn)實(shí)生活中快速、簡(jiǎn)便的分析與成像之中。

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