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        Treg在亞急性甲狀腺炎發(fā)病免疫機(jī)制中的作用

        2018-01-29 07:15:38王小玲呂合作甘懷勇張小鳳徐二琴裴曉艷金國璽
        關(guān)鍵詞:蚌埠免疫抑制腺瘤

        王小玲,呂合作,甘懷勇,項 平,張小鳳,徐二琴,裴曉艷,金國璽*

        (蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院 1.內(nèi)分泌科;2.檢驗科;3.病理科;4.中心實驗室;5.蚌埠醫(yī)學(xué)院診斷學(xué)教研室, 安徽 蚌埠 233004)

        亞急性甲狀腺炎(subacute thyroiditis, SAT)是一種病因及發(fā)病機(jī)制未明的疾病,特征性的表現(xiàn)為甲狀腺部位的疼痛和壓痛,一般認(rèn)為其與病毒感染及免疫因素有關(guān),可能為病毒感染后出現(xiàn)了免疫機(jī)制異常。SAT的甲狀腺損傷似乎是細(xì)胞毒性T細(xì)胞識別病毒與宿主細(xì)胞膜抗原復(fù)合物的結(jié)果,細(xì)胞免疫反應(yīng)可能在SAT的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要作用[1]。調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory T-lymphocytes,Treg)在多種自身免疫性疾病的發(fā)生中起著重要的作用,它能夠釋放白細(xì)胞介素- 10(interleukin- 10,IL- 10)和轉(zhuǎn)化生長因子β(transforming growth factor beta,TGF-β)來抑制T細(xì)胞及抗原呈遞細(xì)胞的功能,降低炎性反應(yīng)及抗體的產(chǎn)生,發(fā)揮免疫抑制效應(yīng)。叉頭蛋白3(Foxp3)作為Treg的特異性標(biāo)志分子,在其調(diào)節(jié)免疫自穩(wěn)中起著關(guān)鍵的作用。前列腺素E2(prostaglandin E2,PGE2)是一種炎性致痛因子,能抑制成纖維細(xì)胞的增殖分化及膠原的合成,對腫瘤壞死因子α和TGF-β致炎致纖維化產(chǎn)生負(fù)性影響[2]。本研究擬通過檢測外周血中Treg的比例、炎性反應(yīng)因子的水平以及SAT組織中Treg的分布情況,以探討Treg在SAT發(fā)病的免疫機(jī)制中可能的作用。

        1 材料與方法

        1.1 材料

        1.1.1 實驗樣本:用于Treg及細(xì)胞因子檢測的SAT外周血為2016年1月至2016年12月在蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科門診及住院部收集,均為初發(fā)患者,且半年內(nèi)未使用影響免疫的藥物。SAT 46例,男13例,女33例,年齡范圍26~67歲,平均年齡(46.9±8.6)歲。對照組15名,為同期于體檢中心收集的外周血標(biāo)本,男4名,女11名,年齡范圍27~62歲,平均年齡(43.4±11.8)歲。

        用于Foxp3檢測的SAT及對照者甲狀腺標(biāo)本分別來源于蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院外科手術(shù)的SAT甲狀腺組織和甲狀腺腺瘤瘤旁正常甲狀腺組織,均為石蠟包埋保存,并經(jīng)病理確診。其中,SAT 29例,男6例,女23例,年齡范圍29~62歲,平均年齡(46.7±7.7)歲。對照組20名,男4名,女16名,年齡范圍32~64歲,平均年齡(47.37±9.7)歲。

        所有SAT病例均經(jīng)臨床表現(xiàn)、實驗室檢查、查體及影像學(xué)檢查等確診。符合2007年中國甲狀腺疾病診治指南中SAT的診斷標(biāo)準(zhǔn)[3]。標(biāo)本采集已獲得蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)及受試者知情同意。

        1.1.2 主要試劑:Treg檢測試劑盒(Anti-CD25-FITC、Anti-CD4-PerCP、Anti-CD127-PE及IgG1-FITC,BD公司);小鼠抗人Foxp3單克隆抗體[236A/E7](Abcam公司);EnVision試劑盒(邁新試劑公司);ELISA試劑盒(IL- 10、TGF-β1及PGE2,Elabscience公司)。

        1.2 方法

        1.2.1 甲狀腺功能、ESR及CRP的檢測:用化學(xué)發(fā)光法檢測甲狀腺功能,用魏氏法檢測血沉(erythrocyte sedimentation rate, ESR),用速率散色比濁法檢測C反應(yīng)蛋白(C reactive protein, CRP)。

        1.2.2 外周血Treg比例的測定:清晨收集EDTA-K2抗凝血標(biāo)本2 mL,6 h內(nèi)進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)測定。取2只試管,管1加入Anti-CD4-PerCP及IgG1-FITC各20 μL,管2加入Anti-CD4-PerCP和Anti-CD25-FITC各20 μL及Anti-CD127-APC 5 μL,2管分別加入全血100 μL混勻,置于35 ℃水浴箱避光孵育15 min;加入FACSLysing溶血液2 mL,水浴箱中避光孵育10 min;1 800 r/min離心5 min,棄上清;加入PBS 1 mL,1 800 r/min離心5 min,棄上清,加入PBS 1 mL,行流式細(xì)胞儀檢測。以前向和側(cè)向散射熒光設(shè)門,獲取淋巴細(xì)胞,分析CD4+T細(xì)胞占淋巴細(xì)胞的比例。再獲取CD4+T細(xì)胞,分析CD4+CD25+T細(xì)胞及CD4+CD25+CD127-Treg所占的比例。

        1.2.3 外周血血清IL- 10、TGF-β1和PGE2的濃度測定:肝素鈉抗凝管留取空腹血3 mL,1 000×g離心15 min得上清后置于-80 ℃冰箱凍存。分別用IL- 10、TGF-β1和PGE2的ELISA檢測試劑盒對血清進(jìn)行測定,嚴(yán)格按照說明書操作。

        1.2.4 甲狀腺組織中Foxp3表達(dá)的測定:多聚甲醛固定新鮮甲狀腺組織,石蠟包埋;用HE染色及EnVision免疫組化染色法染色。切片機(jī)進(jìn)行厚度4 μm切片,脫蠟,水化;抗原修復(fù),高壓鍋沸騰2 min,自然冷卻;過氧化物酶試劑阻斷;1∶100配置小鼠抗人Foxp3單克隆抗體試劑,并滴加至玻片上;37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)1 h;滴加酶標(biāo)羊抗小鼠IgG聚合物;DAB顯色2~3 min;蘇木精復(fù)染液復(fù)染;脫水后封片劑封固。

        判斷標(biāo)準(zhǔn)[4]以光鏡下淋巴細(xì)胞核出現(xiàn)棕黃色顆粒為Foxp3陽性細(xì)胞,以高倍鏡不重復(fù)視野Foxp3陽性細(xì)胞數(shù)為判定標(biāo)準(zhǔn),每個標(biāo)本選擇5個高倍視野,取平均值,平均值≤3為陰性,>3為陽性。

        1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

        2 結(jié)果

        2.1 甲狀腺功能、ESR及CRP比較

        SAT組TT3、TT4、FT3和FT4均高于對照組,TSH低于對照組,ESR和CRP高于對照組(P<0.05)(表1)。

        2.2 SAT患者外周血Treg比例

        SAT組CD4+CD25+CD127-Treg比例明顯低于對照組(P<0.05)(表2,圖1)。

        2.3 血清中細(xì)胞因子IL- 10、TGF-β1和PGE2的濃度比較

        SAT組血清中TGF-β1濃度明顯高于對照組(P<0.05)(表3)。

        2.4 甲狀腺組織中Foxp3蛋白的表達(dá)

        SAT組甲狀腺組織中有Foxp3蛋白表達(dá),細(xì)胞核染色表現(xiàn)為黃褐色顆粒,呈分散分布,少數(shù)灶性分布,與淋巴細(xì)胞浸潤多少有關(guān),且分布于T細(xì)胞分布區(qū)域。而甲狀腺腺瘤組織及腺瘤旁正常甲狀腺組織基本無Foxp3蛋白表達(dá),僅少數(shù)病例表達(dá)陽性。SAT組Foxp3蛋白陽性率為72.41%,明顯高于腺瘤組及對照組(P<0.0125)(表4, 圖2)。

        3 討論

        研究證實,SAT患者循環(huán)中存在直接針對TSHR的抗體,并證實存在針對甲狀腺抗原的致敏T淋巴細(xì)胞[5]。一些針對免疫系統(tǒng)的新療法會導(dǎo)致SAT,提示有免疫因素參與其中[6]。目前已知Treg在體內(nèi)能夠發(fā)揮免疫抑制作用,維持自身耐受及抑制抗腫瘤免疫反應(yīng)。Treg的數(shù)量異常及功能缺陷在多種疾病的發(fā)病中起了重要的作用,如Graves病(Graves disease,GD)、丙型肝炎病毒(HCV)和橋本氏甲狀腺炎(Hashimoto’s thyroiditis,HT)等。Graves病患者體內(nèi)存在Treg數(shù)量減少或者功能的缺陷[7]?;謴?fù)期HCV慢性病患者的Treg數(shù)量與持續(xù)感染有關(guān),其比例顯著增加能夠抑制HCV特異的CD8+T細(xì)胞[8]。人Treg可抑制T細(xì)胞對HIV和巨細(xì)胞病毒的抗原特異性免疫應(yīng)答[9]。推測,慢性病毒感染將引起抑制抗病毒免疫的Treg產(chǎn)生。但是,Treg在SAT發(fā)生發(fā)展中的變化及意義如何?至今沒有相關(guān)的研究報道。TGF-β1、IL- 10和PGE2均可誘導(dǎo)初始T細(xì)胞轉(zhuǎn)化為Treg并表達(dá)Foxp3,在維持和增強(qiáng)Treg的免疫抑制作用中起著重要的作用[10- 12]。為探討SAT發(fā)病中Treg轉(zhuǎn)化率的變化以及影響Treg 轉(zhuǎn)化的細(xì)胞因子的相應(yīng)變化,進(jìn)行了相關(guān)研究。

        表1 SAT組與對照組甲狀腺功能、ESR及CRP的比較Table 1 Comparison of thyroid function, ESR and CRP between SAT group and control group(±s)

        *P<0.05 compared with control group.

        表2 SAT組與對照組外周血Treg比例的比較Table 2 Comparison of proportion of Treg in peripheral blood between SAT group and control group(±s,%)

        *P<0.05 compared with control group.

        A.the proportion of CD4+CD25+T cells of SAT group; B.the proportion of CD4+CD25+T cells of control group; C.the proportion of CD4+CD25+CD127-Treg of SAT group; D.the proportion of CD4+CD25+CD127-Treg of the control group

        圖1 SAT組與對照組外周血Treg比例的比較Fig 1 Comparison of proportion of Treg in peripheral blood between SAT group and control group

        *P<0.05 compared with control group.

        表4 SAT組、腺瘤組及對照組甲狀腺組織中Foxp3蛋白的表達(dá)

        #P<0.0125 compared with adenoma group;*P<0.0125 compared with control group.

        實驗結(jié)果顯示,SAT組患者外周血中Treg明顯降低。Treg降低后,免疫抑制作用減弱,易出現(xiàn)免疫紊亂。血漿中TGF-β1水平明顯升高, 與外周血Treg減少相互矛盾,這在GD和HT中亦可見,可能與TGF-β1反饋性升高有關(guān),以誘導(dǎo)CD4+CD25-T細(xì)胞轉(zhuǎn)化為CD4+CD25+T細(xì)胞,減輕自身免疫反應(yīng)[13]。

        A.thyroid tissue of SAT; B.thyroid tissue of adenoma; C.thyroid tissue adjacent to adenoma圖2 SAT組、腺瘤組及對照組甲狀腺組織中Foxp3蛋白的表達(dá)

        SAT組患者甲狀腺組織中Foxp3蛋白表達(dá)明顯增多,此與血液中Treg減少相悖,這在HT中亦曾被報道[14],可能為甲狀腺產(chǎn)生免疫破壞后,血液中的Treg轉(zhuǎn)移到甲狀腺組織,從而增強(qiáng)病變部位的免疫抑制作用,以調(diào)節(jié)免疫機(jī)制紊亂。

        推測SAT發(fā)病的機(jī)制可能為病毒感染誘發(fā)了免疫機(jī)制異常,Treg減少,對T細(xì)胞及抗原呈遞細(xì)胞的抑制作用減弱,1型T輔助細(xì)胞與細(xì)胞毒性T細(xì)胞活性增高,破壞甲狀腺濾泡,導(dǎo)致SAT的發(fā)生[1,15]。本研究證實,Treg減少可能是SAT發(fā)病的始動因素,當(dāng)免疫炎性反應(yīng)劇烈時,可伴有代償性的TGF-β1升高,至于TGF-β1升高以后會不會及時地上調(diào)Treg的分化和成熟,產(chǎn)生免疫保護(hù)作用及其在SAT轉(zhuǎn)歸中的作用機(jī)制,是下一步的研究方向。

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