張 怡，周 彪，郭政宏，龍 虎，嚴亨秀

(西南民族大學， 四川 成都 610041)

FLT3配體(ligand of FMS-like tyrosine kinase 3，F(xiàn)L)是刺激樹突狀細胞(dendritic cells，DCs)成熟的主要的幾種生長因子之一[1],FL/FLT3信號使DCs維持特定的功能。因此，F(xiàn)LT3可以作為靶分子，通過影響DCs調(diào)節(jié)，進而調(diào)節(jié)免疫應答。有研究使用FLT3抑制劑治療急性髓性白血病[2]；還有使用FLT3抑制劑CEP- 701抑制DCs治療C57小鼠的實驗性自身免疫性腦脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE)[3]，有效改善了發(fā)病小鼠的癥狀，但其作用機制仍不清楚。

DCs是機體內(nèi)最強的專職抗原遞呈細胞，可以有效刺激初始性T細胞活化，是機體免疫反應的主要啟動者。DCs作為T細胞的上游，特定的DCs亞型刺激T細胞分化為特定亞型。比如，DCs可以分泌IL- 23、TGF-β和IL- 6等細胞因子，刺激T細胞分化為Th17細胞，Th17細胞在特定的免疫機制中發(fā)揮重要的作用[4]。因此，以DCs為靶細胞改善機體的免疫力將是一種比以T細胞為靶細胞更為精確和有效的治療免疫性疾病的方法。

本研究通過向K14-VEGF轉(zhuǎn)基因小鼠皮下注射FMS樣酪氨酸激酶3陽性樹突狀細胞(CD11c+DCs)，觀察并分析CD11c+DCs在銀屑病模型鼠中的作用及其免疫機制。

1 材料與方法

1.1 材料

SPF級K14-VEGF轉(zhuǎn)基因小鼠，6周齡雄性，體質(zhì)量約為25 g(四川大學生物治療國家重點實驗室饋贈)是自身性免疫性疾病銀屑病的轉(zhuǎn)基因鼠模型[5]。K14-VEGF轉(zhuǎn)基因小鼠具有穩(wěn)定的銀屑病臨床表現(xiàn)，幼鼠在最初不會表現(xiàn)銀屑病的臨床癥狀，3月齡小鼠的耳朵和頸部小部分皮膚開始出現(xiàn)銀屑病樣改變，包括表皮增生，表皮分化能力改變，血管黏附分子上調(diào)等特征。5月齡以上小鼠銀屑病樣癥狀加重，背部發(fā)病，病理區(qū)逐漸擴大，直至最后紅斑結(jié)痂滲出液覆蓋耳朵和背部大面積皮膚。

飼養(yǎng)小鼠的動物房溫度為(25±1)℃，相對濕度為60%±10%，自由攝食與飲水。

小鼠白細胞介素4(IL- 4)，小鼠粒細胞巨噬細胞集落因子(GM-CSF)和小鼠FLT3配體(FL)(PeproTech公司)；亞美尼亞倉鼠抗小鼠CD11c抗體(Abcom公司)；兔抗小鼠FLT3抗體(Santa Cruz公司)；羊抗兔-FITC熒光標記二抗和蛋白A熒光-TRITC熒光標記二抗(武漢博士德生物工程有限公司).

1.2 方法

1.2.2 體外CD11c+DCs的誘導培養(yǎng)：為了獲得純度較高的CD11c+DCs，用IL- 4、GM-CSF和FL等細胞因子誘導DCs定向分化及成熟，采用半量換液法去除漂浮的非樹突狀細胞，棄去的懸浮細胞中主要包括T細胞、B細胞、粒細胞、死細胞、細胞碎片及少量單核細胞和樹突狀細胞。具體方法是取BABL/c小鼠雙側(cè)股骨和脛骨內(nèi)骨髓細胞。細胞計數(shù)，調(diào)整細胞為(1～2)×10-6/mL，使用含有IL- 4(20 ng/mL)、GM-CSF(20 ng/mL)和FL(FLT3配體)(10 ng/mL)的RPMI 1640(含血清&抗生素)培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞，2、4、6和8 d吸取最上層培養(yǎng)基半量換液，第9天收細胞，流式抗體CD11c-PerCP和FLT3-PE染色，使用流式細胞計量術(shù)分析。

1.2.3 K14-VEGF小鼠皮下注射CD11c+DCs：選取12只6周齡未發(fā)病K14-VEGF轉(zhuǎn)基因小鼠，隨機分為對照組(n=6)和實驗組(n=6)。重復1.2.2中的方法培養(yǎng)CD11c+DCs細胞，分別于第1天和第8天注射入實驗組小鼠頸部皮下[6]，對照組小鼠皮下注射培養(yǎng)基作為對照。

1.2.4 對實驗小鼠進行分析：觀察小鼠臨床表現(xiàn)以及病理區(qū)變化情況，依據(jù)小鼠銀屑病樣皮損面積和疾病嚴重程度(psoriasis area and severity index，PASI)評分標準給予小鼠皮損處紅斑(erythema)、鱗屑(scales)和浸潤增厚程度(thickness)0～4的積分: 0，無；1，輕度；2，中度; 3，重度; 4，極重度。將3者積分相加得到總積分(0～12)，紅斑根據(jù)顏色深淺，鱗屑根據(jù)覆蓋面積占發(fā)病皮膚總面積的比例計算，對各組小鼠皮損總積分取平均值后繪制趨勢線。

注射后第21天取小鼠耳部、頸部以及頸部至背部約1.5 cm的皮膚做石蠟切片，進行HE染色，檢測組織學變化；流式細胞術(shù)分析實驗組和對照組小鼠骨髓、血液、脾臟和頜下淋巴結(jié)中的T淋巴細胞和DCs的變化；免疫熒光法分析小鼠皮損中CD4、CD8、IL- 17a、IFN-γ和CD31的變化；HE染色方法觀察小鼠心、肝、脾、肺和腎的變化。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 CD11c+DCs表型鑒定

成熟DCs形狀似星形、多邊形或梭形， FLT3分子和CD11c分子分布于成熟CD11c+DCs表面。圖1C為熒光雙染圖片，綠色熒光(圖1A)標記的FLT3分子和紅色熒光(圖1B)標記的CD11c分子同時在CD11c+DCs細胞膜顯色，反映FLT3分子和CD11c分子在DCs膜上表達陽性。K14-VEGF小鼠皮損中90% FLT3陽性細胞表達CD11c。

A. FLT3-FITC; B. CD11c-PE; C. merge image of double immunofluorescence圖1 免疫熒光雙染法對CD11c+DCs進行表型鑒定Fig 1 Phenotype identification of CD11c+DCs by immunofluorescence

2.2 CD11c+DCs對K14-VEGF轉(zhuǎn)基因小鼠的影響

2.2.1 CD11c+DCs流式細胞術(shù)檢測：圖2A為培養(yǎng)中的DCs，可見明顯的樹突狀分支和模糊的細胞核。

誘導培養(yǎng)至第9天，CD11c+DCs細胞比率為80.23%±3.10%(n=6)(圖2B)。

選取適合的截止高度角，保障算法的可用性，設置好檢測門限閾值，可以有效地進行周跳的探測。成功探測到周跳后，利用Chebyshev多項式擬合進行計算修復。值得注意的是，本文的方案可以有效地對獨立的單頻接收機發(fā)生的周跳進行探測和修復，減小了對接收機性能的要求，增強系統(tǒng)的可靠性。

A.form of DCs; B.purity detection of bone marrow cells by flow cytometry圖2 IL- 4、GM-CSF和FL誘導分化后的CD11c+DCsFig 2 CD11c+DCs induced by IL- 4, GM-CSF and FL

2.2.2 K14-VEGF轉(zhuǎn)基因小鼠注射CD11c+DCs后的臨床表現(xiàn)：實驗組小鼠在第3天耳朵面部出現(xiàn)少量紅斑，對照組小鼠無變化。隨著時間延長，實驗組小鼠銀屑病樣皮損逐漸加重，在第7天已有小鼠兩耳間出現(xiàn)明顯紅斑，少量的結(jié)痂，皮膚的增厚。對照組小鼠仍無任何銀屑病樣臨床癥狀。第8天進行第2次細胞注射，注射部位與第1次相同，繼續(xù)觀察小鼠。在第21天時實驗組小鼠耳朵背部皮膚出現(xiàn)紅斑，結(jié)痂較多，皮膚有滲出液且較厚，嚴重的有血點出現(xiàn)，而對照組只有部分小鼠耳朵面部剛剛出現(xiàn)紅斑(圖3)。

實驗組小鼠比對照組小鼠發(fā)病快，且發(fā)病程度十分嚴重。第21天時，實驗組小鼠紅斑平均積分、鱗屑的平均積分和浸潤增厚程度的平均積分均顯著高于對照組。實驗組小鼠PASI的平均總積分顯著低于對照組(P<0.01)(表1)。

2.2.3 小鼠皮損處組織學變化:第21天所有實驗小鼠的耳朵和背部皮膚切片組織學觀察并統(tǒng)計結(jié)果如下。

2.2.3.1 實驗組小鼠耳部和背部表皮層厚度增加。第21天實驗組小鼠耳朵皮膚表皮厚度為(29±4)μm，顯著高于對照組的(11±2)μm(P<0.01)(圖4A)。

實驗組小鼠背部皮膚表皮厚度為(25±3)μm，顯著高于對照組(9±1)μm(P<0.01)(圖4B)。

2.2.3.2 實驗小鼠耳朵棘突明顯增加。皮膚中發(fā)現(xiàn)棘突結(jié)構(gòu)是人類銀屑病患者最典型且最容易識別的組織學表現(xiàn)，只在K14-VEGF轉(zhuǎn)基因模型鼠中才有棘突結(jié)構(gòu)的出現(xiàn)。

棘突結(jié)構(gòu)表現(xiàn)在K14-VEGF發(fā)病小鼠耳朵腹側(cè)面皮膚表皮層。伴隨棘突結(jié)構(gòu)的出現(xiàn)，銀屑病癥狀會加重，如炎性細胞浸潤增加，角化過度和局灶性角化不全增強。實驗組小鼠單位長度棘突數(shù)量為11.9±4.1，顯著高于對照組的2.0±1.3(P<0.01，n=6)，表明實驗組小鼠已具有一種典型銀屑病樣變化(圖4C)。

2.2.4 多個免疫器官中CD11c+DCs和T淋巴細胞減少:1)與對照組相比，實驗組小鼠骨髓和淋巴結(jié)中CD11c+CD11c+DCs顯著降低 (圖5，表2)。2) 實驗小鼠T淋巴細胞明顯降低，其中Th17和Th1均下降。

實驗組小鼠血液中CD3+CD4+T淋巴細胞數(shù)為(17.87±0.23)個，明顯低于對照組(31.77±0.54)(P<0.01，n=6)(圖6A)。

與對照組相比，實驗組小鼠骨髓、血液、脾臟及頜下淋巴結(jié)中的CD3+CD4+IL- 17a+Th17細胞及CD3+CD4+IFN-γ+Th1細胞數(shù)量均顯著降低(P<0.01)(圖6B，表3)。

2.2.5 皮損處CD4+、CD8+、IL- 17a+和IFN-γ+淋巴細胞和血管改變：實驗組小鼠CD4+、CD8+、IL- 17a+或IFN-γ+細胞數(shù)顯著高于對照組(P<0.01，n=6)；實驗組小鼠血管數(shù)也較對照組明顯增加(P<0.01，n=6)(圖7，表4)。

圖3 實驗小鼠臨床表現(xiàn)和PASI積分Fig 3 Clinical manifestation and PASI scores of mice skin lesions

grouperythemascalesthicknessPASIcontrol 0.83±0.41 0.50±0.55 0.17±0.41 1.50±1.05experiment 2.67±0.52* 2.33±0.52* 2.00±0.63* 7.00±0.89*

*P<0.01 compared with control.

A.ear skin; B.back skin; C.epidermal rete ridge structures from ear skin圖4 細胞注射后21 d時小鼠耳部和背部受損皮膚Fig 4 Mice ear and back skin lesions on day 21 after injecting DCs

圖5 小鼠骨髓和頜下淋巴結(jié)內(nèi)的CD11c+DCs數(shù)量顯著變化Fig 5 Significient change of the number of CD11c+DCs from bone marrow and submaxillary lymph nodes in mice

groupbonemarrowsubmaxillarylymphnodescontrol1.76±0.302.29±0.36experiment0.14±0.03*0.47±0.05*

*P<0.01 compared with control.

2.2.6 實驗組小鼠心、肝、脾、肺和腎的組織學特征無明顯改變:實驗組小鼠與對照組小鼠比較，各臟器組織形態(tài)無明顯變化，表明CD11c+DCs注射對內(nèi)臟無明顯不良反應。

3 討論

在銀屑病中，pDCs和mDCs分泌IFN-α、IL- 12和IL- 23，進而刺激初始T細胞分化為Th1和Th17細胞[7]。在注射CD11c+DCs后，皮損處的CD4+T淋巴細胞、CD8+T淋巴細胞、IL- 17a+細胞、IFN-γ+細胞和CD31分子均顯著增多。CD8+T淋巴細胞增多提示，CD8+炎性淋巴細胞滲出增多；CD31分子染色顯示，血管數(shù)量增多：提示皮損區(qū)血管擴張和數(shù)量增加。銀屑病皮損中CD4+T淋巴細胞和CD8+T淋巴細胞產(chǎn)生IL- 17[8]。銀屑病是由Th17/Th1混合介導的自身免疫性疾病[6,9]。Th1和Th17細胞為CD4+T細胞分化而來，INF-γ由Th1產(chǎn)生，且是Th1的標志性細胞因子；IL- 17由Th17產(chǎn)生，且是Th17的標志性細胞因子。IL- 17具有致炎性[10]，可以誘導促炎細胞因子、趨化因子和基質(zhì)金屬蛋白酶的表達，引起組織細胞浸潤和組織破壞。IL- 17協(xié)同IFN-γ通過人類角質(zhì)形成細胞增加前炎性細胞因子的產(chǎn)生，也許會參與中性粒細胞在銀屑病皮損中的浸潤(血管周圍中性粒細胞的浸潤和表皮中性粒細胞微膿瘍的形成)。

A.number of CD3+CD4+T lymphocytes cells; B.number of Th1, Th17 cells from bone marrow, spleen, submaxillary lymph nodes and blood in mice

圖6 K14- VEGF轉(zhuǎn)基因小鼠骨髓、脾臟、頜下淋巴結(jié)和血液中的T淋巴細胞數(shù)

*P<0.05，**P<0.01 compared with control.

All the data between the experimental group and the control group is significantly圖7 小鼠皮損處CD4+, CD8+, IL- 17a+, IFN-γ+和CD31+細胞的免疫熒光Fig 7 CD4+, CD8+, IL- 17a+, IFN-γ+ and CD31+ immunofluorescence in the lesion skins of K14-VEGF mice

groupCD4+CD8+IL-17a+IFN-γ+CD31+control7.12±1.455.64±1.226.43±1.219.76±2.4424.50±4.53experiment21.32±2.31*13.43±2.12*19.86±2.87*25.54±11.68*53.30±9.86*

*P<0.01 compared with control.

在骨髓的流式細胞術(shù)分析中，實驗組CD11c+FLT3+DCs少于對照組。頜下淋巴結(jié)在小鼠的頸部，距K14-VEGF小鼠發(fā)病皮膚較近。實驗組CD11c+FLT3+DCs細胞數(shù)少于對照組。實驗組中的脾臟和血液中的CD11c+FLT3+DCs細胞數(shù)量與對照組相比未見差異。

對骨髓、脾臟、頜下淋巴結(jié)和血液的流式細胞術(shù)分析表明，血液中的CD3+CD4+雙陽性細胞數(shù)量減少，其他組的CD3+CD4+雙陽性細胞數(shù)量無顯著性差異。在CD3+CD4+IL- 17a+和CD3+CD4+IFN-γ+的流式細胞術(shù)分析中，實驗組細胞數(shù)量均減少，且具有極顯著差異。

皮損處CD4+T淋巴細胞、CD8+T淋巴細胞、IL- 17a+細胞、IFN-γ+細胞和血管數(shù)均增多，致使小鼠皮膚表皮層和顆粒層增厚，出現(xiàn)棘突，皮膚出現(xiàn)鱗屑、紅斑和結(jié)痂等臨床特征。證明CD11c+DCs通過直接或間接對CD4+T淋巴細胞、CD8+T淋巴細胞、IL- 17a+細胞、IFN-γ+細胞和CD31分子等產(chǎn)生作用促進K14-VEGF小鼠發(fā)病。

背部注射CD11c+DCs后，小鼠體內(nèi)DCs和T細胞數(shù)量減少。被激活的DCs可以通過分泌IL- 6，增強效應T細胞的功能，限制調(diào)節(jié)性T細胞的數(shù)量[11]。調(diào)節(jié)性T細胞抑制效應T細胞用來維持免疫平衡狀態(tài)。反過來，不受限制的效應T細胞會減少調(diào)節(jié)性T細胞的數(shù)量或降低功能，引起自身免疫性疾病[12]。有報道，銀屑病中的調(diào)節(jié)性T細胞機能下降，抑制能力減弱[13]。或許CD11c+DCs與體內(nèi)DCs和T細胞之間有一種抑制機制，但是作用通路尚不可知，還有待進一步研究。

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