吳 慶，程闊菊，姚浩旗，黃 河，楊天德*

(1.陸軍軍醫(yī)大學第二附屬醫(yī)院 麻醉科， 重慶 400037； 2.達州市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院 藥學部，四川 達州 635000)

缺血性心臟病是指心肌供血不足，導致心肌能量消耗與冠狀動脈所供應能量不平衡而引起的心臟損害，表現(xiàn)為心肌細胞缺血和缺氧，進而凋亡和壞死，最終使心臟功能受損，嚴重者將發(fā)展成心功能不全和心力衰竭等癥狀，已成為全球病死率最高的疾病[1]。心肌細胞為終末分化細胞不可再生，因此如何在缺血性心臟病早期可逆性的抑制心肌細胞凋亡將會對缺血性心臟病起著非常重要的保護作用。芒果苷(mangiferin)來源于芒果的果實、皮和樹葉，具有抗病毒、抗感染和抗氧化應激的作用，有研究顯示芒果苷對糖尿病大鼠心肌細胞凋亡[2]和柔紅霉素所致的心肌細胞凋亡[3]具有抑制作用，但對于更廣泛存在的缺血性心臟病早期缺血缺氧誘導的心肌細胞凋亡的作用目前尚無相關(guān)研究。因此，本研究擬通過建立缺血低氧誘導的SD乳鼠心肌細胞凋亡模型，研究芒果苷對心肌細胞缺血低氧凋亡的影響，以期為缺血性心臟病的防治提供一些科學的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物：新生SPF級SD大鼠(0～2 d)[陸軍軍醫(yī)大學實驗動物中心，動物合格證號：SCXK(渝)2007- 0003]。

1.1.2 主要試劑：一抗：Bax、Bcl- 2(Cell Singaling Technology公司)；芒果苷(Sigma公司)；Annexin V-APC/7-AAD細胞凋亡檢測試劑盒(凱基公司)；小牛血清、 DMEM/F12和胰蛋白酶(Gibco公司)；caspase- 3和caspase- 9活性檢測試劑盒(Biovision公司)；余試劑為國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 新生SD大鼠原代心肌細胞的分離及培養(yǎng)：參照本實驗室以往原代新生SD大鼠心肌細胞的分離和培養(yǎng)方法進行,詳見參考文獻[4]。

1.2.2 心肌細胞的分組及處理：將心肌細胞分為對照組、低氧組和芒果苷干預組； 低氧方法為低氧環(huán)境(94% N2-5% CO2-1% O2)，低氧時間(2、4、8和12 h)；芒果苷干預濃度為25、50、100和150 μmol/L。

待用心肌細胞培養(yǎng)24 h后，換成含不同濃度梯度(25、50、100和150 μmol/L)芒果苷的無血清DMEM培養(yǎng)液中孵育60 min后，置于低氧環(huán)境中繼續(xù)孵育2、4、8和12 h，每組設立3個復孔，重復3次。

1.2.3 流式細胞儀檢測心肌細胞凋亡：實驗結(jié)束后，按照Annexin V-APC試劑盒說明書中對貼壁細胞的處理及檢測方法對心肌細胞的凋亡進行流式細胞儀檢測。

1.2.4 分光光度法檢測心肌細胞凋亡蛋白酶caspase- 3和caspase- 9的活性:實驗結(jié)束后，按照caspase- 3和caspase- 9活性檢測試劑盒說明書中對貼壁細胞的處理及檢測方法對心肌細胞中的凋亡蛋白酶caspase- 3和caspase- 9進行分光光度法檢測。

1.2.5 Western blot檢測促凋亡蛋白Bax和抗凋亡蛋白Bcl- 2的蛋白含量：棄去細胞培養(yǎng)液，經(jīng)預冷PBS洗滌2次后，加入500 μL/孔的RIPA裂解緩沖液，置冰上裂解30 min后，用細胞刮刮下細胞，4 ℃、12 000 r/min離心15 min，收集上清，上清即為細胞的總蛋白溶解液，采用BCA protein assay kit定量蛋白濃度。加入SDS/PAGE煮沸5 min變性蛋白，將蛋白轉(zhuǎn)移至NC膜上，后續(xù)加入Bax、Bcl- 2(rat)一抗及相應的二抗。采用Odyssey 掃描成像系統(tǒng)(LICOR,USA)對蛋白進行定量。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 芒果苷對低氧誘導的原代大鼠心肌細胞凋亡的影響

隨著低氧處理時間的延長，心肌細胞凋亡率逐漸上升，從2 h開始起效，12 h時達最大值(圖1，表1)；芒果苷可顯著降低低氧誘導的心肌細胞凋亡率，從50 μmol/L開始起效，150 μmol/L達最大值(圖1，表1)。 因此，后續(xù)實驗可采用低氧處理12 h建立低氧誘導的原代大鼠心肌細胞凋亡模型，采用150 μmol/L芒果苷進行干預處理。

2.2 芒果苷對低氧誘導的原代大鼠心肌細胞凋亡蛋白酶caspase- 3和caspase- 9活性的影響

心肌細胞經(jīng)低氧處理12 h后，凋亡蛋白酶caspase- 3和caspase- 9的活性均顯著上升(P<0.05)，經(jīng)150 μmol/L芒果苷處理后，凋亡蛋白酶caspase- 3和caspase- 9的活性較模型組均顯著下降(P<0.05)(圖2)。

2.3 芒果苷對低氧誘導的原代大鼠心肌細胞促凋亡蛋白Bax和抗凋亡蛋白Bcl- 2表達的影響

原代大鼠心肌細胞經(jīng)低氧處理12 h后，Bax的蛋白表達量顯著上升(P<0.05)，Bcl- 2的蛋白表達量顯著下降(P<0.05)(圖3)；經(jīng)150 μmol/L芒果苷干預后，Bax的蛋白表達量較模型組顯著下降(P<0.05)，Bcl- 2的蛋白表達量較模型組顯著上升(P<0.05)(圖3)。

3 討論

缺血性心臟病系由各種原因造成心臟自身供血量減少而引起的一系列心臟疾病[5]。心臟自身供血減少后將導致心肌細胞缺血缺氧進而引起一系列病理生理變化，比如能量代謝障礙、鈣超載、氧化應激、線粒體結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生改變等，緊接著則會發(fā)生心肌細胞凋亡、壞死，從而導致心臟心率失常和收縮功能障礙，最終導致心臟功能受損。心肌細胞為終末分化細胞不可再生，因此若能在缺血性心臟病早期可逆性的抑制心肌細胞凋亡將會對缺血性心臟病起著非常重要的保護作用。

A.hypoxia 0 hour and mangiferin 0 μmol/L, apoptosis rate 9.23%; B.hypoxia 12 hours and mangiferin 0 μmol/L, apoptosis rate 52.19%; C.hypoxia 12 hours and mangiferin 150 μmol/L,apoptosis rate 20.34%

圖1 芒果苷對低氧誘導的原代大鼠心肌細胞凋亡的影響Fig 1 Effects of mangiferin on the apoptosis of cardiomyocytes induced by hypoxia

#P<0.05 compared with control group;△P<0.05 compared with hypoxia group(12 hour).

*P<0.05 compared with control group; #P<0.05 compared with hypoxia group圖2 芒果苷對低氧誘導的原代大鼠心肌細胞caspase- 3和caspase- 9活性的影響Fig 2 Effects of mangiferin on the activity of caspase- 3 and caspase- 9 in apoptotic cardiomyocytes induced by ischemia hypoxia(±s,n=9)

*P<0.05 compared with control group; #P<0.05 compared with hypoxia group圖3 芒果苷對低氧誘導的原代大鼠心肌細胞Bax和Bcl- 2蛋白表達的影響Fig 3 Effects of mangiferin on the protein expression of Bax and Bcl- 2 in apoptotic cardiomyocytes induced by ischemia hypoxia(±s,n=9)

心肌細胞凋亡主要有3個途徑：1)是死亡受體介導的凋亡途徑，又稱為外在途徑，是由細胞表面的特定死亡受體接收到胞外的死亡信號進而激活啟動細胞內(nèi)的凋亡途徑，從而誘導細胞凋亡，主要的死亡受體是腫瘤壞死因子受體(TNF-Rs)家族[6- 8]。2)是線粒體凋亡途徑，又稱為內(nèi)在途徑，主要機制是凋亡分子細胞色素C、Amac/Diablo蛋白、核酸內(nèi)切酶和凋亡誘導因子從線粒體中釋放，從而產(chǎn)生級聯(lián)反應使細胞凋亡[9]。凋亡分子的釋放受抗凋亡蛋白Bcl- 2的調(diào)控，另外促凋亡蛋白Bax可以誘導和促進線粒體凋亡分子的釋放從而促進細胞凋亡。3)是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑，主要由細胞內(nèi)鈣激活，同樣受抗凋亡蛋白Bcl- 2的調(diào)控[10]。盡管3條通路的上游事件不同，但他們的下游通路均終需激活共同的凋亡效應物，即特異的胱冬酶(caspase)家族，其中caspase- 8、9、3是凋亡通路上的3個關(guān)鍵酶。Caspase- 8對來自于細胞外的凋亡誘導因子刺激做出應答，啟動細胞解體。Caspase- 9對損傷和各種藥物刺激做出應答，啟動細胞色素C等凋亡分子從線粒體中釋放。而caspase- 3則能放大caspase- 8和caspase- 9的信號，引起細胞全面性的自殺性解體。

芒果苷又名芒果素、知母寧，是一種主要從龍膽科和漆樹科植物的葉、莖、樹皮和果實中提取的氧雜蒽酮類化合物，也是中藥知母的主要活性成分[11]。有研究顯示芒果苷對糖尿病大鼠心肌細胞凋亡[2]和柔紅霉素所致的心肌細胞凋亡[3]具有抑制作用。因此本研究設想芒果苷很可能對低氧誘導的心肌細胞凋亡亦有抑制作用，進而對缺血性心臟病有保護作用。為驗證此設想，設計了芒果苷對低氧誘導的原代大鼠心肌細胞凋亡影響的研究。研究結(jié)果證實，芒果苷可顯著降低低氧誘導的原代大鼠心肌細胞凋亡，其作用機制包含了下調(diào)凋亡蛋白酶的活性，抑制促凋亡蛋白的表達和上調(diào)抗凋亡蛋白的表達。至于芒果苷保護低氧誘導的原代大鼠心肌細胞凋亡是否還有其他保護通路，以及是否可以進一步保護在體缺血性心臟病，有待進一步研究。

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