胡 慧，吳 強，田茂波

(1.貴州省六盤水市人民醫(yī)院 老年病科， 貴州 六盤水 553001； 2.貴州省人民醫(yī)院 心血管內(nèi)科， 貴州 貴陽 550002)

血管外膜成纖維細胞(vascular adventitial fibroblast,VAF)的激活、增殖、分泌細胞因子及合成細胞外基質(zhì)異常是血管疾病的重要機制之一[1- 2]。干擾素(interferon,IFN)及其誘導表達的系列干擾素誘導蛋白(interferon-inducible protein，IFI)具有調(diào)控細胞增殖和凋亡的作用。IFIp204是p200家族中6個鼠類同源蛋白的成員之一，由Ifi204基因編碼。α-干擾素可通過誘導p204表達抑制大鼠主動脈VAF增殖[3- 4]。本研究用攜帶Ifi204的慢病毒載體轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的大鼠主動脈VAF，觀察轉(zhuǎn)染效率和p204的表達，為p204表達變化對大鼠VAF生物學功能的影響及其在血管疾病中的作用提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

清潔級SD大鼠約4周齡，體質(zhì)量110～130 g，雌雄不限[貴陽醫(yī)學院實驗動物中心，動物合格證號SCXK (黔)2012- 001]。細胞培養(yǎng)及純化用的胎牛血清(Santa Cruz公司); DMEM高糖培養(yǎng)液、蘇木精、二甲苯(Hyclone公司)；Pv- 9000二步法免疫組化驗查試劑盒(北京中杉金橋公司)；含Ifi204的慢病毒顆粒(廣州復能基因有限公司構(gòu)建)；總RNA 提取試劑盒(Life公司)；q-PCR 2步法試劑盒(北京天根公司)。DRR420A 試劑盒(TaKaRa公司)。PCR引物(上海生工公司合成)；P204一抗(GeneTex公司)；通用二抗(Abmart公司)。GAPDH抗體(碧云天生物技術(shù)研究所)。

1.2 方法

1.2.1 大鼠VAF的培養(yǎng)、純化及鑒定：按文獻[5]介紹的植塊貼壁法培養(yǎng)大鼠原代VAF。觀察細胞增殖至80%匯合度時進行首次傳代，應用差速貼壁法純化VAF。用2 ～ 4 代細胞懸液制備細胞爬片，待細胞匯合度達50%～80%時，用多聚甲醛固定，PBS漂洗，PV- 9000染色，DABI工作液顯色，蘇木精復染細胞核15～30 s。配制梯度乙醇，乙醇濃度(%)依次為50、75、90和100，細胞分別放置時間為5、5、5和10 min脫水。二甲苯中透明細胞5 min，最后在倒置相差顯微鏡下觀察拍照。

1.2.2 實驗分組：實驗分3組：攜帶Ifi204基因的慢病毒載體系統(tǒng)轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的大鼠VAF作為Ifi204組，空載慢病毒處理的VAF作為對照組(C組)，未處理的VAF作為空白組(N組)。

1.2.3 慢病毒轉(zhuǎn)染：用逐孔稀釋法測定、復核慢病毒滴度。設置MOI=0、10、20、40、60、80和100共7組，根據(jù)轉(zhuǎn)染的細胞數(shù)，準確計算慢病毒量，使用移液器吸取準確體積的病毒液，盡可能保證所獲得的含有慢病毒或攜帶Ifi204的慢病毒的培養(yǎng)基的總體積為最小體積，以期獲得最佳的感染效率。按5×104個/孔接種對數(shù)增殖期的VAF于兩個6孔培養(yǎng)板，鋪板時細胞匯合度約為50%，進行慢病毒轉(zhuǎn)染時細胞匯合度約為70%。吸取含慢病毒及攜帶Ifi204慢病毒的DMEM，分別加入上述6孔培養(yǎng)板，放入5% CO2，37 ℃培養(yǎng)箱中孵育，分別于24、48和72 h觀察細胞增殖狀態(tài)及轉(zhuǎn)染情況，如細胞增殖狀態(tài)良好，可于72 h加入嘌呤霉素繼續(xù)孵育，于第5天在倒置相差熒光顯微鏡下觀察細胞增殖狀態(tài)，檢查感染效率，篩選細胞拍照并選取最佳MOI值。

1.2.4 q-PCR法檢測p204的 mRNA表達：按Trizol總RNA提取試劑盒操作說明書提取細胞總RNA，用核酸蛋白分析儀測定總RNA純度和濃度。取1 μg的RNA按q-PCR兩步法試劑盒說明書反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，取A260/A280比值為1.8～2.0的RNA進行q-PCR。按DRR420A試劑盒說明書操作擴增PCR。反應條件：預變性90 ℃ 40 s，變性95 ℃ 5 s，退火、延伸50 ℃ 30 s，共經(jīng)40個循環(huán)。PCR引物序列(表1)。按2-ΔΔCt法計算3組p204 mRNA的豐度。

表1 p204和內(nèi)參引物序列Table 1 Sequence of primers and p204

1.2.5 Western blot檢測p204蛋白表達:提取各組細胞的總蛋白。用酶標儀于570 nm波長處測吸光度值，制作標準曲線。根據(jù)吸光度值與標準曲線進行蛋白定量。制膠、電泳分離蛋白，轉(zhuǎn)膜后封閉，一抗、二抗孵育，將與分離膠大小相當?shù)腘C膜在暗室中進行曝光、顯影、定影，以膠片透明為止，掃描膠片結(jié)果，用WCJF Image J軟件分析各條帶灰度與管家蛋白tubulin灰度的比值，據(jù)比值分析3組p204蛋白表達的差異。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 培養(yǎng)的VAF形態(tài)及免疫細胞化學鑒定

VAF貼壁后呈菱形或長梭形多層排列，部分交織成網(wǎng)狀，高低起伏，細胞立體感和折光性強(圖1A)。經(jīng)vimentin蛋白免疫印跡，陽性細胞輪廓清楚，胞質(zhì)著棕黃色，核清晰可見，背景清晰無特異性著色，陽性率達90%以上(圖1B)。

2.2 攜帶Ifi204基因的慢病毒轉(zhuǎn)染大鼠成纖維細胞后熒光質(zhì)控轉(zhuǎn)染效率

轉(zhuǎn)染復數(shù)MOI=80時，轉(zhuǎn)染效率相對較高，細胞狀態(tài)較好。轉(zhuǎn)染后48和72 h在熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效率分別為70%和80%。于第5天在熒光顯微鏡下觀察仍可見75%左右的大鼠成纖維細胞內(nèi)出現(xiàn)綠色熒光(圖2)。

2.3 干擾素誘導蛋白p204的 mRNA表達

與N 組及C組比較，Ifi204組的p204 mRNA表達增加(P<0. 01)(圖3)。

2.4 干擾素誘導蛋白p204蛋白水平的變化

干擾素誘導蛋白p204在Ifi204組、N組和C組均存在一定豐度的結(jié)構(gòu)表達，與N 組及C組比較，Ifi204組的p204 蛋白表達增加(P<0. 01)(圖4)。

A.light microscopy features of VAFs(× 200); B.VAFs was identified by immunocytochemistry(×100)圖1 采用植塊貼壁法培養(yǎng)的大鼠主動脈VAF的光鏡特征和鑒定

圖2 慢病毒介導Ifi204基因轉(zhuǎn)染大鼠成纖維細胞熒光質(zhì)控轉(zhuǎn)染效率Fig 2 Translatlion efficient of Ifi204 gene was mediated by lentivirus(×100)

*P<0.01 compared with C and N group圖3 p204 mRNA的相對表達量Fig 3 Expression of p204 mRNA

*P<0.01 compared with C and N group圖4 p204 蛋白的相對表達量Fig 4 Expression of p204 protein(±s, n=4)

3 討論

IFN與細胞膜受體結(jié)合后觸發(fā)JAK/STAT信號傳導通路[6]，在干擾素調(diào)節(jié)因子的協(xié)同作用下，誘導產(chǎn)生一系列IFI，從而發(fā)揮其眾多生物學效應。干擾素誘導蛋白p200家族[7]是新近發(fā)現(xiàn)的一類IFI，其成員IFI16具有抑制人腦血管成纖維細胞增殖、遷移及新生血管形成的作用[8]，參與對血管內(nèi)皮炎性因子的誘導。血管修復和內(nèi)膜增生的過程在不同物種(小鼠、豬和人)和不同動脈(肱動脈、髂動脈、股動脈及主動脈)是類似的[9]。p200家族真正意義上的鼠/人之間(跨物種)的同源基因尚未發(fā)現(xiàn)[10]。p204可看作為“人的IFI 16”，因為它們都含有PAAD/DAPIN/Pyrin結(jié)構(gòu)域(氨基酸序列相似度為51%)和一對200 X序列(相似度為51.3%)。提示促進p204的表達可能也參與調(diào)控血管壁各種細胞的增殖、遷移及新生血管的形成。其機制與p204延緩細胞G0/G1期進入S期[11 ]、抑制細胞周期G2/M轉(zhuǎn)換[12]、抑制rRNA的合成有關(guān)。p204的誘導表達還是工作心肌細胞、骨骼肌肌管、成骨細胞、軟骨細胞及巨噬細胞等多種組織及細胞分化的關(guān)鍵步驟。但在不同品系的大鼠中，IFNs對p204的誘導效率并不相同，提示p204表達不受內(nèi)源性IFN的影響[13]。

病毒介導是生物介導轉(zhuǎn)染方式之一，本研究探索出一套慢病毒載體介導Ifi204基因轉(zhuǎn)染VAF的技術(shù)，其轉(zhuǎn)染效率高和表達持久。證實了通過轉(zhuǎn)染攜帶Ifi204基因的慢病毒可誘導p204在鼠血管VAF 過表達，為進一步探討Ifi204基因過表達后對VAF增殖、凋亡與遷移的影響及分子機制的研究作鋪墊，為p204通過慢病毒轉(zhuǎn)染方式應用于血管增殖疾病的研究奠定了實驗基礎，具有廣闊應用前景。

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