林日強(qiáng)，冷吉，陳敬欽，劉成波，龔小競(jìng)，宋亮

中國(guó)科學(xué)院深圳先進(jìn)技術(shù)研究院 生物醫(yī)學(xué)光學(xué)與分子影像研究室，廣東 深圳 518060

引言

光聲成像主要基于光聲效應(yīng)，即當(dāng)物體被脈沖激光照射后，會(huì)吸收光能并將部分能量轉(zhuǎn)化為熱能，進(jìn)而引起樣品的瞬時(shí)熱膨脹和后續(xù)的高頻振動(dòng)，這種高頻振蕩的超聲波即光聲信號(hào)，用超聲換能器探測(cè)該信號(hào)并通過(guò)計(jì)算機(jī)重建成像[1]。早在1880年，Bell實(shí)驗(yàn)室就發(fā)現(xiàn)了光聲現(xiàn)象，但直到二十世紀(jì)60～70年代，光聲效應(yīng)才與現(xiàn)代激光技術(shù)、超聲探測(cè)技術(shù)、微弱信號(hào)放大技術(shù)相結(jié)合而開(kāi)始迅速發(fā)展。二十世紀(jì)90年代，光聲效應(yīng)被引入生物組織成像領(lǐng)域，后又經(jīng)過(guò)10余年的努力，光聲成像技術(shù)在系統(tǒng)構(gòu)成、圖像重建、功能成像等各個(gè)方面均獲得了巨大的發(fā)展，并顯現(xiàn)出其在臨床醫(yī)學(xué)和基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究方面的巨大應(yīng)用潛力。

生物組織的光聲成像，通常是經(jīng)過(guò)光吸收→激發(fā)光聲信號(hào)→超聲波檢測(cè)→圖像重建等過(guò)程，其原理見(jiàn)圖1。在激發(fā)光照參數(shù)不變的情況下，光聲信號(hào)的強(qiáng)度、頻譜與生物體的光學(xué)特性（主要是光吸收特性）緊密相關(guān)。而不同的組織有不同的光吸收特性，因此光聲成像可以對(duì)組織中特定成分進(jìn)行高對(duì)比的結(jié)構(gòu)成像。進(jìn)一步，結(jié)合光聲光譜技術(shù)，即在多個(gè)波長(zhǎng)進(jìn)行光聲測(cè)量，可以定量地分析各種組織成分的變化，精細(xì)地反映極其微小的組織病變及血紅蛋白濃度、血氧濃度、氧代謝率等一系列重要的生理參數(shù)，實(shí)現(xiàn)功能成像[1]。

圖1 光聲成像原理圖

傳統(tǒng)的生物醫(yī)學(xué)光學(xué)成像，如光學(xué)相干層析、共聚焦、多光子等，可實(shí)現(xiàn)高分辨、高對(duì)比的成像。但由于組織對(duì)光的強(qiáng)烈散射作用，其成像深度往往局限在1～2 mm。光學(xué)擴(kuò)散層析通過(guò)對(duì)光子運(yùn)動(dòng)軌跡的“追蹤”，可實(shí)現(xiàn)厘米級(jí)深度成像。但同樣由于組織對(duì)光的強(qiáng)烈散射作用，其追蹤過(guò)程是針對(duì)大量光子的統(tǒng)計(jì)學(xué)計(jì)算，所以其分辨率僅為數(shù)毫米。醫(yī)學(xué)超聲成像可以獲得較大的成像深度（數(shù)厘米）和較高的分辨率（數(shù)百微米），但由于成像原理是基于聲阻抗不同的對(duì)比機(jī)制，使其對(duì)早期病變成像的對(duì)比度要遠(yuǎn)低于光學(xué)成像方式。光聲成像克服了現(xiàn)有純光學(xué)和純超聲成像的局限性，其對(duì)比度源于光學(xué)吸收差異，分辨率源于光聲發(fā)射階段的超聲波探測(cè)。由于超聲波在生物組織中的散射比光學(xué)散射低3個(gè)數(shù)量級(jí)，因此光聲成像在擴(kuò)射光子能夠到達(dá)的區(qū)域，成像分辨率和最大成像深度均可以隨著超聲頻率變化而變化[2]。綜上，光聲成像技術(shù)結(jié)合了超聲成像的大深度、高分辨特點(diǎn)，同時(shí)又具備光學(xué)成像的高對(duì)比度，是一種非常有應(yīng)用潛力的新興成像技術(shù)。

由于具備在大穿透深度與高分辨成像之間靈活調(diào)節(jié)切換的能力，使得光聲成像技術(shù)可以根據(jù)不同的應(yīng)用目的，采用不同的成像方式，以獲得與應(yīng)用更為匹配的優(yōu)質(zhì)圖像。本文中，我們將主要介紹3種常見(jiàn)的光聲成像方式：光聲顯微成像技術(shù)、光聲計(jì)算層析成像技術(shù)、光聲內(nèi)窺成像技術(shù)。光聲顯微成像技術(shù)和光聲內(nèi)窺技術(shù)主要目標(biāo)是在毫米級(jí)的成像深度上實(shí)現(xiàn)微米級(jí)的分辨率。而光聲計(jì)算層析技術(shù)的探測(cè)深度和分辨率可在較大范圍內(nèi)變化，既可以實(shí)現(xiàn)顯微成像，也可以實(shí)現(xiàn)大深度的成像。

光聲成像技術(shù)作為一種正在迅速發(fā)展的新型成像技術(shù)，憑借其靈活的成像方式、優(yōu)質(zhì)的成像能力、高度的生物安全性，正越來(lái)越多地受到生物醫(yī)學(xué)成像領(lǐng)域研究人員的密切關(guān)注。近年來(lái)光聲成像已被證明在眾多生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域有重要的應(yīng)用價(jià)值，如腫瘤血管新生成像[3]、血紅蛋白和血氧濃度成像[4]、心腦血管易損斑塊成像[5]、乳腺癌診斷[6]等。本文中，我們結(jié)合本研究團(tuán)隊(duì)的主要研究工作，重點(diǎn)介紹與臨床應(yīng)用緊密聯(lián)系的微血管成像、血管介入成像、消化道內(nèi)窺成像、前哨淋巴結(jié)成像的光聲技術(shù)的最新進(jìn)展。

1 微血管成像

微血管的尺度在10 μm左右，需要采用光學(xué)分辨率光聲顯微成像系統(tǒng)（Optical-Resolution Photoacoustic Microscopy，OR-PAM）進(jìn)行觀察。OR-PAM是光聲成像的一種主要形式，由于其橫向分辨率達(dá)到光學(xué)聚焦量級(jí)（微米或者亞微米級(jí)），因此稱為“光學(xué)”分辨率光聲顯微系統(tǒng)。該系統(tǒng)使用聚焦后的激光光束進(jìn)行光聲信號(hào)的激發(fā)，并將超聲接收焦點(diǎn)與光激發(fā)焦點(diǎn)調(diào)節(jié)至共聚焦?fàn)顟B(tài)以實(shí)現(xiàn)最高的接收效率。

本研究團(tuán)隊(duì)搭建的OR-PAM系統(tǒng)結(jié)構(gòu)圖（圖2）中[7]，納秒脈沖激發(fā)光由532 nm波長(zhǎng)的釔鋁石榴石晶體（Nd：YAG）固體激光器輸出；經(jīng)小孔整形與透鏡聚焦后，再經(jīng)光纖耦合器，耦合到單模光纖中；光纖出射光再經(jīng)過(guò)兩個(gè)相同的物鏡進(jìn)行準(zhǔn)直和聚焦，最后照射到組織樣本上為直徑大約5 μm的光斑。產(chǎn)生的光聲信號(hào)用水進(jìn)行耦合后再經(jīng)過(guò)組合棱鏡的兩次全反射后被其上方的高頻超聲換能器接收，該棱鏡中間夾層灌注有硅酮油，用于透射激光反射超聲，聲透鏡則附于棱鏡的下方用于增強(qiáng)接收信號(hào)的靈敏度；接收到的光聲信號(hào)放大后由高速數(shù)據(jù)采集卡進(jìn)行采集，經(jīng)計(jì)算機(jī)用MATLAB程序?qū)Σ杉臄?shù)據(jù)進(jìn)行希爾伯特變換以及濾波處理后成像。三維位移平臺(tái)用于移動(dòng)成像探頭進(jìn)行機(jī)械掃描，獲得三維數(shù)據(jù)[6-7]。

圖2 OR-PAM系統(tǒng)結(jié)構(gòu)圖[7]

利用OR-PAM，我們成功實(shí)現(xiàn)了活體狀態(tài)下對(duì)小鼠耳部血管網(wǎng)絡(luò)的無(wú)創(chuàng)、無(wú)標(biāo)記的光聲成像（圖3a）[7]。體成像分辨率達(dá)到5 μm，實(shí)現(xiàn)了對(duì)單個(gè)紅細(xì)胞成像。通過(guò)自制夾具，我們還對(duì)小鼠背部乳腺癌腫瘤（4T1）進(jìn)行了無(wú)標(biāo)記的連續(xù)觀察（圖3b～3d）[8]。通過(guò)不同波長(zhǎng)的激光進(jìn)行激發(fā)，獲得了血紅蛋白在不同波長(zhǎng)下的光聲信號(hào)，結(jié)合氧合血紅蛋白和脫氧血紅蛋白的光譜差異，可從中提取出血氧飽和度信息。在今后研究中，需要提高該系統(tǒng)的光穿透深度以及光聲信號(hào)探測(cè)效率，以獲得更高深度的成像。利用該技術(shù)，可實(shí)現(xiàn)腫瘤周邊微血管生成過(guò)程的無(wú)創(chuàng)精細(xì)觀察，結(jié)合藥物對(duì)小動(dòng)物腫瘤模型的長(zhǎng)期觀察，有望為腫瘤病理學(xué)研究和臨床診斷提供全新的工具。

2 血管介入成像

血管內(nèi)光聲成像（Intravascular Photoacoustic Imaging，IVPA）是一種新型檢測(cè)血管內(nèi)易損斑塊的成像技術(shù)。它利用介入成像導(dǎo)管，深入到病變血管處進(jìn)行成像。由于不同組織的吸收特性各不相同，因此IVPA可利用組織自身的光吸收對(duì)比和光聲光譜方法，高敏銳的檢測(cè)斑塊的化學(xué)組分（如脂質(zhì)核）。與傳統(tǒng)的血管內(nèi)超聲成像（Intravascular Ultrasound，IVUS）和血管內(nèi)光學(xué)相干層析成像只能夠?qū)ρ軆?nèi)壁的結(jié)構(gòu)和形態(tài)成像相比，血管內(nèi)光聲成像能夠針對(duì)生物組織的成分差異或分子特異性進(jìn)行功能成像。

圖3 OR-PAM系統(tǒng)在體成像的部分代表成果[7]

本研究團(tuán)隊(duì)所設(shè)計(jì)的高速血管內(nèi)光聲超聲雙模成像系統(tǒng)，見(jiàn)圖4a[9]。

激發(fā)源為重復(fù)頻率為1 kHz的納秒級(jí)脈沖光學(xué)參量振蕩激光器（Optical Parameter Oscillator，OPO），激發(fā)光經(jīng)過(guò)光闌光束整形和中性密度濾波片衰減后，再由透鏡匯聚到多模光纖內(nèi)，并經(jīng)光纖導(dǎo)入由光纖、自聚焦透鏡、棱鏡與超聲換能器構(gòu)成的成像導(dǎo)管內(nèi)（圖4b）。光纖出射光經(jīng)自聚焦透鏡會(huì)聚、棱鏡反射，照射在血管內(nèi)壁，激發(fā)出的光聲信號(hào)被超聲換能器接收，獲得血管壁的光聲圖像；同時(shí)超聲換能器還進(jìn)行超聲的發(fā)射和接收，獲得血管壁的超聲圖像。成像導(dǎo)管在旋轉(zhuǎn)—平移掃描平臺(tái)的帶動(dòng)下完成“螺旋式”掃描，所采集的數(shù)據(jù)通過(guò)高速數(shù)據(jù)采集卡傳遞到計(jì)算機(jī)，利用MATLAB軟件對(duì)其進(jìn)行希爾伯特變換和極坐標(biāo)變換，最終實(shí)現(xiàn)三維的光聲/超聲雙模成像。

利用上述搭建的IVPA系統(tǒng)（圖4c）以及我們?cè)O(shè)計(jì)制作的外徑為0.9 mm的光聲/超聲雙模成像導(dǎo)管進(jìn)行了成像實(shí)驗(yàn)，獲取了由黃油制作的脂質(zhì)仿體在波長(zhǎng)為1185 nm、1195 nm、1210 nm、1225 nm和1235 nm下的光聲圖像，獲得了光聲光譜信息（圖5d）[9]。由圖5d可以看出，將測(cè)得的光聲光譜與脂質(zhì)的吸收譜比對(duì)，二者非常接近，并且利用二者進(jìn)行互相關(guān)計(jì)算，可對(duì)脂質(zhì)成分進(jìn)行鑒別，進(jìn)而獲得脂質(zhì)成份的分布圖（圖5e）。該技術(shù)可用于對(duì)易損斑塊中的脂質(zhì)核成分進(jìn)行檢測(cè)，為斑塊易損性的診斷提供功能信息，有望成為臨床新一代的成像工具，為醫(yī)生提供更詳盡的診斷信息。在今后的系統(tǒng)的改進(jìn)中，應(yīng)該提高光學(xué)耦合效率，以提高脂質(zhì)信號(hào)的探測(cè)靈敏度。

圖4 高速血管內(nèi)成像系統(tǒng)圖[9]

圖5 利用IPVA獲取的光聲光譜圖像[9]

此外，利用該系統(tǒng)，我們對(duì)離體的兔子血管內(nèi)植入的心臟支架（圖6a）進(jìn)行了成像[9]，成像速度可以到達(dá)每秒5幀。我們利用連續(xù)采集的多個(gè)超聲和光聲B-Scan圖像進(jìn)行了三維重建（圖6b～c），可以看出IVPA相對(duì)IVUS具有更高的對(duì)比度，更有利于對(duì)支架的放置情況進(jìn)行評(píng)估。因此亦可以利用該成像系統(tǒng)引導(dǎo)心臟支架介入手術(shù)以及監(jiān)測(cè)心臟支架的植入情況。

3 消化道內(nèi)窺成像

現(xiàn)階段，對(duì)消化道疾病的常規(guī)診斷仍然依賴于醫(yī)用內(nèi)窺鏡。醫(yī)用內(nèi)窺鏡不僅能及時(shí)發(fā)現(xiàn)病灶位置，為醫(yī)生提供病灶區(qū)域的圖像，還能引導(dǎo)手術(shù)，對(duì)發(fā)病位置進(jìn)行監(jiān)控、采樣、給藥、切除等操作。但是目前臨床內(nèi)窺鏡仍然具有一定局限性。白光和熒光類的內(nèi)窺成像技術(shù)受限于傳統(tǒng)光學(xué)成像技術(shù)的穿透深度，大多只能對(duì)消化道的表皮成像，無(wú)法觀察到表皮以下的組織情況，難以判斷腫瘤浸潤(rùn)深度，在一定程度上局限了其疾病診斷能力。超聲成像的不足在于其圖像對(duì)比度有限，針對(duì)某一種特定成分進(jìn)行成像的特異性較差[10]。

圖6 健康兔子血管植入心臟支架圖像[9]

基于此，本研究團(tuán)隊(duì)在血管內(nèi)光聲成像技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展了消化道光聲/超聲雙模內(nèi)窺鏡，并針對(duì)特定成像對(duì)象和成像范圍，對(duì)成像探頭進(jìn)行了全新設(shè)計(jì)。最終，我們實(shí)現(xiàn)了可兼容臨床內(nèi)窺鏡活檢通道的成像探頭（外徑為2.5 mm）。利用該探頭，我們?cè)趪?guó)內(nèi)首次實(shí)現(xiàn)了小動(dòng)物的活體內(nèi)窺光聲/超聲雙模同位成像（圖7）[11]。該技術(shù)既能對(duì)消化道淺表病灶的血管形態(tài)、血氧飽和度等進(jìn)行功能成像，又能探測(cè)腫瘤浸潤(rùn)深度，在不同模態(tài)成像下獲取多參量多尺度的信息。在接下來(lái)的研究中，我們將嘗試將本系統(tǒng)與現(xiàn)有消化內(nèi)鏡技術(shù)融合，并逐步提高系統(tǒng)分辨率[12]與成像速度[13]，初步建立基于光聲內(nèi)窺鏡的消化道早癌多模態(tài)診斷體系和標(biāo)準(zhǔn)。利用該技術(shù)有望更早更快發(fā)現(xiàn)消化道腫瘤，為消化道的臨床診斷提供方法上的革新。

圖7 大鼠直腸在體光聲/超聲雙模成像[11]

4 前哨淋巴結(jié)成像

傳統(tǒng)的乳腺癌前哨淋巴結(jié)檢測(cè)中，通常采用追蹤放射性標(biāo)記物并注射染料的方式定位前哨淋巴結(jié)，再將定位后的前哨淋巴結(jié)取出，進(jìn)行病理檢測(cè)。此種方法可引起嚴(yán)重的并發(fā)癥，并且假陰性率高。而基于超聲的針刺型活檢雖然是微創(chuàng)手術(shù)，一般不會(huì)造成并發(fā)癥，但是由于超聲技術(shù)的低對(duì)比度，難以精準(zhǔn)定位前哨淋巴結(jié)的位置。光聲成像因其具有高對(duì)比度優(yōu)勢(shì)，能夠大幅提升針刺型活檢的有效性，在降低風(fēng)險(xiǎn)的同時(shí)，提高了前哨淋巴結(jié)檢測(cè)的準(zhǔn)確度[14-15]。

針對(duì)這一應(yīng)用，本研究團(tuán)隊(duì)開(kāi)發(fā)了基于手持式超聲陣列探頭的光聲實(shí)時(shí)成像系統(tǒng)，主要包含：128通道數(shù)據(jù)采集裝置，OPO納秒脈沖激光器，光纖（或光纖束），手持式光聲/超聲探頭，以及光路等附加部件系統(tǒng)，系統(tǒng)見(jiàn)圖8[16]。

圖8 手持式乳腺癌前哨淋巴結(jié)成像系統(tǒng)[16]

仿體實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，系統(tǒng)分辨率可達(dá)250 μm，成像速率為每秒20幀，能夠?qū)崟r(shí)成像。利用該系統(tǒng)，我們通過(guò)向大鼠前爪注射吲哚菁綠（Indocyanine Green，ICG）小分子光聲成像對(duì)比劑，成功實(shí)現(xiàn)了大鼠前哨淋巴結(jié)的定位成像（圖9）。該技術(shù)展示了光聲成像技術(shù)在微創(chuàng)、高效檢測(cè)前哨淋巴結(jié)中的重要應(yīng)用潛力。在未來(lái)研究中，我們將繼續(xù)致力于改進(jìn)算法與系統(tǒng)結(jié)構(gòu)，以提高系統(tǒng)的成像速度以及成像靈敏度[17-18]，以期望其在乳腺癌早期診斷中發(fā)揮重要作用。

圖9 手持式光聲成像系統(tǒng)用于大鼠前哨淋巴結(jié)成像結(jié)果

5 總結(jié)

綜上所述，光聲成像技術(shù)既可以高分辨、高對(duì)比的對(duì)組織進(jìn)行特異性結(jié)構(gòu)成像，也可對(duì)目標(biāo)組織中的特定成分進(jìn)行鑒別，還可結(jié)合分子探針進(jìn)行靶向目標(biāo)成像。因此，光聲成像技術(shù)作為一種兼具高對(duì)比度結(jié)構(gòu)成像與高敏銳功能成像能力的新型成像技術(shù)，正在臨床腫瘤、心腦血管疾病早期診斷等方面展現(xiàn)出巨大應(yīng)用潛力[19-21]。推動(dòng)光聲成像技術(shù)的進(jìn)一步臨床轉(zhuǎn)化與產(chǎn)業(yè)化，具有重大經(jīng)濟(jì)價(jià)值和社會(huì)意義。

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