徐子衿 綜述　薛　晴 審校

北京大學(xué)第一醫(yī)院(100034)

自然流產(chǎn)為妊娠期常見并發(fā)癥，占妊娠人群的30%[1]。復(fù)發(fā)性流產(chǎn)(RSA)指反復(fù)的自發(fā)性流產(chǎn)，目前已有檢查手段能明確的病因包括父母染色體異常(如平衡易位攜帶者等)、母親子宮結(jié)構(gòu)異常、內(nèi)分泌異常、自身免疫異常(如抗磷脂抗體綜合征)，仍不能明確病因的人群則定義為不明原因復(fù)發(fā)性流產(chǎn)(URSA)，約占RSA人群的40%[2]。由于病因不可知，臨床對URSA干預(yù)的針對性欠佳，如何使這部分人群獲得良好的妊娠結(jié)局，是目前生殖領(lǐng)域的一大難題。

1 發(fā)病機制

1.1 胚胎染色體異常

胚胎染色體異常是RSA的重要原因之一，既往研究通過對RSA患者的流產(chǎn)胚胎進行細胞遺傳學(xué)評估，發(fā)現(xiàn)異常核型胎兒發(fā)生率可達50%～70%,其中主要為非整倍體[3]，可能與減數(shù)分裂期染色體不分離導(dǎo)致產(chǎn)生異常配子有關(guān)。

1.2 同種免疫

由于胎兒屬于同種異體移植物，正常的妊娠取決于胎兒與母親免疫系統(tǒng)的相互作用，故當(dāng)正常的免疫耐受的某個環(huán)節(jié)出現(xiàn)異常時，也將導(dǎo)致反復(fù)妊娠失敗。

1.2.1免疫細胞與Th1/Th2平衡研究發(fā)現(xiàn)URSA患者的外周血及子宮蛻膜組織中的自然殺傷(NK)細胞(CD56+CD16+)及自然殺傷T(NKT)細胞(CD3+CD56+CD16+)較正常妊娠對照顯著升高[4-5]，NK細胞(CD56+CD27+)/TH17細胞比值下降，通過促進局部炎癥反應(yīng)導(dǎo)致不良妊娠結(jié)局[6]。而URSA患者的子宮蛻膜組織中CD4+T細胞/ CD8+T細胞比值升高，可能是通過效應(yīng)T細胞的激活擾亂了母胎免疫耐受狀態(tài)。此外，母胎免疫耐受的維持還有賴于細胞因子的作用，URSA患者中1型輔助淋巴細胞(Th1)與2型輔助淋巴細胞(Th2)平衡向Th1偏離亦可解釋其不良妊娠結(jié)局[5]。

1.2.2封閉抗體與HLA封閉抗體被認為可通過封閉混合淋巴反應(yīng)誘導(dǎo)母胎耐受[7]。在URSA患者中，由于夫妻雙方的人類白細胞抗原(HLA)具有高度組織相容性，不能誘導(dǎo)產(chǎn)生足夠封閉抗體，導(dǎo)致胎兒被母體免疫系統(tǒng)攻擊[8]。此外，研究者發(fā)現(xiàn)HLA的非經(jīng)典I類分子尤其是HLA-G在母胎界面中表達并發(fā)揮重要免疫調(diào)節(jié)作用，考慮其表達水平異?？赡芘cRSA有關(guān)[9]。

2 治療進展

2.1 染色體異常

2.1.1胚胎植入前遺傳學(xué)篩查隨著輔助生殖技術(shù)水平的提高，胚胎植入前遺傳學(xué)篩查(PGS)可通過對胚胎進行染色體分析篩選出整倍體胚胎進行移植，使高齡婦女、RSA、反復(fù)胚胎種植失敗等具有高非整倍胚胎風(fēng)險的人群獲益[10]。

既往研究受限于體外胚胎培養(yǎng)技術(shù)、染色體篩查技術(shù)耗時和胚胎移植時間窗的沖突，多選擇在胚胎發(fā)育第3天取卵裂球細胞并采用熒光原位雜交技術(shù)(FISH)，雖可篩選出異常核型，但所得結(jié)果均未發(fā)現(xiàn)PGS對妊娠結(jié)局的明顯改善作用。而隨著囊胚培養(yǎng)技術(shù)的日益成熟，第二代PGS技術(shù)包括微陣列比較基因組雜交(aCGH)等，通過對囊胚期活檢所得滋養(yǎng)層細胞行全染色體篩查技術(shù)，較第一代在胚胎種植率和繼續(xù)妊娠率上都有很大改善[11]。Hodes-Wertz等[12]采用aCGH技術(shù)，將妊娠結(jié)局與既往數(shù)據(jù)得出的預(yù)期數(shù)據(jù)比較，發(fā)現(xiàn)PGS能顯著降低URSA患者的妊娠丟失率。然而，由于aCGH的費用高昂，臨床應(yīng)用時應(yīng)考慮其成本效益。Murugappan等[13]采納Hodes-Wertz等的研究數(shù)據(jù)，結(jié)合已有文獻數(shù)據(jù)對aCGH的成本效益進行評估，發(fā)現(xiàn)其每避免1例妊娠丟失需多花費135 054美元，高于成本效果閾值，較之期待療法并無優(yōu)勢。

新一代測序技術(shù)(NGS)可一次同時對大量DNA分子進行序列測定，平均成本同時縮減了測序時間，提高了PGS技術(shù)的可推廣性。此外，嵌合體作為獨立于年齡之外的對URSA人群妊娠結(jié)局的影響因素[14]，其預(yù)后與異常核型所占比例及受累染色體情況有關(guān)。既往技術(shù)由于對嵌合體診斷的精確度有限，容易誤診并影響PGS應(yīng)用后的妊娠結(jié)局[15-16]。研究發(fā)現(xiàn)，對囊胚期滋養(yǎng)細胞采用NGS后嵌合體的檢出率(21%)高于aCGH(4.8%)[14]?；谝陨蟽?yōu)勢，目前NGS已取代aCGH為大部分生殖中心所采用[17]。今后，利用NGS對嵌合體的高檢出精度對嵌合體進一步分型并指導(dǎo)移植傾向，是應(yīng)用PGS技術(shù)實現(xiàn)精準(zhǔn)移植的新方向。

2.2 抑制同種免疫

2.2.1環(huán)孢素環(huán)孢素(CsA)作為一種免疫抑制劑，已廣泛應(yīng)用于器官移植及自身免疫性疾病領(lǐng)域。近來研究發(fā)現(xiàn)，CsA在妊娠免疫中具有雙向調(diào)節(jié)作用，其可通過改善母胎界面Th2優(yōu)勢等機制促進免疫耐受，也可通過MAPK/ERK1/2等信號傳導(dǎo)通路促進人滋養(yǎng)細胞的增殖并改善滋養(yǎng)細胞的侵襲，從而有利于正常妊娠的維持，提示CsA在生殖領(lǐng)域的應(yīng)用前景。

動物實驗發(fā)現(xiàn)低劑量CsA對異常妊娠有改善作用[18]，而高劑量CsA可能破壞正常妊娠穩(wěn)態(tài)[19]。說明CsA的適用劑量及臨床適應(yīng)征的選擇還需要進一步的探索。臨床上國內(nèi)已有研究證實單用CsA 2～4mg/kg[20]或在其他免疫療法基礎(chǔ)上加用CsA 30mg/d[21]或100～150mg/d[22]，維持CsA血藥濃度在50～180mg/L時，能顯著改善難治性免疫性RSA妊娠結(jié)局。雖研究人群并非URSA，研究結(jié)果對CsA的臨床應(yīng)用已起到一定提示作用。目前關(guān)于CsA對生殖領(lǐng)域的臨床應(yīng)用的研究資料有限，且由于研究方法和樣本量的限制，對于CsA的確切效果及安全性，仍亟待大樣本的雙盲隨機對照研究證實。

2.2.2靜注免疫球蛋白有假說認為丙種球蛋白可通過糾正異常Th1/Th2比值、誘導(dǎo)封閉抗體產(chǎn)生或抑制NK細胞活性等多種機制，提高胚胎種植率并發(fā)揮維持早期妊娠的作用[23]。

Hutton等[24]的系統(tǒng)綜述經(jīng)亞組分析發(fā)現(xiàn)靜脈注射丙種球蛋白(IVIg)雖對總URSA人群無益，但可提高繼發(fā)性URSA人群活產(chǎn)率(OR=2.71, 95%CI 1.09～6.73)。此后Stephenson[25]及Christiansen等[26]開展了限定研究人群為繼發(fā)性URSA患者的小樣本隨機雙盲對照研究，發(fā)現(xiàn)以500mg/kg IVIg干預(yù)至孕中期，活產(chǎn)率較安慰劑組均無明顯差異(P=0.76和P=0.67)。Egerup等[27]的meta分析仍考慮繼發(fā)性URSA人群較原發(fā)性URSA人群有更大獲益潛力。Wang等[28]的meta分析則認為各URSA人群對IVIg的獲益程度差異不明顯，反而是應(yīng)用IVIg的時間對其有效性有顯著影響，其亞組分析發(fā)現(xiàn)妊娠前應(yīng)用IVIg較安慰劑對照能顯著提高活產(chǎn)率(RR = 1.67, 95% CI 1.30 ～2.14)。

Hviid等[29]在綜述免疫治療對體外受精胚胎移植結(jié)局的作用時曾提出接受干預(yù)人群首先需滿足免疫治療靶點存在異常的條件方能受益的觀點。Ramos-Medina等[30]的回顧性研究也發(fā)現(xiàn)，對外周血NK細胞升高的URSA人群行IVIg干預(yù)(早期400mg/kg，中、晚期200mg/kg)至35～36孕周后，活產(chǎn)率較未干預(yù)組顯著升高(96.3%比30.8%,P<0.0001)，該研究結(jié)果與Hviid等的觀點一致，提示IVIg對特定URSA人群可能有妊娠改善作用。由于IVIg的臨床有效性尚無大樣本臨床研究數(shù)據(jù)支持，目前在出現(xiàn)強力證據(jù)前暫不推薦常規(guī)應(yīng)用。

2.2.3脂肪乳脂肪乳是腸外營養(yǎng)中供給能量的要素之一，近年因被發(fā)現(xiàn)其活性成分具有抑制Th1型細胞因子的作用[31]，且與IVIg具有相近的抑制NK細胞活性的能力[32]，正逐漸被嘗試應(yīng)用于生殖領(lǐng)域。Meng等[33]就曾試圖將脂肪乳作為IVIg的替代品用于URSA人群的治療。在該樣本量為192例的前瞻性隨機對照研究中，研究組靜脈注射20%脂肪乳干預(yù)(妊娠前250ml/2周，妊娠后250ml/周)至12周，對照組IVIg干預(yù)(妊娠前25g/m，妊娠后25g/周)至12周，最終兩組妊娠成功率無差異(92.1%比88.2%,P=0.415)。該研究還進一步證實了脂肪乳在體內(nèi)對NK細胞也有抑制作用，并發(fā)現(xiàn)其有增加滋養(yǎng)層細胞侵襲性的作用。因此，脂肪乳有應(yīng)用于URSA的可行性，但其對URSA患者的妊娠結(jié)局是否有改善作用仍缺乏數(shù)據(jù)支持。

2.2.4異體淋巴細胞基于對封閉抗體的認識，有學(xué)者開始提出異體淋巴細胞免疫治療(ALIT)的方法，認為其可能通過提供異體HLA誘導(dǎo)患者產(chǎn)生并維持封閉抗體，抑制TH1細胞因子及NK細胞活性，發(fā)揮建立母胎免疫耐受的作用[7]。既往關(guān)于ALIT的臨床研究結(jié)論一直有較大爭議，考慮到尚無證據(jù)表明ALIT的有效性以及細胞制品的特殊性導(dǎo)致其可能對患者帶來的母嬰風(fēng)險，美國食品藥品監(jiān)督局(FDA)在2002年對醫(yī)療結(jié)構(gòu)發(fā)表公開信叫停了ALIT，僅允許少數(shù)醫(yī)療科研機構(gòu)在嚴(yán)格監(jiān)管下開展。2011年英國皇家婦產(chǎn)科醫(yī)師學(xué)院(RCOG)復(fù)發(fā)性流產(chǎn)診治指南均不推薦進行淋巴細胞免疫治療。截至2014年，Wong等[34]的綜述納入了15篇關(guān)于ALIT治療URSA的高質(zhì)量臨床研究后認為異體淋巴細胞對妊娠結(jié)局較之安慰劑對照無改善作用。

國內(nèi)仍有大量更新的臨床研究，Liu 等[35]的meta分析中新納入了5例近來國內(nèi)較高質(zhì)量的臨床隨機對照研究后發(fā)現(xiàn)，ALIT能提高URSA的活產(chǎn)率(OR=3.74,95%CI 3.07～4.57)，亞組分析還發(fā)現(xiàn)妊娠前后均應(yīng)用ALIT且采取低劑量的淋巴細胞注射效果更為明顯。此后陳雷寧等[36]開展了國內(nèi)首例大型前瞻性單盲隨機對照研究，認為ALIT不能對URSA有明顯保胎作用。其將638例URSA患者隨機分為ALIT 組和對照組，ALIT組進行ALIT 6～8 次，復(fù)查封閉抗體轉(zhuǎn)陽后積極試孕，最終發(fā)現(xiàn)各妊娠結(jié)局較安慰劑對照組均無顯著差異。張瑩等[37]則提出可對URSA患者人群進一步細分，認為根據(jù)患者與供血者HLA相容位點數(shù)指導(dǎo)治療可提高URSA免疫治療后的妊娠率。

綜上所述，目前ALIT在國際上不受認可，我國對此治療方法雖有推崇，但目前各研究質(zhì)量不一，結(jié)論各異，仍缺乏嚴(yán)格的多中心大樣本臨床隨機對照研究。

2.2.5糖皮質(zhì)激素既往研究發(fā)現(xiàn)糖皮質(zhì)激素對RSA患者子宮高水平的NK細胞具有降調(diào)作用，在考慮到糖皮質(zhì)激素強大的抗炎作用及免疫抑制效應(yīng)，研究者認為其對于RSA的預(yù)防可能起到一定積極作用[38]。Gomaa等[39]雙盲隨機對照研究發(fā)現(xiàn)，在肝素+阿司匹林治療方案基礎(chǔ)上加用口服潑尼松龍(5mg/d)能顯著提高URSA患者妊娠率(70.3%比9.2%, 95%CI 3.71～15.7)。Tang等[40]則對子宮高水平NK細胞(≥5%)的URSA人群單用口服潑尼松龍治療(20mg/d×6周，10mg/d×1周，5mg/d維持)后發(fā)現(xiàn)，治療組較安慰劑組未能顯著提高活產(chǎn)率(60%比40%, 95%CI 0.8～2.9)。由于多數(shù)研究采用的是口服潑尼松龍與其他免疫療法的聯(lián)合方案，單用激素的對照研究由于樣本量較小，所得結(jié)論意義有限，故目前仍難以判斷激素的單獨應(yīng)用價值。

2.2.6孕酮在一定孕激素水平下，孕激素受體陽性的淋巴細胞和脫膜CD56+細胞可分泌孕激素誘導(dǎo)封閉因子(PIBF)，誘導(dǎo)Th1/Th2平衡向Th2型轉(zhuǎn)化，下調(diào)NK細胞并提高封閉抗體數(shù)量誘導(dǎo)免疫耐受，從而有利于妊娠[41]。提示孕酮對于RSA可能有一定治療作用。

在對URSA人群的研究中，Coomarasamy等[42]的一項多中心雙盲臨床隨機對照研究分別對404名及432名URSA患者采用微粉化黃體酮400mg bid.或安慰劑陰道栓治療至妊娠12周，發(fā)現(xiàn)兩組活產(chǎn)率無明顯差異(65.8%比63.3%,P=0.45)，認為陰道途徑使用的孕酮不能使URSA人群受益。而此前Kumar等[43]的雙盲隨機對照研究則發(fā)現(xiàn)口服地屈孕酮20mg/d能降低URSA患者的流產(chǎn)率，其將360名URSA患者平分為兩組，分別給予口服地屈孕酮或安慰劑支持治療至妊娠20周，并納入180位健康人群作為對照組，發(fā)現(xiàn)地屈孕酮組流產(chǎn)率顯著低于安慰劑組(6.9%比16.8%,P=0.004)，與健康人群無明顯差異 (6.9%比3.5%,P=0.22)?？傮w而論，孕酮對URSA人群的作用尚不明確，或可作為支持治療的一種選擇，但由于孕酮藥物的成分和劑型的多樣性以及各臨床研究用量的不統(tǒng)一，目前仍難以給出治療方式的參考意見。

2.2.7粒細胞集落刺激因子動物實驗曾提示粒細胞集落刺激因子(G-CSF)在母胎界面的調(diào)節(jié)作用，考慮到其廣泛被應(yīng)用于預(yù)防或糾正癌癥患者化療后粒細胞降低的情況時也未有胚胎毒性相關(guān)的報道[44]。Scarpellini等[45]首次開展了相關(guān)臨床隨機雙盲對照實驗，該研究納入68名既往IVIg治療無效的URSA患者，分別于排卵后第6天皮下注射G-CSF 1μg/(kg·d) 或生理鹽水至妊娠12周，發(fā)現(xiàn)G-CSF干預(yù)組的活產(chǎn)率顯著高于對照組(82.8% vs.48.5%,P=0.006)，兩組在流產(chǎn)率及各種副作用上均無明顯差異，提示了G-CSF在生殖領(lǐng)域應(yīng)用的可能性。但由于缺乏后續(xù)大型臨床研究的證實，目前對其實際有效性還難以評估。

2.3 抗凝治療

早期的觀察性研究發(fā)現(xiàn)，RSA患者中病因為抗磷脂綜合和血栓形成傾向的人群與URSA人群有一定相似性，故有研究者主張對URSA人群進行經(jīng)驗抗凝治療。

2.3.1單獨應(yīng)用低分子肝素(LMWH)因具有一定免疫調(diào)節(jié)以及增強滋養(yǎng)層細胞的粘附性和侵襲性的作用，在妊娠過程中的積極作用亟待探討。既往關(guān)于單用LMWH的研究方法異質(zhì)性明顯，檢驗效度不高，直到Pasquier等[46]才首次開展了針對URSA患者的多中心隨機雙盲安慰劑對照臨床研究。其將258名URSA患者隨機分兩組并分別靜注依諾肝素40mg/d或安慰劑，最終發(fā)現(xiàn)兩組活產(chǎn)率無顯著差異(66.6%比72.9%,P=0.34)，提示單用LMWH不能提高無血栓形成傾向的RSA患者的活產(chǎn)率。

2.3.2聯(lián)合應(yīng)用一項納入9篇RCT的系統(tǒng)綜述[47]評價了各種抗凝療法，認為已有RCT的質(zhì)量有限，目前尚無證據(jù)支持各種抗凝治療對伴或不伴遺傳性血栓形成傾向的患者有利。最近Maged等[48]開展的臨床隨機對照研究則發(fā)現(xiàn)，在URSA患者中聯(lián)合應(yīng)用阿司匹林75mg/d口服及肝素5000U/d皮下注射能顯著提高臨床妊娠率(73.33%比43.33%,P=0.018)。

此外，Lu等[49]的研究提出根據(jù)URSA患者的血栓前狀態(tài)進行分組并針對性用藥的治療方式，其對花生四烯酸誘導(dǎo)血小板聚集率較高的患者選用阿司匹林治療，對D-Dimer水平較高的患者選用LMWH治療，發(fā)現(xiàn)能特異的顯著改善患者血栓前狀態(tài)，并收獲較好妊娠結(jié)局。此外，Koo等[50]也嘗試對子宮血流減少的URSA患者特異的應(yīng)用LMWH，發(fā)現(xiàn)子宮放射狀動脈血流阻力指數(shù)(URa-RI)≥0.5的URSA患者經(jīng)皮下注射依諾肝素40～60mg/d治療1周后，URa-RI顯著降低，且干預(yù)組最終妊娠結(jié)局與正常妊娠人群對照無明顯差異(73.3%比85.0%,P=0.434)。提示抗凝治療方案未來在改善特定患者的妊娠結(jié)局方面可能有輔助治療意義。

3 結(jié)論

基于以上對各治療進展的綜述，目前對URSA人群的治療尚無確切療法。PGS在改善流產(chǎn)率方面的作用已初步得到肯定。對于有一定指征的特定人群，抗凝治療可能也有一定輔助治療意義?；谕N免疫機制的假設(shè)而出現(xiàn)的免疫治療方案中，環(huán)孢素A已具有初步臨床有效性，但其對胎兒的安全性尚未明確，還處于探索階段。