Batnairamdal Chuluun，王金鑫，李芮琳，盧國彥，郭 虹，柴麗娟，張 玥，王少峽，胡利民

血管性癡呆（VD）是與腦血管疾病有關(guān)的老年期癡呆的一種主要類型，多與神經(jīng)損傷、腦血管疾病的危險(xiǎn)因素（高血壓、糖尿病等）有關(guān)，臨床表現(xiàn)為認(rèn)知功能障礙，記憶力下降等[1]。隨著中國老齡化社會(huì)的到來，近年VD的發(fā)病率明顯上升，所以尋找有效預(yù)防和治療VD的藥物迫在眉睫。心腦舒通膠囊的有效成分為蒺藜科植物的干燥全草提取物,其主要成分為以呋甾醇與螺甾醇為主要成分的蒺藜總皂苷，具有活血化瘀，舒利血脈的作用[2-3]。臨床多應(yīng)用于防治胸痹心痛、中風(fēng)恢復(fù)期的半身不遂、語言障礙和動(dòng)脈硬化等心腦血管缺血性疾病，并取得確切的療效[4-5]。本研究采用雙側(cè)頸總動(dòng)脈永久性結(jié)扎的方法制作VD大鼠模型，通過考察癡呆大鼠學(xué)習(xí)記憶能力、大腦海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞的狀態(tài)、星形膠質(zhì)細(xì)胞及小膠質(zhì)細(xì)胞的表達(dá)來探究心腦舒通膠囊對VD大鼠的神經(jīng)保護(hù)作用及可能機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康雄性SPF級Wistar大鼠80只，體質(zhì)量（300±20）g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，許可證號：SCXK（北京）2012-0001，動(dòng)物飼養(yǎng)于天津市實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，分籠飼養(yǎng)，自由飲食、飲水，飼養(yǎng)溫度為22～25℃，相對濕度40%～60%，每周更換墊料2次。

1.2 藥品及試劑 心腦舒通樣品（其中呋甾皂苷含量約占43.18%，由吉林敖東洮南藥業(yè)股份有限公司提供），臨用前用生理鹽水溶解。星形膠質(zhì)細(xì)胞特異性蛋白GFAP的抗體（Sc-6171）、Donkey anti-goat Ig G（Sc-2042）購自 Santacruz；小膠質(zhì)細(xì)胞特異性蛋白Iba-1的抗體（Ab5076）購自Abcam。尼氏染色試劑盒、防脫載玻片、中性樹膠封片液購自碧云天公司。磷酸鹽緩沖液（PBS）；多聚甲醛；二甲苯；無水乙醇；95%乙醇等化學(xué)試劑均為市售分析純。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器 水迷宮系統(tǒng)（北京碩林源科技有限公司，Topscan lite）；全自動(dòng)封閉脫水機(jī)（LEICA，ASP300S）；病理撈片機(jī)（LEICA，HI1210）；烤片機(jī)（LEICA，HI1220）；生物組織包埋機(jī)（BMJ-1，天津航空機(jī)電公司）；切片機(jī)（LEICA，RM2135）；光學(xué)顯微鏡（OLYMPUS，CHA30）；顯微數(shù)碼拍攝圖像分析系統(tǒng)（Nikon，NIS-Elemenis）等。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 動(dòng)物模型復(fù)制方法 參照文獻(xiàn)[6]，本實(shí)驗(yàn)采用雙側(cè)頸總動(dòng)脈永久性結(jié)扎的方法復(fù)制VD大鼠模型，術(shù)前12h禁食不禁水，異氟烷氣體麻醉。將Wistar大鼠仰臥固定四肢，頸部正中切口，分離左側(cè)頸總動(dòng)脈，用4號線結(jié)扎，縫合皮膚，一周后重新麻醉，分離右側(cè)頸總動(dòng)脈并用4號線進(jìn)行結(jié)扎，縫合皮膚。對照組只分離頸總動(dòng)脈，穿線但不結(jié)扎。

2.2 實(shí)驗(yàn)分組及給藥 將造模成功的54只大鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為3組：心腦舒通56 mg/kg組（XNST-56）、心腦舒通 14 mg/kg組（XNST-14）、模型組各18只，對照組10只。心腦舒通組成模后給予心腦舒通混懸液（10 mL/kg體質(zhì)量）灌胃；模型組和對照組給予等量的生理鹽水灌胃，每天灌胃給藥1次，持續(xù)給藥60 d。

2.3 檢測方法

2.3.1 Morris水迷宮檢測 水迷宮實(shí)驗(yàn)是利用水迷宮系統(tǒng)和小動(dòng)物運(yùn)動(dòng)行為分析系統(tǒng)研究大鼠的海馬等腦區(qū)受到損害后的學(xué)習(xí)、記憶和空間定向以及認(rèn)知能力的實(shí)驗(yàn)。分為環(huán)境熟悉、定位巡航和空間探索3個(gè)階段。第1階段主要使大鼠熟悉實(shí)驗(yàn)環(huán)境及實(shí)驗(yàn)人員；定位航行階段，主要記錄大鼠的逃避潛伏期的變化；空間探索階段，主要記錄大鼠穿過平臺(tái)的次數(shù)和游泳速度。

2.3.2 海馬CA1區(qū)的尼氏染色 大鼠光鏡下觀察海馬CA1區(qū)神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變，在40×10倍的光鏡下隨機(jī)選擇5個(gè)視野，統(tǒng)計(jì)神經(jīng)元的個(gè)數(shù)，以對照組作為100%，統(tǒng)計(jì)其他各組的百分比。

2.3.3 SABC法染色GFAP和Iba-1 星形膠質(zhì)細(xì)胞（GFAP）和小膠質(zhì)細(xì)胞（Iba-1）染色標(biāo)本為心臟灌流固定后的腦組織，進(jìn)行切片。應(yīng)用SABC免疫組化法和DAB顯色法分別對組織中GFAP和Iba-1進(jìn)行染色，光鏡下觀察星形膠質(zhì)細(xì)胞的形態(tài)及數(shù)量變化情況。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。所有數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，數(shù)據(jù)處理采用單因素方差分析（One-way ANOVA），組間兩兩比較采用LSD法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 心腦舒通膠囊對VD大鼠體質(zhì)量的影響 造模成功后，給藥過程中，每周稱量一次大鼠體質(zhì)量統(tǒng)計(jì)。見圖1。從圖1中可以看出，與對照組比較，手術(shù)組在初始前3周時(shí)，體質(zhì)量顯著下降（P＜0.01），給予心腦舒通膠囊治療3周后，治療組體質(zhì)量增加，恢復(fù)到接近對照組的水平。

3.2 心腦舒通膠囊對VD大鼠學(xué)習(xí)和記憶的改善作用 水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，心腦舒通膠囊對VD大鼠學(xué)習(xí)和記憶的改善作用，如圖2所示。與對照組比較，模型組的逃避潛伏期明顯增加（P＜0.01），與模型組比較，心腦舒通14 mg/kg及56 mg/kg組逃避潛伏期明顯降低（P＜0.01）。空間探索實(shí)驗(yàn)表明，與對照組相比較，模型組通過平臺(tái)的次數(shù)明顯減少（P＜0.01），各治療組通過平臺(tái)次數(shù)有所增加，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。通過對各組大鼠空間探索階段游泳速度的統(tǒng)計(jì)，各組大鼠體力沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。

圖1 心腦舒通膠囊對VD大鼠體質(zhì)量的影響Fig.1 Effectsof XNST on VD ratsof body weight

圖2 心腦舒通膠囊對VD大鼠學(xué)習(xí)和記憶的改善作用Fig.2 Effectsof XNST on VD ratsoflearning and memory ability

3.3 心腦舒通膠囊對VD大鼠腦組織病理損害的影響 尼氏染色結(jié)果表明，對照組腦組織切片中可見海馬CA1區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞染色較深，尼氏體顆粒較大且多見，細(xì)胞排列整齊，核仁清晰可見，見圖3。模型組腦組織切片中可見海馬CA1區(qū)神經(jīng)細(xì)胞排列紊亂、稀疏，染色淺，尼氏體顆粒小，數(shù)量少。心腦舒通56 mg/kg組腦組織切片中可見海馬CA1區(qū)尼氏體染色較深，顆粒大且多見，細(xì)胞排列整齊，接近正常。對其神經(jīng)細(xì)胞的數(shù)目進(jìn)行統(tǒng)計(jì)可以看出，模型組比對照組神經(jīng)細(xì)胞數(shù)目明顯降低（P＜0.01），給藥后心腦舒通56 mg/kg組較模型組神經(jīng)細(xì)胞顯著性增加（P＜0.01），心腦舒通14 mg/kg組也有增加趨勢，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。

3.4 心腦舒通對VD呆大鼠GFAP和Iba-1表達(dá)的影響 采用SABC免疫組化法來探究心腦舒通膠囊對星形膠質(zhì)細(xì)胞GFAP和小膠質(zhì)細(xì)胞Iba-1表達(dá)的影響，結(jié)果表明，模型組大鼠海馬CA1區(qū)GFAP和Iba-1表達(dá)明顯增多，細(xì)胞深染，突起變長、增粗和分支增多，見圖4。而心腦舒通給藥組GFAP和Iba-1表達(dá)減少，細(xì)胞染色較淺，突起細(xì)短，從而證明心腦舒通膠囊能抑制缺血損傷后星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞的過度活化，抑制GFAP和Iba-1的表達(dá)。

4 討論

VD是指各種腦血管病引起腦功能障礙而產(chǎn)生的獲得性智能損害綜合征，是僅次于阿茨海默氏病的第2位的最常見癡呆[7]。然而由于生存環(huán)境、生活方式、體質(zhì)差異等原因，也有報(bào)道稱在亞洲及許多發(fā)展中國家，VD視為老年性癡呆的首發(fā)原因[8-9]。VD的主要臨床癥狀為記憶力減退和認(rèn)知功能障礙，這與大腦海馬區(qū)的功能相關(guān)。海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞的損傷死亡是導(dǎo)致VD的主要原因，所以神經(jīng)細(xì)胞損傷后的修復(fù)對VD的治療具有重大的意義。小膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的巨噬細(xì)胞，具有免疫防御和炎癥反應(yīng)[10]，在生理?xiàng)l件下，休眠的小膠質(zhì)細(xì)胞有平衡神經(jīng)系統(tǒng)和支持神經(jīng)細(xì)胞的重要作用。抑制小膠質(zhì)細(xì)胞過度活化所引起的炎癥反應(yīng)可以作為治療和緩解神經(jīng)退行性疾病和腦損傷的重要途徑之一[11-12]。星形膠質(zhì)細(xì)胞具有支持、營養(yǎng)神經(jīng)細(xì)胞的作用，但在腦缺血的病理狀態(tài)下，星形膠質(zhì)細(xì)胞被激活后產(chǎn)生大量的一氧化氮、白細(xì)胞介素-6等細(xì)胞毒性因子，而引起神經(jīng)元的損傷[13-14]。所以在腦損傷后抑制小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞的過度表達(dá)，對腦損傷后的恢復(fù)具有重要意義。心腦舒通膠囊的主要成分為蒺藜總皂苷，具有舒利血脈、平肝解郁、活血祛風(fēng)的藥理作用，現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)蒺藜皂苷具有降血脂、改善腦循環(huán)，保護(hù)缺血腦組織的作用等[15-16]，臨床多用于腦中風(fēng)后的恢復(fù)等心腦血管疾病。

圖3 心腦舒通膠囊對VD大鼠腦組織病理損害的影響Fig.3 Effects of XNST on VD rats of neuronal cell count in hippocampus

圖4 心腦舒通對VD大鼠GFAP和Iba-1表達(dá)的影響Fig.4 Effectsof XNST on VD ratsof the expression GFAP and IBA-1 of the hippocampus

本研究表明，心腦舒通膠囊能顯著提高VD大鼠的學(xué)習(xí)和記憶能力，心腦疏通能明顯降低大鼠的水迷宮逃避潛伏期，明顯增加在定位巡航階段穿過平臺(tái)的次數(shù)。海馬CA1區(qū)尼氏染色表明，心腦舒通膠囊能改善神經(jīng)細(xì)胞的形態(tài)和活力,促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞再生。此外，心腦舒通能降低星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞的過度活化，抑制GFAP和Iba-1表達(dá)。這些結(jié)果為心腦舒通膠囊對VD大鼠的神經(jīng)保護(hù)作用及部分機(jī)制提供理論依據(jù)。

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