李理，陳麗娥，王劍飛，殷瑞杰，李寶磊，李言郡，陳蘇

(1.杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司研究院生物工程研究所，杭州310018；2.黑龍江省綠色食品科學(xué)研究院，哈爾濱150028)

0 引言

西藏地處青藏高原，是我國五大牧區(qū)之一。西藏地區(qū)的環(huán)境較為干燥、日照充足、晝夜溫差大，擁有豐富的奶資源，發(fā)酵奶制品種類繁多，主要有酸乳、酥油、奶渣、奶酒等[1]。西藏地區(qū)的發(fā)酵奶制品通常采用古老的傳統(tǒng)方法制作而成，并蘊(yùn)含了相當(dāng)豐富的乳酸菌菌種資源，當(dāng)?shù)鼐用褚查L期保持著食用發(fā)酵奶制品的習(xí)慣。這些菌株經(jīng)過長時(shí)間的馴化，產(chǎn)生了優(yōu)良且獨(dú)特的發(fā)酵性能，可使發(fā)酵奶制品形成良好的組織狀態(tài)和獨(dú)特的風(fēng)味口感。

乳酸菌產(chǎn)生的胞外多糖（Exopolysaccharides，EPS）是發(fā)酵奶制品形成黏稠、拉絲等特殊質(zhì)構(gòu)的重要物質(zhì)之一，亦可提供絲滑的口感，起到為發(fā)酵奶制品增稠、穩(wěn)定、乳化、凝膠及持水等作用[2]。因此，篩選能夠高產(chǎn)胞外多糖的菌株一直是研究者們關(guān)注的重點(diǎn)方向。

高海拔地區(qū)傳統(tǒng)發(fā)酵奶制品中的菌種是我國獨(dú)有珍貴的乳酸菌菌種資源，對(duì)這些菌種進(jìn)行分離、保藏、多樣性分析及發(fā)酵性能的研究，對(duì)開發(fā)具有我國自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的生產(chǎn)用乳酸菌菌種具有重要的意義[3]。本研究采集了西藏高海拔地區(qū)的22份傳統(tǒng)發(fā)酵奶制品，并對(duì)其中的乳酸菌進(jìn)行分離、純化、多樣性分析及發(fā)酵性能研究，旨在篩選到具有良好產(chǎn)黏性狀的菌株，為開發(fā)新型特色乳酸菌發(fā)酵劑提供菌種資源支持。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 樣品來源

試驗(yàn)所用的樣品采集自西藏當(dāng)雄、格達(dá)鄉(xiāng)等6個(gè)地區(qū)的22份傳統(tǒng)自制發(fā)酵奶制品，其中包括奶渣（干/濕）5份、發(fā)酵酸牛乳（耗牛/奶牛）7份、酥油5份、奶酒2份、西藏靈菇2份。

1.2 培養(yǎng)基與試劑

M RS肉湯培養(yǎng)基，用于乳桿菌的增殖培養(yǎng)，英國OXO ID公司；M RS固體培養(yǎng)基，液體培養(yǎng)基中添加1.8%瓊脂，用于乳桿菌的分離培養(yǎng)；M 17肉湯培養(yǎng)基，用于乳球菌的增殖培養(yǎng)，美國BD公司；M 17固體培養(yǎng)基，液體培養(yǎng)基中添加1.8%瓊脂，用于乳球菌的分離培養(yǎng)；脫脂乳培養(yǎng)基，10%脫脂乳，105℃滅菌10 min，用于原始樣品的活化。

細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒，上海生工生物工程有限公司；PCR擴(kuò)增試劑，寶生物工程（大連）有限公司；脫脂乳粉，新西蘭恒天然集團(tuán)；硫酸、苯酚、氯化鈉均為國產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

1.3 儀器與設(shè)備

SG 403A-HE-INT型超凈工作臺(tái)，5417R型高速離心機(jī)，TW 20型電熱恒溫水浴鍋，BX 50型光學(xué)顯微鏡，XR+型凝膠成像儀，Mastercycler PROS型PCR儀，HV-110全自動(dòng)高壓蒸汽滅菌鍋，KB400型生化培養(yǎng)箱，SevenMulti型pH計(jì)，Mettler-Toledo；16-03342-01型乳品發(fā)酵監(jiān)控儀。

2 方法

2.1 樣品采集[4]

液體樣品用一次性無菌吸管轉(zhuǎn)移至預(yù)先裝有滅菌甘油的15 mL無菌離心管中，震蕩混勻后封口，標(biāo)記編號(hào)；固體和半固體樣品用燒過的藥匙挖取適量樣品（約10 g），直接裝于帶有滅菌甘油的50m L無菌離心管，確保樣品完全浸沒在甘油中，封口標(biāo)記編號(hào)。上述采集樣品各采集兩份，裝于內(nèi)含冰袋的保溫箱中，短時(shí)間內(nèi)運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室后-20℃保存，樣品盡快進(jìn)行微生物分離純化等試驗(yàn)。

2.2 乳酸菌的分離、純化和保藏

分離前，取適量原始樣品置于滅菌的脫脂乳培養(yǎng)基，37℃活化12 h。取經(jīng)活化的樣品用無菌生理鹽水梯度稀釋，其中稀釋度為10-4，10-5，10-6進(jìn)行M RS和M 17平板涂布；每個(gè)處理兩次重復(fù)。平皿置于厭氧袋中，37℃恒溫培養(yǎng)，至有單菌落形成。觀察菌落形態(tài)，并詳細(xì)記錄各菌落的顏色、大小、凸起程度和光澤度。挑取具有乳酸菌典型特征的單菌落接種于對(duì)應(yīng)的MRS或M 17液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)16～24 h。

取適量生長好的菌懸液涂片、固定、革蘭氏染色，觀察菌體細(xì)胞形態(tài)和排列方式。將形態(tài)和排列不一致的菌落培養(yǎng)物進(jìn)行劃線純化，直至鏡檢菌體細(xì)胞的形態(tài)和排列方式一致。

將純化好的菌株接種于MRS和M 17液體培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)2～3代。離心洗滌菌體，再次革蘭氏染色、鏡檢。純的菌體培養(yǎng)物添加適量甘油，分裝于1.8 mL無菌旋蓋凍存管中，標(biāo)號(hào)后入-80℃低溫冰箱保存。

2.3 乳酸菌分離株的鑒定

2.3.1 基因組DNA的提取

取1 mL各菌株的培養(yǎng)物置于1.5 mL無菌離心管中，室溫，轉(zhuǎn)速8 000 r/min離心1 min，棄上清，收集菌體，加入180μL溶菌酶溶液重懸菌體，37℃金屬浴60 min，再加入20μL蛋白酶K溶液，震蕩混勻，56℃金屬浴30 min至菌體細(xì)胞完全裂解。后續(xù)操作按試

PCR擴(kuò)增采用50μL反應(yīng)體系：2×PCR M aster-M ix 25.0μL，正向引物（濃度10μmol/L）1.0μL，反向引物（濃度10μmol/L）1.0μL，模板DNA 2.0μL，補(bǔ)加ddH2O至50μL。

PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5 min，94℃（1 min），57℃（1 min），72℃（1 min），30個(gè)循環(huán)；72℃延伸5 min；4℃保存。

PCR產(chǎn)物的檢測：PCR產(chǎn)物在含有EB質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。100 V電泳35 min，UV下觀察條帶，產(chǎn)物于4℃保存。

2.3.3 擴(kuò)增產(chǎn)物測序分析與比對(duì)

將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與16s通用引物送至上海生工生物有限公司進(jìn)行雙向測序。雙向測通的序列結(jié)果（未測通需進(jìn)行拼接）與NCBI-BLAST數(shù)據(jù)庫（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）中已鑒定菌株的16S rDNA序列進(jìn)行同源性比對(duì)，鑒定分離菌株的種屬。

2.4 產(chǎn)胞外多糖乳酸菌菌株的篩選[5]

2.4.1 菌落拉絲法初篩

將2.3.3中鑒定為乳酸菌的菌株活化后，選擇適當(dāng)?shù)南♂屘荻确謩e涂布于MRS和M 17平板，恒溫37℃培養(yǎng)24～48 h。用一次性無菌接種針挑取平板上黏稠且能形成明顯拉絲的單菌落，并記錄2 s內(nèi)垂直離開培養(yǎng)基表面形成連續(xù)拉絲的最大長度，每個(gè)菌落平行3次處理。

2.4.2 菌株復(fù)篩

將初篩中能形成明顯拉絲的菌落接種于50 mL MRS或M 17液體培養(yǎng)基中，37℃恒溫培養(yǎng)16～24 h。50 mL菌體培養(yǎng)物，加入1 mL體積分?jǐn)?shù)為80%的三氯乙酸，4℃靜置過夜，轉(zhuǎn)速8 000 r/min離心20 min，棄上清，裝入透析袋中置于去離子水中4℃透析24 h，每隔8 h換一次水。透析液中加入3倍體積的95%乙醇，4℃靜止過夜，多糖呈絮狀沉淀，轉(zhuǎn)速8 000 r/min離心20 min，棄上清，沉淀進(jìn)行冷凍干燥處理。得到的白色絮狀粉末進(jìn)行胞外多糖含量的測定，并結(jié)合拉絲情況復(fù)篩產(chǎn)胞外多糖的菌株。

2.5 胞外多糖含量的測定

多糖含量測定采用苯酚-硫酸法[6]，配置不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液，測定波長490 nm處的吸光值。葡萄糖濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=0.0116x-0.0074，R2=0.9994。

準(zhǔn)確稱取各菌株胞外多糖10 mg，純水定容至50 mL，采用苯酚-硫酸法測定其吸光值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計(jì)算胞外多糖的含量。

2.6 產(chǎn)胞外多糖菌株發(fā)酵的性能

劑盒標(biāo)準(zhǔn)抽提步驟進(jìn)行，提取得到的DNA立即進(jìn)行PCR擴(kuò)增或-20℃保存。

2.3.2 16S rDNA片段擴(kuò)增與檢測

擴(kuò)增引物采用乳酸菌16S rDNA片段通用引物，上 游 引 物 27F：5’-AGTCTCTGATCATGCCTCAG-3’，

下游引物1492R：5’-AAGGAGGTGCTCCAG CC-3’。

2.6.1 菌株產(chǎn)酸性能測試

復(fù)篩得到的菌株活化兩代后，生理鹽水調(diào)整菌液OD至0.8。2%比例接種至100m L質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%滅菌脫脂乳中，42℃靜止發(fā)酵12 h，發(fā)酵過程檢測乳樣品pH值變化，記錄并繪制變化曲線。

2.6.2 發(fā)酵乳流變性能測試[7]

發(fā)酵乳測試樣品4℃冷藏過夜后破乳，靜置30 min。取適量樣品進(jìn)行旋轉(zhuǎn)掃描測定各發(fā)酵乳的動(dòng)態(tài)黏度變化曲線，比較不同菌株發(fā)酵所得發(fā)酵乳樣品的質(zhì)構(gòu)特性。以市售直投式酸奶發(fā)酵劑為對(duì)照，對(duì)照發(fā)酵劑制備的酸奶質(zhì)構(gòu)粘稠，拉絲感強(qiáng)。

3 結(jié)果與分析

3.1 乳酸菌的分離結(jié)果

經(jīng)革蘭氏染色和過氧化氫酶實(shí)驗(yàn)，22份采集樣品中共分離出113株乳酸菌，在MRS和M 17平板上多數(shù)形成乳白色或半透明、邊緣整齊或有鋸齒狀、中間凸起、表面濕潤有光澤或粗糙的菌落。顯微鏡下，桿菌兩端呈現(xiàn)圓形短棒狀、線性排列，部分長桿呈現(xiàn)彎曲形態(tài)。球菌多數(shù)為橢球性或圓形，以成對(duì)、成鏈排列方式居多，部分乳酸菌鏡檢結(jié)果如圖1所示。

圖1 分離菌株革蘭氏染色鏡檢圖片

113株乳酸菌中，分離得到桿菌82株，占總分離菌株數(shù)量的72.57%，分離球菌數(shù)量31株，占27.43%。比較分析各樣品分離得到的桿菌、球菌數(shù)量可知（表1），除發(fā)酵酸牛乳樣品外，奶酒、奶渣、西藏靈菇等樣品中分離到的桿菌數(shù)量明顯多于球菌數(shù)量，說明22份西藏傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品中的乳酸桿菌為優(yōu)勢群體。

表1 西藏地區(qū)發(fā)酵乳制品分離乳酸菌數(shù)量統(tǒng)計(jì)

3.2 西藏地區(qū)傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品中乳酸菌多樣性分析

經(jīng)16S rDNA序列比對(duì)后，31株球菌中，鑒定出4個(gè)菌屬，分別為5株明串珠菌屬、18株鏈球菌屬、3株乳球菌屬、5株腸球菌屬。明串珠菌屬全部來源于奶渣和牦牛酥油樣品，分別為2株腸系膜明串珠菌、1株乳酸明串珠菌和1株假腸膜明串珠菌。鏈球菌屬中只有嗜熱鏈球菌（18株），其中14株來源于發(fā)酵酸牛乳樣品，另外4株來源于奶渣和酥油，說明嗜熱鏈球菌主要存在于發(fā)酵酸牛乳中，其余形式的發(fā)酵樣品中存在較少。乳球菌屬只有乳酸乳球菌乳酸亞種，來源于酥油、奶酒和奶渣樣品。腸球菌屬有2株堅(jiān)韌腸球菌，全部來自于酥油，另有3株屎腸球菌，分別來自于西藏靈菇和酥油。82株乳桿菌屬鑒定出12個(gè)菌種，其中德氏乳桿菌保加利亞亞種（23株）、發(fā)酵乳桿菌（18株）、瑞士乳桿菌（11株）、植物乳桿菌（9株）、短乳桿菌（7株）。占比最大的德氏乳桿菌保加利亞亞種主要來自于發(fā)酵酸牛乳和西藏靈菇，發(fā)酵乳桿菌主要來自于酥油，瑞士乳桿菌、植物乳桿菌主要來自于酥油和奶渣，短乳桿菌主要來自于奶酒。另外，酥油樣品中還分離得到1株卷曲乳桿菌和1株凝結(jié)芽孢桿菌。

分析上述結(jié)果，發(fā)現(xiàn)113株分離株中，德氏乳桿菌保加利亞亞種占總數(shù)量的10.18%，是本研究采集西藏地區(qū)傳統(tǒng)發(fā)酵奶制品中的優(yōu)勢菌株，這個(gè)結(jié)果與扎木蘇[4]

對(duì)西藏地區(qū)傳統(tǒng)牦牛奶制品中乳酸菌的多樣性分析結(jié)果是一致的。除德氏乳桿菌保加利亞亞種外，嗜熱鏈球菌和發(fā)酵乳桿菌也是本次采集樣品中的優(yōu)勢菌種，其他研究發(fā)現(xiàn)西藏地區(qū)的傳統(tǒng)發(fā)酵制品中的優(yōu)勢菌株還有戊糖片球菌[8]和乳明串珠菌[4]。

3.3 產(chǎn)胞外多糖菌株的篩選結(jié)果

產(chǎn)胞外多糖菌株的篩選旨在篩選到能夠?yàn)榘l(fā)酵乳提供質(zhì)地黏稠、有拉絲感的發(fā)酵劑菌種，因此初篩通過平板菌落拉絲法篩選到能夠產(chǎn)生黏性胞外多糖，其中菌落呈黏液狀或能夠形成明顯拉絲的菌株有16株，具體情況如表2所示。

表2 產(chǎn)胞外多糖初篩及復(fù)篩情況

由表2中可知，呈黏液狀（無拉絲）和能夠形成拉絲的菌落的菌株均能夠產(chǎn)生的胞外多糖。胞外多糖的含量基本與形成拉絲的長短一致，且產(chǎn)生胞外多糖較多的菌株均是能夠形成明顯的拉絲的菌株，說明我們篩選得到菌株產(chǎn)生的胞外多糖均為黏性胞外多糖[9]。綜合初篩拉絲長度和胞外多糖產(chǎn)量，初步確定德氏乳桿菌保加利亞亞種1576（LB1576）、嗜熱鏈球菌1605（ST 1605）和發(fā)酵乳桿菌1600（LF1600）為3株高產(chǎn)黏性胞外多糖的乳酸菌，并對(duì)其發(fā)酵性能進(jìn)一步研究。

3.4 高產(chǎn)胞外多糖菌株產(chǎn)酸性能

將LB1576、ST 1605、LF1600活化兩代后，接種至滅菌脫脂乳中，42℃靜止發(fā)酵12 h，檢測并記錄各樣品發(fā)酵過程中pH值的變化情況，結(jié)果如圖2所示。

圖2 高產(chǎn)胞外多糖菌株產(chǎn)酸性能

結(jié)果顯示，發(fā)酵過程中，3個(gè)樣品的pH值先逐漸降低后趨于平穩(wěn)，說明3株乳酸菌能夠利用脫脂乳中的營養(yǎng)成分產(chǎn)生乳酸，形成凝乳結(jié)構(gòu)。LF1600的產(chǎn)酸能力較強(qiáng)，發(fā)酵6 h后，pH值達(dá)到4.11，且后酸化比較穩(wěn)定,ST 1605的延滯期較短，在發(fā)酵前期的產(chǎn)酸速率較高，LB1576的產(chǎn)酸速率比較適中。

3.5 發(fā)酵乳流變學(xué)性能測試結(jié)果

為了確定篩選到的高產(chǎn)胞外多糖的菌株是否能賦予發(fā)酵乳較良好的組織狀態(tài)和質(zhì)構(gòu)特性，對(duì)3種發(fā)酵乳樣品的流變學(xué)性能進(jìn)行測試。通過旋轉(zhuǎn)掃描，能夠測定不同剪切應(yīng)變率下的黏度，這一指標(biāo)可以間接反映發(fā)酵乳在入口、留口和吞咽過程中的黏度變化趨勢，結(jié)果如圖3所示。

圖3 高產(chǎn)胞外多糖菌株發(fā)酵乳旋轉(zhuǎn)掃描測試結(jié)果

由圖3中結(jié)果可知，與對(duì)照商品直投式發(fā)酵劑相比，3株高產(chǎn)胞外多糖的菌株發(fā)酵所得的發(fā)酵乳能夠形成較高的黏度。當(dāng)剪切應(yīng)變速率在0.001～0.01 s-1時(shí)，發(fā)酵乳的狀態(tài)類似于處于貨架期和入口的狀態(tài)，此時(shí)的黏度較高，說明發(fā)酵乳能夠在貨架期內(nèi)表現(xiàn)出良好的穩(wěn)定性，同時(shí)在入口時(shí)表現(xiàn)出更好的稠厚感。有研究表明，發(fā)酵乳呈現(xiàn)出較高的黏度與其發(fā)酵菌株產(chǎn)生胞外多糖密切相關(guān)[10]。本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示，菌株LB1576產(chǎn)胞外多糖的含量最多，其發(fā)酵乳的黏度也最高，說明這株產(chǎn)黏性胞外多糖的乳酸菌LB1576作為發(fā)酵劑，能夠提高發(fā)酵乳的黏度，從而提高其在貨架期和消費(fèi)過程中的感官品質(zhì)。

4 結(jié)論

從22份西藏地區(qū)傳統(tǒng)發(fā)酵奶制品中共分離得到113株乳酸菌，經(jīng)16S rDNA比對(duì)鑒定可歸類為6個(gè)屬19個(gè)種。乳桿菌屬較為豐富，包含12個(gè)種，德氏乳桿菌保加利亞亞種23株、發(fā)酵乳桿菌18株、瑞士乳桿菌11株、植物乳桿菌9株、短乳桿菌7株、副干酪乳桿菌5株、開菲爾乳桿菌、羅伊氏乳桿菌、鼠李糖乳桿菌各2株、格氏乳桿菌、卷曲乳桿菌各1株，其中德氏乳桿菌保加利亞亞種是本研究采集樣品的優(yōu)勢菌種。

113株乳酸菌中篩選到16株可在乳基中產(chǎn)生胞外多糖的菌株，其中有3株產(chǎn)量較高，分別為德式乳桿菌保加利亞亞種1576、嗜熱鏈球菌1605和發(fā)酵乳桿菌1600。通過發(fā)酵性能測試，發(fā)現(xiàn)菌株1576的產(chǎn)酸適中、后酸化穩(wěn)定、發(fā)酵乳黏稠度高，能夠在一定程度上提高產(chǎn)品的感官品質(zhì)。

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