任彩霞，郭慧玲，李麗娜，張文羿，孫天松

(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)乳品生物技術(shù)與工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室奶制品加工農(nóng)業(yè)部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，呼和浩特 010018)

0 引言

乳酸菌是人們認(rèn)可的安全菌株，作為菌株發(fā)酵劑使用已有較長的歷史[1]。其定殖于人類及動(dòng)物的胃腸道中，對人體具有重要的益生作用[2-5]。保加利亞乳桿菌是發(fā)酵酸乳的主要乳酸菌之一，最早由保加利亞人Stam en Grigorov發(fā)現(xiàn)[6]，具有多種生理功能[7]。目前，人們使用抗生素來治療細(xì)菌感染，部分細(xì)菌對其產(chǎn)生了耐藥性。研究者們最初只發(fā)現(xiàn)某些食源性致病菌具有抗生素耐藥性[8]，之后，在葡萄球菌和乳酸菌中也檢測到了抗生素耐藥基因[9]。近年來的研究表明，我們食品中使用的乳酸菌有的具有抗生素耐藥性，有的甚至攜帶抗生素耐藥基因[10-12]，部分耐藥基因還可能進(jìn)行水平轉(zhuǎn)移[13-15]。保加利亞乳桿菌也不例外。AKPINAR[16]和SOZZ[17]報(bào)道，保加利亞乳桿菌對抗生素具有耐藥性，有的甚至具有多重耐藥性。

因此，為了判斷分離自新疆地區(qū)酸牛乳中保加利亞乳桿菌的安全性，本實(shí)驗(yàn)采用肉湯稀釋法測定5株受試菌株在15種抗生素條件下的耐藥表型，并通過PCR手段對已報(bào)道的耐藥基因進(jìn)行檢測。最終的實(shí)驗(yàn)結(jié)果可能會對同行的乳酸菌抗生素耐藥性研究提供一定的參考。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料

1.1.1 所用菌株與培養(yǎng)基

菌株：試驗(yàn)菌株保加利亞乳桿菌IMAU 32265，IMAU 32166，IMAU 32276，IMAU 32071，IMAU 32330均分離自新疆的酸牛乳，由內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)乳品生物技術(shù)與工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室乳酸菌菌種保藏庫(LABCC)提供。

培養(yǎng)基：M RS broth（OXO ID，CM 0359），M RSagar（OXO ID,CM 0361），LSM 培 養(yǎng) 基[18]:90%IST（ISO-SENSITEST broth；OXO ID，CM 0473），10%MRSbroth。

1.1.2 所用抗生素及試劑

抗生素：四環(huán)素（tetracycline，TET），新霉素（neomycin，NEO），紅霉素（erythromycin，ERY），卡那霉素（kanamycin，KAN），環(huán)丙沙星（ciprofloxacin，CIP），鏈霉素（streptomycin，STR），利福平（rifampicin，R IF），克林霉素（clindamycin，CLI），氨芐西林（ampicillin，AM P），奎奴普丁/達(dá)福普?。╭uinupristin/dalfopristin，QU I/DAL），甲氧芐啶（trimethoprim，TRI），利奈唑胺（linezolid，LINE），慶大霉素（gentamicin，GEN），氯霉素（chloramphenicol，CHL），萬古霉素（vancomycin，VAN）。

試劑：生理鹽水，TE緩沖液，5×TBE電泳緩沖液貯液，0.5mol/L EDTA，10%SDS，3m ol/L NaAc，5 m ol/L N aC l，1%的瓊脂糖凝膠，酚-氯仿-異戊醇（25∶24∶1，體積比），氯仿-異戊醇（24∶1，體積比），異丙醇，蛋白酶 K，dN TPs，10×PCR Buffer，Taq Polymerase，RNaseA，核酸染料等試劑，引物由上海桑尼生物科技有限公司合成。

1.1.3 儀器

式中：Qk為單獨(dú)空氣源熱泵機(jī)組的額定制熱量，kW；K為富裕系數(shù)，取1.05；Ks為根據(jù)空氣源熱泵性能曲線在冬季空氣調(diào)節(jié)室外計(jì)算溫度(青島市為-7.2 ℃[14])，熱泵機(jī)組出水溫度45 ℃下的制熱量修正值，取0.79；Qg為單獨(dú)燃?xì)忮仩t的額定制熱量，kW.

冷凍離心機(jī)（5810R型），臺式高速離心機(jī)（TGL-16B型），微量紫外分光光度計(jì)（ND-1000型），全自動(dòng)高壓蒸汽滅菌器（HA-300M），恒溫水浴鍋（HW S28型），電熱恒溫培養(yǎng)箱（DHP-9272型），UPV凝膠成像儀（GDS-8000型），電泳儀（DYY-12）。

1.2 方法

1.2.1 菌株的制備及質(zhì)控菌株的選取

取凍存管中的保加利亞乳桿菌，按1%接菌量活化于MRS液體培養(yǎng)基中,37℃恒溫，培養(yǎng)24 h。之后將其劃線培養(yǎng)至M RS固體培養(yǎng)基上，37℃恒溫，培養(yǎng)48 h。挑取劃線培養(yǎng)后的單菌落于5 mL生理鹽水中，混勻，制成種子液，測定625 nm處菌株的OD值，直至OD值在0.16～0.2之間[19]（活菌數(shù)約為3×108mL-1）。

參照ISO 10932/IDF223，試驗(yàn)選取Lactobacillus paracaseiATCC 334做質(zhì)控菌，質(zhì)控菌株可用于檢測試驗(yàn)的精確度及準(zhǔn)確度[20]。在試驗(yàn)中，質(zhì)控菌株的培養(yǎng)條件需嚴(yán)格控制。

1.2.2 抗生素溶液的制備

因?yàn)榭股氐娜芙庑圆煌士股厝芤旱闹苽浞譃樗苄院退蝗苄詢煞N?？股氐呐渲迫軇┘皾舛确秶鷧⒄瘴墨I(xiàn)[20-21]。根據(jù)不同抗生素的濃度測定范圍，水溶性抗生素（LSM為溶劑）高濃度貯藏液需稀釋為2倍于對應(yīng)濃度梯度的抗生素溶液。，而水不溶性抗生素根據(jù)對應(yīng)溶劑溶解后，抗生素高濃度貯藏液需稀釋為10倍于對應(yīng)濃度梯度的抗生素溶液,這與其溶劑的選擇有關(guān)。稀釋好的抗生素溶液置于-20℃保藏備用。

1.2.3 菌株耐藥性的表型分析

本試驗(yàn)采用肉湯稀釋法測定保加利亞乳桿菌的M IC值，具體方法參考文獻(xiàn)[20]。

1.2.4 菌株全基因組DNA的提取DNA采[23]。用液氮凍融-CTAB法提取乳酸菌基因組

1.2.5 菌株耐藥基因的檢測

將上述制備的基因組DNA作為PCR擴(kuò)增的模板，根據(jù)已報(bào)道的抗生素耐藥基因設(shè)計(jì)引物，采用50μL反應(yīng)體系進(jìn)行擴(kuò)增。組成為：10×easytaq Buffer 5μL、dN TPs 4μL、基因組DNA模板1.5μL、上下游引物各1.5μL，Taq Polymerase 0.5μL、滅菌去離子水加至50μL。PCR擴(kuò)增循環(huán)參數(shù)如下：94℃預(yù)變性5 min；接著進(jìn)行30個(gè)循環(huán)：94℃變性1 min，退火1 min，72℃延伸2 min；最終72℃末端延伸10 min。所擴(kuò)增耐藥基因的特異性引物序列及PCR退火溫度見表1。PCR擴(kuò)增結(jié)束后通過1%的瓊脂糖凝膠對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測，并用凝膠成像儀分析結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株耐藥性的表型分析

本研究采用歐洲食品安全局[24]、歐盟委員會[25]共同制定的保加利亞乳桿菌臨界點(diǎn)的判定標(biāo)準(zhǔn)，分別將受試菌株的M IC值與臨界點(diǎn)進(jìn)行比較，MIC值高于臨界點(diǎn)為耐藥（R），低于或等于臨界點(diǎn)則為敏感（S）。

試驗(yàn)結(jié)果如表2所示，5株受試菌對慶大霉素、四環(huán)素、新霉素、紅霉素、卡那霉素、鏈霉素、利福平、克林霉素、氨芐西林、奎奴普汀/達(dá)福普汀、甲氧芐啶、利奈唑胺、氯霉素、萬古霉素敏感，其MIC值表現(xiàn)為一定的差異，而且范圍較廣，從小于0.032～16μg/mL不等。5株受試菌對氨基糖苷類抗生素（慶大霉素、卡那霉素、鏈霉素、新霉素）的M IC值范圍為小于0.5μg/mL～16μg/mL；對萬古霉素的MIC值為小于其測定的最低濃度，即小于0.25μg/mL，表現(xiàn)出極強(qiáng)的敏感性；對紅霉素和利福平的MIC值分別為小于0.016μg/mL和小于0.125μg/mL。氯霉素對5株受試菌的抑制作用較低，MIC值為2μg/mL和1μg/mL，這一數(shù)據(jù)與KLARE[18]報(bào)道的結(jié)果相近。5株受試菌對氨芐西林的M IC值最高僅為0.064μg/mL，對甲氧芐啶的M IC值最高可達(dá)16μg/mL，這可能與氨芐西林和甲氧芐啶的結(jié)構(gòu)不同有關(guān)。奎奴普汀/達(dá)福普汀和利奈唑胺對5株受試菌株的抑制程度接近，均在0.125～0.5μg/mL之間。對于四環(huán)素，除IMAU 32330的M IC值為小于0.125μg/mL外，其他菌株的M IC值均為0.5μg/mL。5株受試菌對環(huán)丙沙星的耐藥性存在明顯不同，IMAU 32071和IMAU 32276對環(huán)丙沙星敏感，而IMAU 32330、IMAU 32265和IMAU 32166對環(huán)丙沙星耐藥，且M IC值范圍較小，在2～16μg/mL之間。

2.2 菌株耐藥性的基因型分析

通過特異性引物PCR擴(kuò)增技術(shù)對受試菌株的常見抗生素耐藥基因進(jìn)行分析，統(tǒng)計(jì)結(jié)果如表3所示。5株受試菌均檢出了紅霉素耐藥基因erm（B），IMAU 32265還檢出了紅霉素耐藥基因erm（C），但表現(xiàn)為紅霉素敏感性。IMAU 32265、IMAU 32166、

IMAU 32276和IMAU 32071檢出了萬古霉素耐藥基因vanX，對萬古霉素表現(xiàn)為敏感；IMAU 32166、IMAU 32276和IMAU 32071檢出了利福平耐藥基因rpoB，卻表現(xiàn)為利福平敏感性；IMAU 32276還檢出了氯霉素耐藥基因cat，表現(xiàn)為氯霉素敏感性。受試菌株中，IMAU 32330、IMAU 32265和IMAU 32166雖表現(xiàn)為環(huán)丙沙星耐藥性，但并未檢出環(huán)丙沙星耐藥基因gyrA、parC。其它耐藥基因，如氯霉素耐藥基因catA、紅霉素耐藥基因erm(B)-1、萬古霉素耐藥基因vanE在菌株中均未檢出。除表4中所列基因在對應(yīng)菌株中檢出外，與四環(huán)素、慶大霉素、卡那霉素等抗生素相關(guān)的耐藥基因均未檢出。

表1 特異性引物序列及PCR退火溫度[21]

表2 5株保加利亞乳桿菌對15種抗生素的M IC分布結(jié)果

表3 保加利亞乳桿菌及耐藥性基因

3 討論

我國新疆地區(qū)地域遼闊，環(huán)境獨(dú)特，這里的少數(shù)民族牧民生產(chǎn)的發(fā)酵乳制品大多以牛乳、羊乳、馬乳和駱駝乳為原料，富含大量的有益乳酸菌[7]，保加利亞乳桿菌就是其中的代表。

本文研究的5株保加利亞乳桿菌均分離于新疆的酸牛乳，實(shí)驗(yàn)測定受試菌株的M IC時(shí)采用了肉湯稀釋法，該方法是體外定量測定抗生素對細(xì)菌抑制活力的方法。測定過程中，不同濃度抗生素的液體培養(yǎng)基中加入定量的細(xì)菌，培養(yǎng)一定時(shí)間后，通過肉眼觀察判定MIC值。與濃度梯度法[26]（Etest）、紙片擴(kuò)散稀釋法[27]（disk diffusion）、藥物敏感實(shí)驗(yàn)[28]（Kirby-Bauer method）、微稀釋法[29]（microdilution）等相比，肉湯稀釋法操作方便，價(jià)格低廉，是實(shí)驗(yàn)室普遍使用的判斷M IC的方法。之前的研究中，測定M IC所用的培養(yǎng)基為M RS培養(yǎng)基，但其結(jié)果的準(zhǔn)確性備受質(zhì)疑。HUYS[30]在用MRS與ISA（Iso-sensitest agar）培養(yǎng)基測定菌株的抗生素耐藥性時(shí)發(fā)現(xiàn)，兩種培養(yǎng)基條件下，同一菌株對慶大霉素的耐藥性有顯著差別，可能與M RS培養(yǎng)基中某些成分易與抗生素發(fā)生拮抗作用相關(guān)。隨著研究的深入，KLARE[18]發(fā)現(xiàn)LSM培養(yǎng)基能結(jié)合MRS和ISA兩種培養(yǎng)基的優(yōu)勢，并且能夠降低拮抗作用的發(fā)生概率，對于抗生素耐藥性檢測較準(zhǔn)確，故一直應(yīng)用于乳酸菌抗生素耐藥性研究中。

由于抗生素對細(xì)菌細(xì)胞的功能不同，目前已發(fā)現(xiàn)的抗生素可分為15類[11]。5株受試菌株對不同類的抗生素表現(xiàn)出不同的敏感性。對于能抑制核酸合成的利福平及環(huán)丙沙星，5株受試菌株的M IC值具有極大的差異。利福平對5株受試菌株具有敏感性，且抑制程度均相同，為小于0.125μg/mL。而5株受試菌株中，3株對環(huán)丙沙星耐藥，M IC值范圍在2～16μg/mL之間。Li等[31]所報(bào)道的環(huán)丙沙星耐藥率（68.3%）與本試驗(yàn)結(jié)果接近。氯霉素、克林霉素、氨基糖苷類及四環(huán)素類抗生素雖均可抑制蛋白質(zhì)的合成，但其敏感性存在區(qū)別。氯霉素與克林霉素相比，氯霉素對受試菌株的的耐藥性較高；氨基糖苷類抗生素對受試菌株的抑制作用相對較低，卡那霉素、鏈霉素及新霉素的耐藥性明顯高于慶大霉素，這可能與慶大霉素的結(jié)構(gòu)有關(guān)，進(jìn)而能較好的通過細(xì)菌細(xì)胞膜。對于抑制細(xì)菌細(xì)胞壁合成的抗生素，如氨芐西林和萬古霉素，5株受試菌株均表現(xiàn)出較強(qiáng)的敏感性。其中，氨芐西林的M IC值最高僅為0.064μg/mL，與周寧[32]得出的結(jié)果相似。NAW A[33]和郭慧玲[34]的報(bào)道中，保加利亞乳桿菌對萬古霉素100.0%耐藥，而試驗(yàn)中5株受試菌株對萬古霉素均表現(xiàn)為敏感。顯然，這與之前報(bào)道的有關(guān)萬古霉素對乳酸菌作用機(jī)制的推斷[35]是不吻合的。

在耐藥基因檢測方面，通過比對耐藥基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，發(fā)現(xiàn)5株受試菌株檢出了耐藥基因erm(B)，IMAU 32265還檢出了紅霉素耐藥基因erm(C)，卻不具有紅霉素耐藥性。IMAU 32330、IMAU 32265和IMAU 32166具有環(huán)丙沙星耐藥性，卻未檢出耐藥基因gyrA等。在部分受試菌中也檢出了基因erm(C)、vanX等，但均無相關(guān)耐藥性。有文獻(xiàn)報(bào)道，分離自酸奶的乳酸桿菌表現(xiàn)為鏈霉素耐藥性，卻未檢出與鏈霉素相關(guān)的耐藥基因strA、strB、aadA等[1]；L.delbrueckii subsp.bulgaricus BFE 7430對氯霉素敏感，卻成功檢出了耐藥基因cat[36]。這均與本試驗(yàn)結(jié)果較為相似。因此，菌株具有抗生素耐藥性，不一定能檢出與其耐藥性相關(guān)的耐藥基因；同樣的，菌株攜帶抗生素耐藥基因，不一定對該抗生素表現(xiàn)為耐藥。影響菌株耐藥性及耐藥基因檢出的因素有很多，歸納如下，（1）存在其他機(jī)制決定抗生素的耐藥性，例如編碼核糖體蛋白質(zhì)或rRNA的基因發(fā)生突變[18]；（2）耐藥基因在RNA水平未發(fā)生表達(dá)[36]；（3）調(diào)節(jié)基因表達(dá)的核苷酸序列發(fā)生了基因突變[37]；（4）菌株對抗生素的耐藥性為固有耐藥性，其耐藥性由其它耐藥基因引起；（5）菌株的耐藥性來自于其它基因的水平轉(zhuǎn)移。到底是何種原因?qū)е卤驹囼?yàn)菌株出現(xiàn)以上情況，還需要我們進(jìn)一步探究。

耐藥基因的水平轉(zhuǎn)移是影響食品安全的一大問題，致病菌和乳酸菌可通過基因的水平轉(zhuǎn)移獲得耐藥性[38-39]，任何攜帶耐藥基因的菌株都具有潛在的危害。因此，在對乳酸菌進(jìn)行安全性評價(jià)時(shí)，除需檢測菌株在抗生素條件下的M IC值及耐藥基因外，還需進(jìn)行耐藥基因轉(zhuǎn)移的判斷，確保其安全后方應(yīng)用于發(fā)酵生產(chǎn)中。

4 結(jié)論

分離自新疆的5株保加利亞乳桿菌對15種常見不同抗生素的耐藥表型及基因型存在很大差異，且試驗(yàn)菌株的耐藥表型與基因型間并非一一對應(yīng)。IMAU 32330、IMAU 32265和IMAU 32166對環(huán)丙沙星耐藥，對其他抗生素敏感；IMAU 32071、IMAU 32276對所有抗生素均敏感。5株受試菌株都檢出了耐藥基因erm(B)，部分菌株還檢測到了vanX等，但5株菌均未檢出環(huán)丙沙星相關(guān)耐藥基因。因此，未來的研究中，菌株耐藥表型與基因型不匹配的作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

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