王曉楠,程民,胡世蓮

(安徽醫(yī)科大學(xué)附屬省立醫(yī)院、安徽省立醫(yī)院老年醫(yī)學(xué)科，安徽省老年醫(yī)學(xué)研究所，腫瘤免疫與營養(yǎng)治療安徽省重點實驗室，安徽省循證醫(yī)學(xué)中心,合肥 230001)

在惡性腫瘤中，肺癌的發(fā)病率和病死率居于首位[1]。據(jù)統(tǒng)計，肺癌初診患者中約40%存在遠處轉(zhuǎn)移，根治性手術(shù)治療后亦有30%～60%的患者發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移[2]。目前肺癌的臨床診斷與治療技術(shù)已經(jīng)達到了相當完備的水平，但肺癌的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移仍是阻礙患者生存期提高的主要原因。近些年，新的檢測手段和治療方法使肺癌患者的預(yù)后得到改善，但仍難以達到早期確診，早期治療。腫瘤的轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)是一個多階段、多步驟的復(fù)雜過程，其中腫瘤細胞進入外周血是腫瘤發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的重要一步。循環(huán)腫瘤細胞(CTCs)來自原發(fā)灶或轉(zhuǎn)移灶腫瘤脫落進入外周血液循環(huán)的腫瘤細胞[3]。臨床研究表明，CTCs參與腫瘤血行轉(zhuǎn)移過程，進入外周血后絕大部分CTCs在短期內(nèi)死亡，只有極少部分CTCs可以在血液中存活，它們具有高度活性、高度轉(zhuǎn)移潛能、自我增殖能力，并且可以通過聚集形成微小癌栓，在適宜的條件下發(fā)展成微小轉(zhuǎn)移灶。因此，在血液中檢測到CTCs提示腫瘤形成或已經(jīng)發(fā)生了擴散或遠處轉(zhuǎn)移[4]。

早在1896年，澳大利亞學(xué)者Ashworth在一個轉(zhuǎn)移性腫瘤患者的尸檢報告中首次提出了循環(huán)腫瘤細胞的概念，他發(fā)現(xiàn)腫瘤患者的血液中存在腫瘤細胞，并定義為循環(huán)腫瘤細胞。這些細胞存在于外周血、淋巴、骨髓中，在一定的條件下增殖、浸潤、轉(zhuǎn)移[5]。許多患者在術(shù)中并未發(fā)現(xiàn)淋巴結(jié)和遠處轉(zhuǎn)移，但不久之后腫瘤復(fù)發(fā)，可能與血液中或淋巴組織中的微小轉(zhuǎn)移灶有關(guān)。有研究表明CTCs可作為腫瘤標志物應(yīng)用于臨床診斷[6]。通過檢測外周血中CTCs，可以對腫瘤轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)進行早期診斷，并采取積極的治療措施，有助于延長患者生存期、提高患者生存質(zhì)量。

1 循環(huán)腫瘤細胞的生物學(xué)特性

1.1 CTCs具有上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)與間質(zhì)上皮轉(zhuǎn)換(MET)能力 EMT是指上皮細胞轉(zhuǎn)化具有間質(zhì)細胞特性的過程，而間質(zhì)細胞具有如運動能力強、侵襲性高、抗凋亡能力等特性。當腫瘤細胞由原發(fā)灶轉(zhuǎn)移至繼發(fā)灶時，CTCs經(jīng)歷了EMT轉(zhuǎn)變，導(dǎo)致細胞的侵襲性增強，血管增多以及細胞存活能力增強[7]。

EMT參與腫瘤細胞浸潤和轉(zhuǎn)移可通過以下三種方式：減弱細胞間的聯(lián)系，降解細胞基質(zhì)以及修飾細胞骨架。上皮細胞之間及上皮細胞與細胞外基質(zhì)之間分別通過整合蛋白和鈣連接蛋白緊密相連，然后再通過細胞角蛋白和膠原蛋白加強這種聯(lián)系。當腫瘤發(fā)生浸潤或轉(zhuǎn)移時，腫瘤細胞失去了正常上皮細胞間的相互作用，表現(xiàn)出間質(zhì)細胞的特征，即EMT，腫瘤細胞更容易侵入血管內(nèi)皮進入循環(huán)系統(tǒng)，發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移[8]。在EMT過程中，上皮細胞表達的上皮細胞粘附分子(EpCAM)、E-cadherin和細胞角蛋白(CK)下調(diào)，而表達間質(zhì)細胞的標志物如波形蛋白和N-神經(jīng)鈣黏素上調(diào)[9]。通過EMT，參與細胞間的緊密連接和黏附的分子表達降低，同時以波形蛋白為主的細胞骨架發(fā)生轉(zhuǎn)化，使細胞間黏附作用下降，運動能力增加，從而促使單個腫瘤細胞從腫瘤組織中脫落游走遷移至血管。此外，EMT還可產(chǎn)生促進基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)[10]，通過MMP的作用對細胞基質(zhì)進行降解，促進CTCs從腫瘤組織上皮表面釋放，便于CTCs滲透入血管[11]。

CTCs也可出現(xiàn)上皮細胞標志物和間質(zhì)細胞標志物共表達，提示EMT和MET間可以發(fā)生相互轉(zhuǎn)化[12]，作為與EMT相反的生理過程，MET可增強細胞間的黏附性，減弱細胞的運動能力從而增強細胞的定植能力，還能促進細胞向上皮細胞轉(zhuǎn)變，因此CTCs在進行EMT的同時還可能發(fā)生MET，MET為CTCs的遠處定植及建立轉(zhuǎn)移提供便利條件。

1.2 CTCs聚集形成循環(huán)腫瘤微栓 進入到外周血液中的CTCs具有不同細胞類型，有上皮細胞表型、上皮細胞與間質(zhì)細胞混合表型、間質(zhì)細胞表型等[13]，其中以間質(zhì)細胞表型CTCs轉(zhuǎn)移潛能最高。也可根據(jù)存在形式分為單個細胞(CTC)及聚集成團的循環(huán)腫瘤微栓(CTM)，其中以CTM的轉(zhuǎn)移潛能最強。

CTM又稱為循環(huán)腫瘤細胞集群(CTC clusters)。CTCs通常以單個細胞游走于血液循環(huán)中，侵入循環(huán)系統(tǒng)的CTCs受到血液物理作用的破壞以及機體自身免疫系統(tǒng)的吞噬殺傷作用，極少數(shù)可以在血液中存活，通過相互聚集成CTM發(fā)揮抗吞噬作用，從而提高存活能力[14]。研究表明，CTM腫瘤播散能力是CTCs的50倍以上，這可能與CTM具有抗凋亡能力，CTM中異質(zhì)性細胞的相互作用，以及免疫耐受等作用有關(guān)[15]。

CTM是由一些CTC和非腫瘤細胞(輔助細胞)構(gòu)成，其中輔助細胞包括上皮細胞，間質(zhì)細胞，免疫細胞，血小板和一些纖維母細胞等。輔助細胞可以為腫瘤細胞生存提供支持，如纖維母細胞等，可以增加CTCs集群的穩(wěn)定性，便于形成轉(zhuǎn)移灶，當去除CTM中部分纖維母細胞后，CTCs轉(zhuǎn)移播散能力明顯下降[16]。與單個CTCs相比，盡管CTM含量更少，但是CTM是腫瘤細胞的“集體遷移”結(jié)果，其抗凋亡能力更高、增殖能力更強以及具有逃避免疫殺傷能力從而具備更高的轉(zhuǎn)移潛能[17]。有研究顯示：CTM的轉(zhuǎn)移能力和耐藥性遠遠大于單個CTC[18]。

1.3 CTCs具有腫瘤干細胞(CSC)特性 腫瘤干細胞理論是在干細胞理論假說的基礎(chǔ)上提出來的。根據(jù)腫瘤干細胞理論：腫瘤細胞來源于基因突變的干細胞，具有無限分化增殖能力，并且能侵入到其他組織并擴散到全身各處[19-21]。

CSC是一類具干細胞特性的腫瘤細胞，可以長期存活，同時具有很強的運動和遷移能力。CTCs存在于腫瘤患者血液循環(huán)中，可能是作為CSC的一種特殊類型，具有一定的干細胞特性，在腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移過程中起重要作用[22]。但并不是所有的CTCs都能發(fā)生轉(zhuǎn)移，只有極少部分類似于干細胞特性的CTCs才能存活并轉(zhuǎn)移到遠處形成繼發(fā)病灶，這些細胞稱為循環(huán)腫瘤干細胞，具有自我更新、增殖的潛能，導(dǎo)致腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移。

2 CTCs的檢測技術(shù)

Steinert等[23]研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤病人每天每克原發(fā)灶或轉(zhuǎn)移灶約有106個CTCs脫落進入外周血液中，而90%的CTCs通過血液物理作用、免疫損傷和凋亡而失去活力。CTCs在血液中含量極少，CTCs與正常血細胞的比值為(1/107)～(1/108)[24]，因此難以用常規(guī)的方法提取足夠量的CTCs，這限制了CTCs在臨床中的應(yīng)用。

CTCs檢測分為富集及鑒定兩個步驟。富集是指利用細胞形態(tài)學(xué)或免疫學(xué)方法分選出腫瘤細胞。一種方法是利用血細胞與腫瘤細胞之間的形態(tài)學(xué)差異來分離CTCs，優(yōu)點是細胞結(jié)構(gòu)不被破壞，分離后的腫瘤細胞可接著進行免疫組織化學(xué)等方面的研究，此方法缺點是特異性較差，易出現(xiàn)假陽性，較少用；還有一種方法是采用免疫學(xué)方法進行分離：大部分來源于上皮的腫瘤細胞都表達上皮細胞黏附分子(EpCAM)以及細胞角蛋白(CK)等抗原，而血液中來源于骨髓的細胞則表達CD45等分子[25]。利用磁珠特異性結(jié)合抗原分選的方法，可從外周血中將CTCs分離富集出來。鑒定是指利用腫瘤表面或細胞核內(nèi)特異性標志物對腫瘤細胞進行計數(shù)和特征分析。目前CTCs的鑒定有三種方法：一是于核酸檢測技術(shù)，即反轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)；二是熒光顯微技術(shù)；三是細胞免疫標記技術(shù)。核酸檢測技術(shù)是通過聚合酶鏈式反應(yīng)擴增出腫瘤細胞相關(guān)的特異性標志物來證實腫瘤細胞的存在，該方法敏感度及特異度均較高，但是不足之處是假陽性率高，取血時容易受到上皮細胞的污染[26]。熒光顯微技術(shù)是指抗體經(jīng)過熒光標記處理與特異性抗原結(jié)合，在顯微熒光鏡下可以直接觀察細胞形態(tài)。細胞免疫標記采用抗原抗體結(jié)合的方法鑒定CTCs，利用腫瘤細胞表達的一些特異性分子抗原，相比核酸檢測技術(shù)，細胞免疫標記是基于細胞內(nèi)部特異性抗原的表達，敏感性低于RT-PCR。

因此為了提高敏感度和特異性，更加準確地分離并檢測分析CTCs，集富集、檢測和分析與一體的綜合系統(tǒng)逐漸應(yīng)用于臨床，如CellSearch系統(tǒng)、CTCs芯片(CTCs-chip)。CellsearchTM系統(tǒng)已通過美國食品和藥物監(jiān)督管理局(FDA)認證，可從7.5 mL的外周血中檢測到單一的腫瘤細胞[27]。此系統(tǒng)采用EpCAM抗體磁珠進行富集后，在外加強力磁場的作用下從血液中提取CTCs，并對分離出來的CTCs進行通透、固定，然后用DAPI熒光核染料、CD45熒光抗體和CK8/CK18/CK19熒光抗體標記細胞，最后采用半自動四色熒光顯微鏡Cell-Spotter Analyzer檢測分析篩選出CK8+/18+/19+、DAP1+、CD45-的細胞為CTCs。該方法可從400多億個血細胞中檢測到稀少的CTCs，目前已應(yīng)用于肺癌、乳腺癌、前列腺癌等外周血的CTCs檢測，敏感性和特異性較高，但是檢測費昂貴，尚不能大規(guī)模推廣。

3 CTCs在肺癌診療中的研究進展

3.1 肺癌的早期診斷 近些年，在影像學(xué)檢查不能明確的情況下，腫瘤標志物對疾病嚴重程度的診斷評估起到重要作用，如PSA、AFP和CEA。然而仍有許多惡性腫瘤不具有可靠的蛋白質(zhì)生物標志物，缺乏腫瘤診斷特異性標志物，加上目前技術(shù)的限制，導(dǎo)致其敏感性和特異性不高。此外，許多蛋白質(zhì)生物標志物在血液循環(huán)中持續(xù)存在數(shù)周，因此需數(shù)周或數(shù)月后才能得到準確評估[28]。外周血中CTCs的含量水平與腫瘤分化程度和腫瘤大小密切相關(guān)，水平越高，患者預(yù)后相對越差。在肺癌形成和轉(zhuǎn)移的早期，如果在外周循環(huán)中檢測到脫落的CTCs，可以達到早發(fā)現(xiàn)，早診斷，并針對性治療。CTCs檢測相對于病理活檢達到了相對無創(chuàng)，被稱為“液態(tài)活檢”。Tanaka等[29]利用CellSearch系統(tǒng)比較125例肺癌和25例良性腫瘤的CTCs陽性率，發(fā)現(xiàn)肺癌(30.6%)的陽性率明顯高于良性腫瘤的陽性率(12%)，同時發(fā)現(xiàn)晚期以及發(fā)生肺癌轉(zhuǎn)移患者的CTCs含量明顯增高。接著研究人員通過檢測患者外周血CTCs的數(shù)量來鑒別原發(fā)肺腫瘤和肺部良性疾病，采用受試者工作特征(ROC)曲線將癌胚抗原(CEA)和CTCs的診斷價值進行比較，研究結(jié)果顯示：在鑒別肺癌和肺良性疾病方面，CTCs的診斷價值尚不如CEA(CTCs檢測ROC曲線下面積為0.598、CEA檢測ROC曲線下面積為0.747)，但是CTCs在預(yù)測遠處轉(zhuǎn)移方面有一定優(yōu)勢，其特異度和陽性預(yù)測值分別為83.0%、89.7%，可見CTCs預(yù)測價值高于CEA。因此，監(jiān)測CTCs特異性的改變可作為檢測早期肺癌和有效治療后殘留灶復(fù)發(fā)的指標，有利于治療決策[30]。

3.2 病情監(jiān)測指導(dǎo)個體化治療 目前對肺癌患者病情監(jiān)測的主要手段有影像學(xué)檢查，腫瘤標志物等血清學(xué)檢查以及臨床表現(xiàn)，然而目前的手段難以實時監(jiān)測腫瘤的變化。相比穿刺或者手術(shù)獲取肺癌標本，CTCs的檢測具有實時性、相對無創(chuàng)性。可通過CTCs對肺癌患者病情進行監(jiān)測并且指導(dǎo)治療方案的制定及更換，甚至對手術(shù)效果以及化療進行評價。在NSCLC(非小細胞肺癌)中，原發(fā)灶標本檢測EGFR呈陰性，在病情惡化后，有些患者外周血CTCs可以檢測到EGFR發(fā)生突變，而使用靶向藥物吉非替尼治療后，可以有效延長患者生存期，提高生活質(zhì)量[31]。Carter等[32]研究顯示，外周血CTCs的檢測可以預(yù)測小細胞肺癌(SCLC)患者對治療的應(yīng)答情況。研究人員在對31名小細胞肺癌患者的血液中分離CTCs進行研究發(fā)現(xiàn)，在外周血檢測到CTCs的基因改變與患者的化療耐藥有關(guān)，對外周血CTCs的檢測可以作為化療前預(yù)測小細胞肺癌患者對化療藥物是否敏感的生物學(xué)標志物。因此，實時監(jiān)測CTCs的數(shù)目和分子特性可以有效反映患者病情變化，及時調(diào)整治療方案，達到個體化治療。

3.3 療效評估和預(yù)后判斷 腫瘤的組織學(xué)類型、TNM分期、以及臨床特征目前是對腫瘤患者進行預(yù)后判斷的主要依據(jù)，然而CTCs的含量水平與腫瘤生存期具有明顯相關(guān)性，可以利用CTCs這一優(yōu)勢對肺癌等腫瘤患者進行預(yù)后評估。Hofman等[33]進行的一項大樣本前瞻性研究顯示，術(shù)前檢測CTCs數(shù)目可用來預(yù)測行根治性肺癌手術(shù)切除的Ⅰ～Ⅱ期NSCLC患者的無疾病進展期(DFS)與總體生存時間(OS)，對于術(shù)前CTCs>50個的患者其無疾病進展期(DFS)要更短一些，具有更高的復(fù)發(fā)風(fēng)險。Muinelo-Romay等[34]納入43例NSCLC患者研究發(fā)現(xiàn)治療前、化療2周后、化療5周后的CTCs水平進行檢測，發(fā)現(xiàn)治療前CTCs計數(shù)為(18.9±14.8)/7.5 mL，化療后明顯降低，分別為(0.87±0.22)/7.5 mL、(0.77±0.42)/7.5 mL。此外，治療前CTCs≥5/7.5 mL的患者較CTCs<5/7.5 mL患者無進展生存期(PFS) (4.1個月，95%CI2.2～6；7.6個月，95%CI5.7～9.5) 及總生存率(OS)更短(4.6個月,95%CI2.5～6.8 ；10.7個月,95%CI8.6～12.8)。因此，通過監(jiān)測肺癌患者外周血CTCs含量水平變化對病情療效判斷以及預(yù)后評估。

4 總結(jié)

CTCs通過腫瘤原發(fā)灶中脫落經(jīng)歷EMT過程進入脈管系統(tǒng)，通過血管進入循環(huán)系統(tǒng)，克服循環(huán)系統(tǒng)中物理作用和各種免疫殺傷作用形成新的微小轉(zhuǎn)移灶并轉(zhuǎn)移到遠處器官的微血管，再從血液中滲出，經(jīng)過MET轉(zhuǎn)變，在新的組織環(huán)境中存活，擴散最終形成遠處轉(zhuǎn)移灶。EMT-MET理論解釋腫瘤轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的過程，EMT及其相關(guān)分子參與到CTCs的許多生理步驟，深入研究CTCs以及CTM生理過程及其機制對于尋找新治療靶點，優(yōu)化臨床治療方案，預(yù)后評估等方面均有重要意義。

腫瘤防治的關(guān)鍵是“三早”，即早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療。早期治療不僅可以節(jié)約醫(yī)療費用，減少病人創(chuàng)傷，延長病人壽命，提高生活質(zhì)量。因此，探尋可以早期診斷并能預(yù)測轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)的檢測方法對于提高腫瘤患者生存率、改善預(yù)后至關(guān)重要。CTCs的濃度能實時、動態(tài)反映疾病的進程，可用于肺癌的早期診斷、病情監(jiān)測、評估預(yù)后。CTCs的檢測易獲取、可重復(fù)、相對無創(chuàng)，被稱為“液體活檢”。通過對外周血液中CTCs數(shù)量及類型檢測，監(jiān)測腫瘤動態(tài)進展，進行療效評估，甚至可以對CTCs進行基因檢測，指導(dǎo)肺癌個體化治療。雖然CTCs檢測具有很好的臨床應(yīng)用前景，但目前仍存在問題：雖已證實檢測出CTCs與腫瘤預(yù)后具有一定的相關(guān)性，但是檢測出CTCs并不代表腫瘤一定會復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移，因此需要尋找高轉(zhuǎn)移潛能的CTCs亞群；研發(fā)出更高敏感性和特異性的檢測技術(shù)仍是應(yīng)用于臨床的關(guān)鍵；采用簡便、價格低廉的方法，將有助于CTCs的檢測盡快進入臨床。

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