郝紅英+周芳+王改利+高陽(yáng)逸+丁小娟

摘要：通過(guò)單因素試驗(yàn)優(yōu)化了影響乙醇-硫酸銨雙水相提取魚(yú)腥草（Herba houttuyniae）總黃酮提取率的因素，進(jìn)一步通過(guò)正交試驗(yàn)確定了各因素的影響程度，順序?yàn)橐掖紳舛?提取溫度>提取時(shí)間>料液比。優(yōu)化后的提取條件為脫脂魚(yú)腥草粉末2.0 g，乙醇用量32.50%（w）、硫酸銨16.00%（w）、料液比1∶15、提取溫度60 ℃、提取時(shí)間30 min，在該條件下，魚(yú)腥草總黃酮提取率為3.16%。

關(guān)鍵詞：魚(yú)腥草（Herba houttuyniae）；雙水相；總黃酮；提取工藝

中圖分類號(hào)：R284.2 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2017）24-4844-03

魚(yú)腥草（Herba houttuyniae）為三白草科蕺菜屬多年生草本植物，其具有抗菌、抗病毒、抗炎、抗過(guò)敏、抗腫瘤等多種藥理作用，還可增強(qiáng)機(jī)體免疫功能[1，2]。魚(yú)腥草含有多種活性成分[3，4]，如揮發(fā)油、阿福豆甙、金絲桃甙及蕺菜堿，黃酮類成分有斛皮素、斛皮苷、綠原酸、金絲桃苷等。魚(yú)腥草活性成分的提取，尚無(wú)統(tǒng)一的方法，常見(jiàn)的提取方法[5]有水煎煮法、醇提取法、索式提取法及超聲波提取法等，但鮮見(jiàn)采用雙水相體系提取魚(yú)腥草黃酮的文獻(xiàn)報(bào)道。近年，雙水相萃取（Aqueous two-phase，ATP）技術(shù)因設(shè)備投資少，操作簡(jiǎn)單，引起了人們極大的關(guān)注，并且被廣泛用于生物化學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)和生物化工等領(lǐng)域[6]。基于與水互溶的有機(jī)溶劑和鹽水相的雙水相萃取體系具有價(jià)廉、低毒、較易揮發(fā)等特點(diǎn)。

本試驗(yàn)應(yīng)用乙醇-硫酸銨雙水相體系提取魚(yú)腥草中主要成分總黃酮，以總黃酮提取率為指標(biāo)，采用單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)法，考察提取溶劑濃度、料液比、提取時(shí)間及提取溫度等對(duì)總黃酮提取工藝的影響，確定乙醇-硫酸銨雙水相體系提取魚(yú)腥草總黃酮的較佳工藝條件，旨在為魚(yú)腥草總黃酮提取工藝的產(chǎn)業(yè)化提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)樣品（中國(guó)藥品生物制定檢定所， 生化試劑），其他試劑均為分析純；魚(yú)腥草（藥店所售中草藥）。

電熱恒溫水浴箱（北京市永光明醫(yī)療儀器廠）、SHZ-D（III）型循環(huán)水式真空泵（鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司）、7230G型可見(jiàn)分光光度計(jì)（上海菁華科技儀器有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 提取方法 稱取魚(yú)腥草干細(xì)粉（過(guò)60目篩）于索氏提取器中，經(jīng)石油醚脫脂，并除去部分色素。同時(shí)，稱取2.0 g脫脂后烘干的樣品于250 mL碘量瓶中，按一定的料液比加入乙醇-硫酸銨雙水相溶液，置于恒溫水浴箱中，提取一段時(shí)間后過(guò)濾，靜置分層，將濾液用分液漏斗將兩相分開(kāi)，即得魚(yú)腥草黃酮類化合物提取液，將醇相提取液高速離心25 min后經(jīng)微孔濾膜過(guò)濾，用甲醇定容至250 mL，以供分析測(cè)試用。

1.2.2 分析方法 魚(yú)腥草中黃酮類化合物含量的測(cè)定參照文獻(xiàn)[7，8]的方法，以蘆丁為標(biāo)樣測(cè)定魚(yú)腥草黃酮類化合物的含量，所得標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為Y=0.093 8A+0.000 1，式中，Y為蘆丁質(zhì)量濃度（g/mL），A為吸光度，相關(guān)系數(shù)R?=0.999 7。

取2.5 mL樣品溶液至25 mL容量瓶中，加5%（w）的NaNO2 1 mL，搖勻，放置5 min后加入10%（w）的Al（NO3）3 1 mL，5 min后再加入4%（w）的NaOH 10 mL，搖勻，用去離子水稀釋至刻度，10 min后于7230G型分光光度計(jì)上在510 nm處測(cè)定吸光度A（以試劑為空白參比），根據(jù)蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程，得到提取液濃度，總黃酮提取率按照下式計(jì)算：

Et=（C×V×D）/W×100%

式中，Et為總黃酮提取率，C為測(cè)得的提取液濃度，V為提取液醇相體積，D為稀釋倍數(shù)，W為原料的質(zhì)量。

1.2.3 正交試驗(yàn) 在單因素考察的基礎(chǔ)上，采用L9（34）正交表進(jìn)行了正交試驗(yàn)（表1）。

2 結(jié)果與分析

2.1 乙醇溶液濃度對(duì)魚(yú)腥草總黃酮提取效果的影響

在溫度為40 ℃，固定硫酸銨用量6.4 g（16.00%），脫脂魚(yú)腥草粉末2.0 g，料液比1∶20，提取時(shí)間30 min的條件下，考察了乙醇溶液濃度對(duì)魚(yú)腥草總黃酮提取率的影響，結(jié)果如圖1所示。由圖1可知，在硫酸銨用量一定的情況下，隨著乙醇溶液濃度的增加，總黃酮提取率逐漸增加，當(dāng)乙醇溶液濃度達(dá)到32.50%時(shí)，提取率達(dá)到最大。此后，隨著乙醇溶液濃度的增加，總黃酮提取率顯著下降。其主要原因可能是，乙醇溶液濃度過(guò)低不利于黃酮的浸出，隨著乙醇濃度增加，雙水相體系的分相能力增加，乙醇在上層的體積也逐漸增加，黃酮溶解度增加，一些脂溶性有機(jī)物的溶出量也會(huì)增加，抑制了總黃酮的浸出。因此，確定合適的乙醇溶液濃度為32.50%。

2.2 料液比對(duì)魚(yú)腥草總黃酮提取效果的影響

在溫度為40 ℃，硫酸銨用量16.00%，乙醇溶液濃度為32.50%（r=0.667），提取時(shí)間30 min的條件下，考察了料液比對(duì)魚(yú)腥草總黃酮提取率的影響，結(jié)果如圖2所示。由圖2可知，在硫酸銨和乙醇用量比例一定的情況下，隨著料液比的增加，總黃酮的提取率逐漸增加，當(dāng)料液比為1∶20時(shí)，提取率達(dá)到最大。此后，隨著料液比的增加，總黃酮提取率開(kāi)始降低。原因可能是，料液比較小時(shí)，溶劑滲透并擴(kuò)散到細(xì)胞內(nèi)的速度以及黃酮化合物向溶劑中擴(kuò)散的速度小，如果料液比較大時(shí)，雖然有利于溶劑進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)破壞疏水鍵，利于黃酮化合物向溶劑中擴(kuò)散，但會(huì)耗費(fèi)大量的溶劑和硫酸銨。因此，確定合適的料液比為 1∶20較好。

2.3 提取時(shí)間對(duì)魚(yú)腥草總黃酮提取效果的影響

在溫度為40 ℃，硫酸銨用量16.00%，乙醇溶液濃度為32.50%（r=0.667），料液比1∶20的條件下，考察了提取時(shí)間對(duì)魚(yú)腥草總黃酮提取率的影響，結(jié)果如圖3所示。由圖3可以看出，魚(yú)腥草總黃酮提取率在20～50 min時(shí)隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)而升高，當(dāng)提取時(shí)間為50 min時(shí)，提取率達(dá)到最大，繼續(xù)延長(zhǎng)提取時(shí)間總黃酮提取率反而下降，原因可能是，在提取初期，魚(yú)腥草中的總黃酮不斷浸出，隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，總黃酮的浸出率逐漸達(dá)到最大。如果繼續(xù)延長(zhǎng)，乙醇揮發(fā)量增加，會(huì)引起黃酮提取率降低。因此，確定合適的提取時(shí)間為50 min。endprint