魏曉梅,吳麗芳,柏旭,陶麗麗
(曲靖師范學(xué)院生物資源與食品工程學(xué)院,云南高原生物資源保護(hù)與利用研究中心,云南曲靖655011)
松茸(Tricholoma matsutake)又稱松口蘑、松蕈。屬擔(dān)子菌門(Basidiomycota)擔(dān)子菌綱(Basidiomycetes)傘菌目(Agaricales)口蘑科(Tricholomataceae)口蘑屬(Tricholoma)[1],是較為自然的類群[2],也是我國二級瀕危保護(hù)物種[3]。松茸是樹木菌根菌,子實(shí)體一般單生,少數(shù)2個(gè)~4個(gè)叢生[4],為名貴的野生食用菌之一,其富含粗蛋白、粗脂肪、粗纖維和多種維生素[5-6],味道鮮美,且子實(shí)體提取物(多糖類物質(zhì))可提高身體免疫力[7],具有抗癌抗腫瘤,治療糖尿病、心血管疾病,促進(jìn)腸胃消化保護(hù)肝臟等功效[8]。有研究表明,松茸多糖能夠抑制一些組織的癌細(xì)胞生長,引起S期阻滯,上調(diào)p53 mRNA表達(dá)水平[9]。因此,松茸多糖的提取率對進(jìn)一步研究及開發(fā)松茸相關(guān)產(chǎn)品具有重大意義。長期以來,雖然有許多研究者花費(fèi)大量精力致力于研究松茸人工栽培[10-11],并取得了大量成果[12-13],但由于松茸屬于活體共生菌[3],到目前為止,馴化栽培松茸子實(shí)體主要還是以半人工栽培(仿生態(tài)栽培)為主[14]。在國外一些國家,已有深受歡迎的具有增強(qiáng)免疫功效的常用保健食品松茸多糖膠囊和口服液[15]。
鑒于多糖的利用價(jià)值,有很多研究者采用不同的原理和方法提取不同材料中的多糖,水提醇沉法被廣泛應(yīng)用于食用菌多糖的提取[16]。劉祖同、羅信昌歸納了食用菌子實(shí)體多糖水提醇沉法提取工藝步驟[1 7],但不同的食用菌材料多糖提取的工藝不盡相同,且提取的效率也有很大差別[18-19]。本研究以楚雄州大姚縣和香格里拉云南松和櫟樹共生的山林中采集的松茸為原材料,結(jié)合前人研究的基礎(chǔ)進(jìn)一步利用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)中因素和水平的結(jié)合探索最佳松茸多糖提取方案,并通過同樣的提取方法對比分析不同采集地松茸粗多糖含量的差異,為松茸相關(guān)產(chǎn)品的進(jìn)一步開發(fā)提供參考依據(jù)。
松茸子實(shí)體于2016年分別采自楚雄州大姚縣和香格里拉市云南松與櫟樹共生的山林中。
正丁醇,天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司生產(chǎn),分析純;丙酮,天津市化學(xué)試劑三廠生產(chǎn),分析純;三氯甲烷,南陽市科龍化工試劑廠生產(chǎn),分析純;無水乙醇,天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司生產(chǎn),分析純。
高速組織搗碎機(jī),上海標(biāo)本模型廠制造,DS-1;電子天平CP114,奧豪斯儀器(上海)有限公司制造,精確度等級Ⅰ;離心機(jī),大地自動(dòng)化儀器廠制造,80-1離心機(jī);數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱,上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠制造,GZX-9070 MBE;DKS26電熱恒溫水浴鍋,上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司制造。
根據(jù)前人的研究結(jié)果,選擇對提取結(jié)果可能較大影響的四因素三水平設(shè)計(jì)正交試驗(yàn),見表1。松茸新鮮子實(shí)體切片,烘干搗碎過篩備用。4 000 r min-1離心10 min,重復(fù)并合并上清液,沉淀再次按照正交表分別加入10倍、15倍、20倍蒸餾水,再次重復(fù)2次后合并上清液,Sevag(氯仿∶正丁醇=4∶1)法除蛋白質(zhì)。重復(fù)3次后旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至原體積的1/3,待濃縮液冷卻后往濃縮液中分別加入無水乙醇,使?jié)饪s液中乙醇濃度達(dá)到預(yù)先設(shè)計(jì)的量,4℃低溫靜置24 h醇沉,4 000 r min-1離心10 min,分離乙醇與沉淀;醇沉結(jié)束后往水層中加入乙醇,使乙醇的量達(dá)到75%進(jìn)行沉淀,去除水層并用丙酮進(jìn)行洗滌除水。將用丙酮進(jìn)行除水后的沉淀物放到50℃的鼓風(fēng)干燥箱內(nèi)進(jìn)行干燥(約5 h),待恒重后稱量即為粗多糖提取量。
表1 四因素三水平正交設(shè)計(jì)水平表Tab.1 Orthogonal design in scale with four factors and three levels
楚雄松茸、香格里拉松茸浸提液情況分別見圖1~圖3,浸提液除蛋白過程見圖4。
圖1 楚雄松茸第一次浸提液Fig.1 The first extracts of Tricholoma matsutake from Chuxiong
圖2 香格里拉松茸第一次浸提液Fig.2 The first extracts of Tricholoma matsutake from Xianggelila
圖3 楚雄松茸第二次浸提液Fig.3 The second extracts of Tricholoma matsutake from Chuxiong
圖4 浸提液除蛋白Fig.4 Deproteinization from the leaching liquid
研究過程中發(fā)現(xiàn),不同生境松茸的浸提液顏色有明顯差異(圖1、圖2),說明2種松茸的色素含量不同。不同的浸提次數(shù)所得到的松茸浸提液顏色是不同的(圖1、圖3),浸提次數(shù)越多,浸提液顏色越淡。
Sevag法除蛋白操作時(shí),試管溶液分成3層,其中上層為多糖溶液,下層為有機(jī)溶劑,中間為蛋白質(zhì)(圖4),松茸子實(shí)體中蛋白質(zhì)含量較高,這與前人的研究結(jié)果一致。
2.2.1 楚雄松茸正交試驗(yàn)提取多糖結(jié)果分析
楚雄松茸多糖提取結(jié)果見表2。
表2 楚雄松茸正交試驗(yàn)結(jié)果Tab.2 Orthogonal test results of Tricholoma matsutake from Chuxiong
表2分析發(fā)現(xiàn),不同條件下多糖提取量有明顯的差異,試驗(yàn)組合為A2B1C2D3時(shí),每1克松茸其多糖提取量為0.1676 g;試驗(yàn)組合為A3B2C1D3時(shí),每1克松茸其多糖提取量為0.0732 g。K1、K2和K3為各因素在相同水平下多糖提取量的和;RⅠ為K1、K2和K3值的極差。分析RⅠ發(fā)現(xiàn),在因素C(料液比)條件下RⅠ為0.1689,高于其他因素的RⅠ,說明此因素即料液比對試驗(yàn)的影響最大,且隨著料液比的降低,松茸多糖提取量有較大的升高。因素A(浸提時(shí)間)RⅠ為0.1175,從K值可以看出浸提時(shí)間為3 h時(shí),松茸多糖提取量是最高,因此最佳的浸提時(shí)間為3 h。因素B(浸提溫度)RⅠ為0.0947,對多糖提取量有一定的影響,從K值可以看出浸提溫度為80℃時(shí),松茸多糖提取量最高。雖然因素D(乙醇濃度)RⅠ為0.0730,相對是最小的,但是從K值可以看出乙醇濃度對K值的大小也存在一定的影響。據(jù)此分析各因素對試驗(yàn)結(jié)果的影響程度為C>A>B>D,即料液比>浸提時(shí)間>浸提溫度>乙醇濃度。
2.2.2 香格里拉松茸正交試驗(yàn)提取多糖結(jié)果分析
香格里拉松茸多糖提取結(jié)果見表3。
表3 香格里拉松茸正交試驗(yàn)結(jié)果Tab.3 Orthogonal test results of Tricholoma matsutake from Xianggelila
表3分析發(fā)現(xiàn),不同條件下多糖提取量有著明顯的差異。試驗(yàn)組合為A3B2C1D3時(shí),多糖提取量最少,每1克松茸可得到多糖0.0592 g;試驗(yàn)組合為A2B1C2D3時(shí)多糖提取量最高,每1克松茸可得到多糖0.1197 g。對比RⅡ值發(fā)現(xiàn),各因素對試驗(yàn)結(jié)果的影響程度為B>C>D>A。由表3可知因素B(浸提溫度)RⅡ?yàn)?.0933,對試驗(yàn)結(jié)果的影響最大,其次是因素C(料液比),其RⅡ?yàn)?.0708,從K值可以看出料液比1:20時(shí),松茸多糖提取量最高;因素D(乙醇濃度)RⅡ?yàn)?.0591,從K值可以看出乙醇濃度90%。雖然因素D(浸提時(shí)間)RⅡ?yàn)?.0417,對試驗(yàn)結(jié)果影響最小,但是從K值可以看出,乙醇濃度對K值的大小有一定的影響。
通過同樣的組合提取不同生源地的松茸子實(shí)體多糖,在A2B1C2D3條件下,兩地的野生松茸多糖提取量均最高,但楚雄野生松茸的多糖提取量大于香格里拉野生松茸的多糖提取量;在A3B2C1D3條件下,兩地的野生松茸多糖提取量均最低,但楚雄松茸的多糖提取量仍大于香格里拉松茸,其他組試驗(yàn)也出現(xiàn)同樣的現(xiàn)象,因此,可推斷,不同生境條件下生長的松茸存在差異,在本研究中則表現(xiàn)為子實(shí)體中多糖含量的差異。楚雄松茸的多糖含量高于香格里拉松茸的多糖含量,且A2B1C2D3,即80℃浸提3 h,料液比1:15,95%乙醇沉淀,為最佳的松茸子實(shí)體多糖提取條件。
從浸提時(shí)間來看,楚雄松茸的K2>K1>K3,香格里拉松茸的K12>K11>K13,二者相同,所以對于兩地松茸來說太短或太長的浸提時(shí)間均不利于多糖的提取。
對于浸提溫度,楚雄松茸的K1>K3>K2,香格里拉松茸的K11>K13>K12,二者相同,所以對于兩地松茸來說太高或太低的浸提溫度均不利于多糖的提取。
比較料液比發(fā)現(xiàn),楚雄松茸的K3>K2>K1,香格里拉松茸的K12>K13>K11,所以對于楚雄松茸來說料液比比值越小,多糖提取量越高。但是對于香格里拉松茸來說,太大或者太小的料液比都不利于多糖的提取。
醇沉?xí)r不同的乙醇濃度對結(jié)果也有影響,楚雄松茸的K3>K1>K2,香格里拉松茸的K12>K13>K11,由此看出楚雄松茸醇沉?xí)r對乙醇濃度不敏感。但是對于香格里拉松茸來說,太高或者太低的乙醇濃度均不利于多糖的提取。
在楚雄松茸多糖提取結(jié)果中,各因素對試驗(yàn)結(jié)果的影響程度為C>A>B>D;而在香格里拉松茸多糖提取結(jié)果中,各因素對試驗(yàn)結(jié)果的影響程度為B>C>D>A。料液比這個(gè)因素對于楚雄松茸的多糖提取量影響最大,但影響香格里拉松茸多糖提取量最大的因素是浸提時(shí)間。
綜上所述,楚雄松茸與香格里拉松茸的最佳提取方案可以相同,但提取的多糖量有差異,本研究中選取的4個(gè)因素對兩地的松茸子實(shí)體多糖的提取量的影響基本保持一致。原因可能是松茸的所處生境存在差異。在不同生境條件下,松茸生長過程中代謝產(chǎn)物的量存在差異。雖然兩地“年溫差較小,日溫差較大”,但從日照強(qiáng)度來看,楚雄的日照強(qiáng)度、平均海拔均低于香格里拉;而且楚雄的年平均氣溫高于香格里拉;再者,楚雄受亞熱帶季風(fēng)氣候影響,而香格里拉則屬于山地寒溫帶季風(fēng)氣候,因此楚雄的雨季比香格里拉提前1個(gè)月。由于生理環(huán)境的差異,造成了兩地松茸多糖含量的差異,同時(shí)多糖種類方面也存在差異。
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