李蓉，張金鈺，陳麗，姚庭永，葉長文，吳應(yīng)淼

（1.浙江省慶元縣食用菌科學(xué)技術(shù)研究中心，浙江省麗水食用菌技術(shù)創(chuàng)新服務(wù)平臺，浙江省食用菌工程技術(shù)研究中心，浙江麗水323000；2.慶元縣農(nóng)業(yè)局，浙江慶元323800）

灰樹花，學(xué)名：Grifola frondosa，英文名：Maitake，屬擔(dān)子菌亞門（Basidiomycota）傘菌綱（Agaricomycetes）多孔菌目（Polyporales）亞灰樹花菌科（Meripilaceae）樹花屬（Grifola）[1]。灰樹花是最有價值的食藥兩用菇類，特別是從灰樹花中提取的最有效成分灰樹花D-fraction，具有極強(qiáng)的抗癌功效[2]。有研究表明，從灰樹花深層發(fā)酵液和菌絲體中提取的多糖，與子實(shí)體中提取的多糖具有同樣的抑制腫瘤、提高肌體免疫功能的作用[3]。顧順明等[4]研究表明灰樹花子實(shí)體和菌絲體具有相同種類的氨基酸，且氨基酸含量比較接近。國內(nèi)外對食用菌中活性物質(zhì)的研究多集中于食用菌中蛋白質(zhì)的抗病毒、抗腫瘤和多糖抗腫瘤以及作為癌癥輔助治療藥劑等方面[5]。陳寧等[6]從灰樹花中分離到具有抗TMV活性的蛋白質(zhì)。

液體深層發(fā)酵具有培養(yǎng)周期短，成本低，產(chǎn)量高，易于實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)，能快速增殖菌絲體細(xì)胞，活性物質(zhì)的有效成分易于控制，生產(chǎn)效率高等優(yōu)勢。筆者對13種不同灰樹花菌株進(jìn)行栽培、搖瓶發(fā)酵，通過比較不同菌株子實(shí)體、菌絲體間胞內(nèi)多糖和粗蛋白含量，篩選出胞內(nèi)多糖、粗蛋白含量高，而且分別適宜栽培以及液體發(fā)酵的灰樹花菌株，以期滿足灰樹花栽培與加工的不同需求，提供特定優(yōu)良的菌株。

1 材料與方法

1.1 供試菌株與培養(yǎng)基

試驗(yàn)采用本單位從國內(nèi)外收集的13個灰樹花菌株（Grifola frondosa），編號和來源分別為G1：美國賓夕法尼亞州大學(xué)，G4：福建三明真菌研究所，G5：日本，G6：河北，G7、G8、G9、G10：上海農(nóng)科院食用菌研究所，G13：四川，G20：山東泰安，慶灰151、慶灰152、小黑?。赫憬c元縣食用菌科學(xué)技術(shù)研究中心。

培養(yǎng)基配方：木屑34%、棉籽殼34%、麥麩10%、玉米粉10%、曬干山表土10%、石膏1%、紅糖1%，含水量55%～60%，pH自然。

斜面培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g、葡萄糖2 g、蛋白胨2 g，水1 000 mL。

發(fā)酵培養(yǎng)基：玉米粒浸出物1 000 g、葡萄糖2 g、蛋白胨0.3 g、KH2PO40.3 g、MgSO4·7H2O 0.05 g，水1 000 mL。

1.2 主要試劑與儀器設(shè)備

苯酚：藥檢專用，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；濃硫酸：分析純，浙江中星化工試劑有限公司；加速劑（3.5 gK2SO4和0.4 gCuSO4·5H2O）：福斯分析儀器（蘇州）有限公司；氫氧化鈉：分析純，西隴化工股份有限公司；無水乙醇：分析純，安徽安特食品股份有限公司；硼酸：分析純，太倉美達(dá)試劑有限公司。

MJ33水分快速測定儀，梅特勒托利多；Direct-Q超純水系統(tǒng)，密理博；FW135固體樣品粉碎機(jī)，天津泰斯特儀器有限公司；GZX-9240MBE熱風(fēng)內(nèi)循環(huán)烘箱，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司；PL403電子天平，梅特勒托利多；SKY-211B全溫?fù)u床，上海蘇坤實(shí)業(yè)有限公司；Thermo移液器，美國熱電；MLS-3780高壓滅菌鍋，日本三洋；DKL12消解儀，意大利VELP；UDK139凱氏定氮儀，意大利VELP；Lambda25紫外分光光度計(jì)，鉑金埃爾默。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 不同菌株人工栽培產(chǎn)量的比較

按培養(yǎng)料配方要求稱量后，先將紅糖溶于水，然后用紅糖水拌勻玉米粉、麥麩、山表土、石膏，下一步拌入木屑，最后拌入經(jīng)預(yù)濕的棉籽殼，裝入規(guī)格為15 cm×55 cm×0.04 cm聚乙烯筒袋。將料袋打一直徑1.0 cm～1.5 cm的小孔，料溫達(dá)100℃狀態(tài)下保持16 h滅菌。滅菌徹底后冷卻接種，接種時無菌操作。經(jīng)人工栽培統(tǒng)計(jì)2茬菇（菌棒1茬菇和覆土2茬菇）產(chǎn)量，計(jì)算單產(chǎn)和生物轉(zhuǎn)化率。

1.3.2 不同菌株液體發(fā)酵菌絲生物量的比較

水稻產(chǎn)量形成是一個復(fù)雜的系統(tǒng)過程，影響其產(chǎn)量的各個性狀之間具有復(fù)雜的關(guān)聯(lián)性[5]。因此，無論在育種工作中還是生產(chǎn)實(shí)際中都要綜合考慮各項(xiàng)性狀指標(biāo)[6-7]。通過黔糯優(yōu)11產(chǎn)量及主要性狀的相關(guān)分析與通徑分析，明確了產(chǎn)量構(gòu)成要素之間的關(guān)系，在合理群體有效穗的同時，提高穗粒數(shù)和結(jié)實(shí)率是確保黔糯優(yōu)11增產(chǎn)的關(guān)鍵措施。

發(fā)酵條件：25℃，搖床轉(zhuǎn)速150 r·min-1，種子培養(yǎng)基接種量為直徑6 mm圓餅5個，裝液量為250 mL三角瓶裝100 mL發(fā)酵液，初始pH為6.0，發(fā)酵周期為11 d，液體發(fā)酵培養(yǎng)基接種量為100 ml·L-1，發(fā)酵周期為5 d。

發(fā)酵結(jié)束后，將三角瓶中的菌絲體經(jīng)60目篩過濾后，用蒸餾水沖洗干凈，然后置于35℃烘箱中烘3 h后，調(diào)節(jié)烘箱溫度至50℃烘干，用電子天平稱量菌絲體干重，取5瓶菌絲體干重的平均值，以mg/100mL計(jì)。

1.3.3 不同菌株子實(shí)體、菌絲體胞內(nèi)多糖含量測定

先將烘干的子實(shí)體進(jìn)行粉碎，然后所有待測子實(shí)體在50℃下烘干24 h。將烘干的子實(shí)體、菌絲體置80℃水浴中恒溫浸提2 h，共3次，過濾，棄殘?jiān)?，取濾液，菌絲經(jīng)超聲波破碎30 min，加水煮沸浸提3 h（第1次提取2 h，第2次提取1 h），加水量90 mL（第1次提取60 mL，第2次提取30 mL），過濾，棄殘?jiān)?，取濾液，上清液濃縮至10 mL，將上述濃縮液經(jīng)無水乙醇洗滌后所得溶液為胞內(nèi)多糖測試液。

取1 mL上述多糖溶液，加入苯酚1 mL，然后迅速加入5 mL濃硫酸搖勻，30℃水浴中顯色20 min，反應(yīng)生成橙黃色溶液，反應(yīng)產(chǎn)物在490 nm處比色，采用外標(biāo)法分析胞內(nèi)多糖含量。

標(biāo)準(zhǔn)曲線制作：配制100 ml·L-1的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，吸取0、0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液至10 mL試管中，用蒸餾水補(bǔ)至1.0 mL。向試管中加入1.0 mL5%苯酚溶液，然后迅速加入5.0 mL濃硫酸搖勻，30℃水浴中顯色20 min，另以雙蒸水代替多糖溶液同上操作，為空白對照，在490 nm波長處測定吸光度值。以多糖濃度為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.4 不同菌株子實(shí)體、菌絲體粗蛋白含量的測定

按GB/T15673-2009食用菌中粗蛋白含量測定中的規(guī)定方法，取1 g灰樹花粉放入消煮管，再加入濃硫酸10 mL，加速劑1片，之后進(jìn)行梯度消解，150℃下消解30 min，260℃下消解60 min，420℃下消解120 min。

將帶消化液的消煮管插在蒸餾裝置上，以25 mL硼酸溶液為吸收液，加入2滴甲基紅-溴甲酚綠混合指示劑，蒸餾裝置的冷凝管末端浸入裝有吸收液的250 mL錐形瓶內(nèi)，然后向消煮管中加入40 mL氫氧化鈉溶液進(jìn)行蒸餾。使蒸餾液猛烈沸騰，釋放出的氨被吸收液吸收，待吸收液變綠色之后繼續(xù)蒸餾5 min，吸收液達(dá)100 mL左右時停止蒸餾。取下錐形瓶，使冷凝管末端離開液面，繼續(xù)蒸餾1 min～2 min，并用蒸餾水沖洗冷凝管末端，洗滌液均需流入錐形瓶內(nèi)，然后停止蒸餾。

立即用0.1 mol·L-1鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行滴定，吸收液由藍(lán)綠色滴定至灰紅色。30 s保持不變即為終點(diǎn)。

試樣中粗蛋白含量以質(zhì)量分?jǐn)?shù)計(jì)，數(shù)值以克每百克（%）表示，計(jì)算結(jié)果保留到小數(shù)點(diǎn)后1位。

式中：c表示鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度，單位為mol·L-1；V0表示空白試液滴定消耗的鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液體積，單位為mL；V1表示試料滴定消耗的鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液體積，單位為mL；m表示試料的質(zhì)量，單位為g；0.014表示氮的摩爾質(zhì)量，單位為g·mmoL-1；w表示試料含水率，單位為%；6.25表示氮換算成粗蛋白質(zhì)的系數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同菌株人工栽培產(chǎn)量

13個灰樹花菌株，每個菌株栽培90棒（分3個小區(qū)），觀察子實(shí)體顏色，計(jì)算平均每棒單產(chǎn)和生物轉(zhuǎn)化率，結(jié)果見表1。

由表1結(jié)果可以看出，灰樹花子實(shí)體顏色有白、白灰、灰等顏色。慶灰151、慶灰152、G7菌株平均單產(chǎn)較高，生物轉(zhuǎn)化率較高；G13菌株平均單產(chǎn)最低，其余均相差不大。生物轉(zhuǎn)化率同平均單產(chǎn)成正比。

表1 試驗(yàn)菌株出菇性狀Tab.1 Fruiting characteristics of test strains

2.2 不同菌株液體發(fā)酵菌絲生物量的比較

不同試驗(yàn)灰樹花菌株的菌絲生物量測定情況見表2。

表2結(jié)果表明，G6菌株發(fā)酵培養(yǎng)液中菌絲生物量最大，達(dá)到725.1 mg/100mL，其次為G13、G20、G5、140、慶灰152、G9、G8、慶灰151菌株，菌絲生物量介于352.9 mg/100mL～208.0 mg/100mL，菌株G7、G10、G4、G1、小黑汀菌絲生物量均低于200 mg/100mL。發(fā)酵液顏色呈淡黃或棕黃色，菌絲球呈小米粒狀或較小米粒稍大，發(fā)酵產(chǎn)物pH呈酸性，發(fā)酵液具有灰樹花味。

表2 試驗(yàn)菌株菌絲生物量測定Tab.2 Mycelial biomass of test strains

2.3 不同菌株子實(shí)體、菌絲體胞內(nèi)多糖含量的測定

不同灰樹花菌株子實(shí)體、菌絲體胞內(nèi)多糖含量的測定結(jié)果見圖1。

圖1 不同灰樹花菌株子實(shí)體、菌絲體胞內(nèi)多糖含量Fig.1 Intracellular polysaccharide content from fruiting body and mycelium of different Grifola frondosa strains

子實(shí)體胞內(nèi)多糖含量測定結(jié)果表明，G5、G6、G1、G4、G13菌株子實(shí)體中胞內(nèi)多糖含量較高，其中G5菌株最高達(dá)到17.89%，而慶灰151、慶灰152、小黑汀等栽培應(yīng)用品種中子實(shí)體胞內(nèi)多糖含量偏低。

菌絲體胞內(nèi)多糖含量測定結(jié)果表明，G6菌株胞內(nèi)多糖含量較高達(dá)到11.49%，其次為G1、G20菌株，而慶灰151、慶灰152、小黑汀等栽培應(yīng)用品種中菌絲體胞內(nèi)多糖含量較低。

分析認(rèn)為，生產(chǎn)主栽灰樹花品種經(jīng)過多年栽培應(yīng)用，可能菌株有所退化，導(dǎo)致胞內(nèi)多糖含量有所下降。因此，選育出多糖含量高的灰樹花新菌株，將是灰樹花育種需考慮的目標(biāo)方向之一。

2.4 不同菌株子實(shí)體、菌絲體粗蛋白含量的測定

不同菌株子實(shí)體、菌絲體粗蛋白含量的測定結(jié)果見圖2。

子實(shí)體粗蛋白含量測定結(jié)果表明，除G13、慶灰151菌株子實(shí)體粗蛋白含量低于7.35%外，其余灰樹花菌株子實(shí)體中粗蛋白含量均較高，G7菌株粗蛋白含量最高達(dá)到32.24%。菌絲體中粗蛋白含量測定結(jié)果表明，G6菌株菌絲體中粗蛋白含量最高達(dá)到21.44%，G20、G13菌株中粗蛋白含量稍高，其余的均相差不大。

圖2 不同菌株子實(shí)體、菌絲體粗蛋白含量Fig.2 Crude protein content from fruiting body and mycelium of different strains

3 小結(jié)

參試的13個灰樹花菌株中，G5菌株為胞內(nèi)多糖含量高，并且適宜子實(shí)體栽培應(yīng)用的灰樹花菌株；G6菌株為胞內(nèi)多糖含量高，并且適宜液體發(fā)酵培養(yǎng)菌絲體的灰樹花菌株；G7菌株為粗蛋白含量高，并且適宜子實(shí)體栽培應(yīng)用的灰樹花菌株；G6菌株為粗蛋白含量高，并且適宜液體發(fā)酵培養(yǎng)菌絲體的灰樹花菌株。

在今后的灰樹花育種工作中，可將多糖、粗蛋白含量作為品種品質(zhì)的衡量指標(biāo)，以期為深加工領(lǐng)域研發(fā)高附加值產(chǎn)品提供優(yōu)良菌株。

[1]楊楊，郭健，李長田.基于核糖體基因的灰樹花分子系統(tǒng)關(guān)系分析[J].中國食用菌，2016，35（6）：42-45.

[2]甘長飛.灰樹花的保健功效研究文獻(xiàn)綜述[C]//首屆中國食用菌養(yǎng)生研討會論文集.慶元：中國食用菌協(xié)會，2013：93-101.

[3]卜慶梅，倪艷波，黃清榮，等.灰樹花液體發(fā)酵培養(yǎng)基的篩選試驗(yàn)[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2003（6）：103-105.

[4]顧順明，孫曄，王潞江，等.發(fā)酵法生產(chǎn)灰樹花菌絲體的研究[J].工業(yè)微生物，2003，33（4）：1-4.

[5]孫正祥，王瑞霞.食用菌中生物活性蛋白的研究進(jìn)展[J].食用菌學(xué)報，2009，19（2）：85-90.

[6]陳寧，吳祖建，林奇英，等.灰花樹中一種抗煙草花葉病毒的蛋白純化及其性質(zhì)[J].生物化學(xué)與生物物理學(xué)報，2004，31（3）：283-286.